生产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物和使用其生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法

摘要

本发明涉及多肽，表达多肽的产O‑琥珀酰高丝氨酸的微生物，和使用其生产O‑琥珀酰高丝氨酸的方法，所述多肽对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸O‑琥珀酰转移酶活性。

权利要求

1.分离的多肽作为高丝氨酸琥珀酰转移酶用于生产O-琥珀酰高丝氨酸的用途，其中所述多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述的多肽的分离的多核苷酸用于生产O-琥珀酰高丝氨酸的用途，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO:2或3的核苷酸序列。

3.产O-琥珀酰高丝氨酸的埃希氏杆菌属某种微生物用于生产O-琥珀酰高丝氨酸的用途，其中所述微生物表达对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸琥珀酰转移酶活性的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

4.权利要求3所述的用途，其中所述埃希氏杆菌属某种微生物是大肠杆菌。

5.产O-琥珀酰高丝氨酸的埃希氏杆菌属某种微生物，其表达对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸琥珀酰转移酶活性的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且编码胱硫醚γ合成酶的metB基因被进一步缺失或减弱。

6.产O-琥珀酰高丝氨酸的埃希氏杆菌属某种微生物，其表达对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸琥珀酰转移酶活性的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且编码高丝氨酸激酶的thrB基因或编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的metA基因被进一步缺失或减弱。

7.生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法，包括：

(a)在培养基中培养产O-琥珀酰高丝氨酸的埃希氏杆菌属某种微生物，其表达对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸琥珀酰转移酶活性的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列；和(b)从所述微生物或所述培养基中获得O-琥珀酰高丝氨酸。

8.权利要求7所述的方法，其中所述埃希氏杆菌属某种微生物是大肠杆菌。

9.权利要求7所述的方法，其中编码胱硫醚γ合成酶的metB基因被进一步缺失或减弱。

10.权利要求7所述的方法，其中编码高丝氨酸激酶的thrB基因或编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的metA基因被进一步缺失或减弱。

说明书

生产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物和使用其生产O-琥珀酰高丝

氨酸的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及分离的多肽、表达该多肽的微生物和使用其生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法，所述分离的多肽对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性。

背景技术

[0002] 已知自然界中存在的大多数微生物利用O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰高丝氨酸作为中间体用于生物合成甲硫氨酸。一般而言，由将琥珀酰辅酶A的琥珀酰基缀合至高丝氨酸的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶(MetA)生产O-琥珀酰高丝氨酸，并且由将乙酰辅酶A的乙酰基缀合至高丝氨酸的高丝氨酸O-乙酰转移酶(MetX)生产O-乙酰高丝氨酸。即，在中间体间生产O-琥珀酰高丝氨酸中，metA在生产其的微生物的发育中是最重要的基因之一。同时，与MetA不同，MetX已知为没有被反馈抑制并且具有高的酶稳定性。

[0003] 当甲硫氨酸生物合成途径中的胱硫醚γ合成酶被阻断时，O-琥珀酰高丝氨酸被集聚，并且因此产O-琥珀酰高丝氨酸的菌株需要L-甲硫氨酸。因此，将甲硫氨酸加入到培养基中，并且高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的活性被加入到培养基中的甲硫氨酸抑制，并且最终，不能获得高浓度的O-琥珀酰高丝氨酸。

[0004] 因此，许多在先专利已经将它们的研究集中于从反馈控制系统解除(release)metA的反馈抑制。然而，由metA编码的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶具有以下问题：其野生型蛋白本身具有低的稳定性并且为了解除反馈抑制引入突变加剧不稳定性。因此，对于具有高生产力的产O-琥珀酰高丝氨酸的菌株的开发而言，去除metA基因的反馈抑制和稳固酶稳定性是必需的。

发明内容

[0005] [技术问题]

[0006] 为了解决上面描述的metA的反馈抑制的现象和酶不稳定性问题，本发明人已经努力开发了具有稳固的酶稳定性同时不受甲硫氨酸反馈抑制的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶，并且就这一点而言，已经筛选了具有活性的新型的酶。作为选择如此筛选的候选基因并在将它们引入埃希氏杆菌属(Escherichia)某种之后在烧瓶中培养的结果，本发明人已经发现了O-琥珀酰高丝氨酸的生产，并且发现了如此选择的基因具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性和对甲硫氨酸的反馈抑制的抗性，因此完成本发明。

[0007] [技术方案]

[0008] 本发明的目标是提供新型的分离的多肽，其对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性。

[0009] 本发明的另一目标是提供编码该新型的分离的多肽的多核苷酸。

[0010] 本发明的进一步的目标是提供生产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物，其表达该新型的分离的多肽。

[0011] 本发明的进一步的目标是提供使用上面的微生物生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法。

[0012] [发明的有益效果]

[0013] 生产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物——其包括新型的分离的多肽，该多肽对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性——可以对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且以高产量生产O-琥珀酰高丝氨酸，并且因此可以有效地用于以高产量生产L-甲硫氨酸，其使用O-琥珀酰高丝氨酸作为前体。

[0014] [实施本发明的最佳模式]

[0015] 为了实现上面的目标，在一方面，本发明提供了对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性的新型的分离的多肽。

[0016] 如本文所使用，术语“高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性”指的是将高丝氨酸转化为O-琥珀酰高丝氨酸的活性。

[0017] 如本文所使用，术语“反馈抑制”指的是高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的活性受甲硫氨酸的抑制。

[0018] 本发明的多肽的特征在于它具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，该氨基酸序列具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性并且对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性。与上述多肽具有80％或更多，特别地90％或更多，更特别地95％或更多，和甚至更特别地97％或更多的序列同源性的任何多肽也在本发明的范围内，只要如本发明中建议的，该多肽具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性并且对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性。同源性百分比可以使用BLAST 2.0——其是参考算法——测定，或者使用Pearson的FASTA测定[Methods Enzymol.,183,
63(1990)，下文]。基于BLAST算法，已经开发了称为BLASTN和BLASTX的程序
[www.ncbi.nlm.nih.gov，下文]。

[0019] 在另一方面，本发明提供了编码上述多肽的分离的多核苷酸。具体而言，多肽由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的多核苷酸序列编码，由于密码子简并性，与上述序列具有至少80％，特别地90％或更多，更特别地95％或更多，和甚至更特别地97％或更多的序列同源性的那些多核苷酸也在本发明的范围内，但是不限于此。

[0020] 在仍另一方面，本发明提供了以可操作方式包括该多核苷酸的载体。

[0021] 如本文所使用，术语“载体”指的是包括编码感兴趣的蛋白质的多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体，其中感兴趣的蛋白质可操作地连接至适合的调控序列，使得感兴趣的蛋白质可以在适合的宿主中表达。调控序列可以包括能够起始转录的启动子、用于调控转录的任何操纵基因序列、编码适合的mRNA核糖体结合结构域的序列和调控转录和翻译终止的序列。载体在转化入适合的宿主之后，可以独立于宿主基因组复制或起作用，或者可以整合入宿主基因组本身。

[0022] 本发明中使用的载体没有被具体地限制，只要载体在宿主中是可复制的，并且可以使用本领域中已知的任何载体。

[0023] 在仍另一方面，本发明提供了表达多肽的产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物，所述多肽对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性。

[0024] 如本文所使用，术语“产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物”可以指可以生产O-琥珀酰高丝氨酸并且在细胞内和细胞外储存它的微生物。

[0025] 生产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物包括原核和真核微生物菌株，例如，属于埃希氏杆菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗维登斯菌属(Providencia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和短杆菌属(Brevibacterium)的微生物菌株，但不限于此。具体而言，微生物可以是属于埃希氏杆菌属的微生物，例如，大肠杆菌(Escherichia coli)。

[0026] 可以使用生产L-赖氨酸、L-苏氨酸或L-异亮氨酸的微生物菌株，和特别地使用产L-苏氨酸的菌株制备产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物。由于产L-苏氨酸的菌株是能够合成L-苏氨酸和高丝氨酸作为O-琥珀酰高丝氨酸的前体的菌株，因此大量的甲硫氨酸前体，即O-琥珀酰高丝氨酸，可以使用该菌株合成。

[0027] 在本发明中，多肽的表达可以通过以可操作方式转化有包含编码该多肽的基因的重组载体或者通过将编码该多肽的多核苷酸插入染色体实现，但是方法不限于此。

[0028] 如本文所使用，术语“转化”指的是如此过程：将包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞，从而使得由多核苷酸编码的蛋白质在宿主细胞中表达。对于转化的多核苷酸而言，它是否插入宿主细胞的染色体并且位于其中或者位于染色体的外面是无所谓的，只要它在宿主细胞中能够表达。多核苷酸可以以任何形式插入，只要它能够被引入宿主细胞并在其中表达。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式引入宿主细胞，所述表达盒是包括自主表达所需要的所有必需元件的多核苷酸构建体。表达盒可以常规地包括可操作地连接至基因的开放阅读框(“ORF”，下文)的启动子、转录中止信号、核糖体结合结构域和翻译中止信号。

[0029] 本发明中使用的启动子可以不被具体地限制，只要它可以以高频率起始在宿主细胞中转录编码靶蛋白的多核苷酸，并且可以使用本领域中已知的任何启动子。特别地，可以使用T7启动子、trc启动子、tac启动子和cysK启动子(韩国专利号10-0966324)，但是不限于此。

[0030] 在本发明的示例性实施方式中，可以进一步缺失或减弱微生物中编码胱硫醚γ合成酶的metB基因。

[0031] 在本发明的示例性实施方式中，可以进一步缺失或减弱微生物中编码高丝氨酸激酶的thrB基因和编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的metA基因。

[0032] 在本发明中，基因的序列可以从数据库获得，比如美国国家生物技术信息中心(NCBI)。

[0033] 如本文所使用，术语“缺失”指的是在染色体内从对应于起始密码子的核苷酸序列到对应于终止密码子的核苷酸序列去除靶基因的核苷酸序列区域的一部分或全部的类型，或者去除其调控区域的核苷酸序列区域的一部分或全部的类型。

[0034] 如本文所使用，术语“减弱”指的是去除或降低微生物菌株中由对应的DNA编码的至少一种酶的细胞内活性。例如，可以通过修饰启动子区或基因的5’-UTR的核苷酸序列减弱蛋白质的表达，或者可以通过在对应基因的ORF区中引入突变来减弱蛋白质的活性。

[0035] 在另一方面，本发明提供了生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法，包括在培养基中培养上述微生物以生产O-琥珀酰高丝氨酸，和从微生物或培养基中获得O-琥珀酰高丝氨酸。

[0036] 培养上面制备的生产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物菌株可以根据本领域中已知的适合的培养基或培养条件进行。培养方法可以容易地由本领域普通技术人员根据待选择的菌株调节以便使用。特别地，培养可以是分批培养、连续培养和补料培养，但不限于此。例如，在参考文献(James  M.Lee,“Biochemical Engineering”,Prentice-Hall International Editions,pp 138-176)中公开了这些不同的培养方法。

[0037] 用于培养的培养基必须适当地满足具体菌株的要求。例如，参考文献(American Society for Bacteriology,“Manual of Methods for General Bacteriology”,Washington D.C.,USA,1981)中公开了用于不同微生物的培养基的实例。培养基可以包含各种碳源、氮源和痕量元素。培养基中包含的碳源的实例可以包括糖类，比如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；脂肪，比如豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，比如软脂酸、硬脂酸和亚油酸；醇类，比如甘油和乙醇；和有机酸，比如乙酸。这些碳源可以单独或组合使用。培养基中包含的氮源的实例可以包括有机氮源，比如蛋白胨、酵母提取物、肉汁(meat gravy)、麦芽提取物、玉米浆(CSL)和豆粉；和无机氮源，比如脲、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可以单独或组合使用。作为磷源，培养基可以包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和相应的含钠盐。另外，培养基可以包含金属，比如硫酸镁和硫酸铁。而且，可以包含氨基酸、维生素和适合的前体等。这些培养基或前体可以以分批培养或连续培养的形式加入到培养基中。

[0038] 另外，培养基的pH可以通过在培养期间以适合的方式加入化合物来调节，所述化合物比如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸。另外，在培养期间可以使用消泡剂比如脂肪酸聚乙二醇酯防止气泡形成。另外，可以将氧气或含有氧气的气体(例如空气)加入到培养基中以维持培养中的需氧条件。培养温度可以在20℃到45℃的范围内，并且特别地25℃到40℃的范围内。可以继续培养直到获得期望量的O-琥珀酰高丝氨酸产物，并且特别地持续
10小时到160小时。

[0039] 由本发明的方法生产的O-琥珀酰高丝氨酸可以通过胱硫醚γ合成酶或者O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶转化为甲硫氨酸。另外，通过将本发明的方法生产的O-琥珀酰-L-高丝氨酸与CH3SH反应，除了L-甲硫氨酸之外，还可以获得琥珀酸作为副产物。

[0040] 在仍另一方面，本发明涉及对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性的多肽的用途，其中该多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。本发明的新型的分离的多肽确认为对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且能够以高产量生产O-琥珀酰高丝氨酸，并且因此该多肽可用于生产O-琥珀酰高丝氨酸。

具体实施方式

[0041] 在下文中，将参照下面的实施例对本发明进行更详细地描述。但是这些实施例仅出于说明性的目的，并且本发明不意欲由这些实施例限制。

[0042] 实施例1：选择具有新型O-琥珀酰转移酶活性的多肽

[0043] 作为解除metA基因的反馈控制并且稳固其稳定性的方法，已经基于以下事实开发了源自青紫色素杆菌(Chromobacterium violaceum)的metX：metX基因(高丝氨酸O-乙酰转移酶)不受L-甲硫氨酸的反馈抑制，尽管metX基因与metA基因具有相似的结构。

[0044] 就此而言，为了开发新型的高丝氨酸O-乙酰转移酶，本发明人已经关于源自青紫色素杆菌的已经开发的metX的氨基酸序列进行了同源性分析，并且最终选择了具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽，解除了甲硫氨酸的反馈抑制。本发明人已经最新地确定了选择的多肽具有先前从未报道过的新的活性，虽然它是源自Sideroxydans lithotrophicus ES-1的metX。

[0045] 实施例2：质粒构建

[0046] 2-1合成源自Sideroxydans lithotrophicus ES-1的metX基因

[0047] 源自Sideroxydans lithotrophicus ES-1(sli)的metX基因(SEQ ID NO:3)基于NCBI数据库的metX基因序列(SEQ ID NO:2)(参考序列：YP_003522665.1)经由密码子优化过程合成，使得该基因可以在大肠杆菌中表达。

[0048] 2-2.构建表达源自Sideroxydans lithotrophicus ES-1的metX基因的质粒[0049] metX基因通过PCR使用SEQ ID NO:4和5的引物基于SEQ ID NO:3的合成的核苷酸序列扩增。SEQ ID NO:5的引物具有HindIII限制酶切位点。

[0050] SEQ ID NO:4)5’-ATC TTGAGTATTTCGGTTGGTATTG-3’

[0051] SEQ ID NO:5)5’-CCC AAGCTT ttaagcagctgattcccaagc-3’

[0052] PCR进行30个由在95℃下变性30s、在55℃下退火30s和在72℃下延伸1min组成的循环。PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中经历电泳，并且1.14kb带被洗脱、纯化，并用HindIII处理。将包含cysK启动子的pCL1920载体用EcoRV和HindIII处理，并且克隆所得到的限制酶切片段。作为克隆的结果获得的表达metX基因的质粒命名为“pCL-PcysK-metX(sli)”。

[0053] 实施例3：实验菌株的构建

[0054] 3-1.metB基因的缺失

[0055] 使野生型大肠杆菌(K12)W3110菌株中编码胱硫醚γ合成酶的metB基因缺失。为了缺失metB基因，进行FRT-一步-PCR缺失方法(PNAS(2000)vol 97:P 6640-6645)。为了缺失metB基因，通过PCR使用SEQ ID NO:6和7的引物，以及pKD3载体(PNAS(2000)vol 97:P 6640-6645)作为模板构建缺失盒。

[0056] SEQ ID NO:6)

[0057] 5’-TTACTCTGGTGCCTGACATTTCACCGACAAAGCCCAGGGAACTTCATCACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'

[0058] SEQ ID NO:7)

[0059] 5’-CGCTGCGCCAGCTCCATACGCGGCACCAGCGTTCGCAACCCACGTAGCAGCATATGAATATCCTCCTTAG-3’

[0060] PCR进行30个由在95℃下变性30s、在55℃下退火30s和在72℃下延伸1min组成的循环。PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中经历电泳，并且1.1kb带被洗脱和纯化。将回收的DNA片段电穿孔入大肠杆菌(K12)W3110菌株，其已经转化有pKD46载体(PNAS(2000)vol 97 P 6640-6645)。为了电穿孔，将转化有pKD46的W3110菌株在含有200μg/L的氨苄青霉素和5mM L-阿拉伯糖的LB培养基中在30℃下培养，直到OD600达到0.5，并用10％甘油洗涤3次以便使用。电穿孔在2500V下进行。回收的菌株平板接种在包含30μg/L氯霉素的LB平板培养基上，在37℃下培养1到2天，并且选择对氯霉素显示抗性的菌株。选择的菌株在上面描述的相同条件下使用SEQ ID NO:8和9的引物经历PCR，并且metB基因的缺失通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在基因的1.5kb带而确认。

[0061] SEQ ID NO:8)5’-TATTCGCCGCTCCATTCAGC-3’

[0062] SEQ ID NO:9)5’-TACCCCTTGTTTGCAGCCCG-3’

[0063] 如此确认的菌株转化有pCP20载体(PNAS(2000)vol 97 P 6640-6645)并且在含有100μg/L的氨苄青霉素的LB培养基中培养。具有减小大小的metB基因缺失的最终菌株——其在1.0％琼脂糖凝胶中确认——通过在相同的条件下进行PCR构建，并且确认了氯霉素标记物从菌株中去除。需要甲硫氨酸的如此构建的菌株命名为“CC03-0131”。

[0064] 3-2.thrB基因的缺失

[0065] 通过使编码高丝氨酸激酶的thrB基因缺失来尝试增加从高丝氨酸合成O-琥珀酰高丝氨酸的量。具体而言，因为高丝氨酸的利用活性是非常高的，使thrB基因缺失以使用产苏氨酸的菌株是必要的。上面构建的CC03-0131菌株中thrB基因的缺失通过FRT-一步-PCR缺失法进行。thrB缺失盒通过PCR使用SEQ ID NO:10和11的引物以及pKD3载体作为模板构建。

[0066] SEQ ID NO:10)

[0067] 5’-CATGGTTAAAGTTTATGCCCCGGCTTCCAGTGCCAATATGAGCGT CGGGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’

[0068] SEQ ID NO:11)

[0069] 5’-GGAGATACCGCTCGCTACCGCGCCGATTTCCGCGACCGCCTGCC GCGCCTCATATGAATATCCTCCTTAG-3’

[0070] PCR进行30个由在95℃下变性30s、在55℃下退火30s和在72℃下延伸1min组成的循环。PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中经历电泳，并且1.1kb带被洗脱和纯化。将回收的DNA片段电穿孔入CC03-0131菌株，其已经被转化有pKD46载体。为了电穿孔，将转化有pKD46的CC03-0131菌株在包含200μg/L的氨苄青霉素和5mM L-阿拉伯糖的LB培养基中在30℃下培养，直到OD600达到0.5，并用10％甘油洗涤3次以便使用。电穿孔在2500V下进行。回收的菌株平板接种在包含30μg/L氯霉素的LB平板培养基上，在37℃下培养1到2天，并且选择对氯霉素显示抗性的菌株。

[0071] 选择的菌株在上面描述的相同条件下使用SEQ ID NO:12和13的引物经历PCR，并且thrB基因的缺失通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在基因的1.5kb带而确认。

[0072] SEQ ID NO:12)5’-ACTCGACGATCTCTTTGCC-3’

[0073] SEQ ID NO:13)5’-ACGCCGAGAGGATCTTCGCAG-3’

[0074] 如此确认的菌株转化有pCP20载体并且在含有100μg/L的氨苄青霉素的LB培养基中培养。具有减小大小的thrB基因缺失的最终菌株——其在1.0％琼脂糖凝胶中确认——通过在相同的条件下进行PCR构建，并且确认了氯霉素标记物从菌株中去除。如此构建的菌株命名为“CC03-0131-2”。

[0075] 3-3.metA基因的缺失

[0076] 为了在大肠杆菌菌株中表征底物特异性源自Sideroxydans lithotrophicus ES-1的metX基因的活性，基于CC03-0131-2菌株使染色体上的原始metA基因缺失，CC03-0131-2菌株是metB和thrB基因缺失的大肠杆菌(K12)W3110菌株。通过FRT-一步-PCR缺失方法使metA基因缺失。通过PCR使用SEQ ID NO:14和15的引物以及pKD3载体作为模板构建metA缺失盒。

[0077] SEQ ID NO:14)

[0078] 5’-TCAGCTGTTGCGCATCGATTCCCGTGAATCGCGCAACACGCCCGC AGAGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’

[0079] SEQ ID NO:15)

[0080] 5’-CCGTCACAAAGGCAATGCGCTTATCTTTACTGGCAAACAGATATG CATCCCATATGAATATCCTCCTTAG-3’

[0081] PCR进行30个由在95℃下变性30s、在55℃下退火30s和在72℃下延伸1min组成的循环。PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中经历电泳，并且1.1kb带被洗脱和纯化。将回收的DNA片段电穿孔入CC03-0131-2菌株，其已经转化有pKD46载体。为了电穿孔，将转化有pKD46的CC03-0131-2菌株在包含200μg/L的氨苄青霉素和5mM阿拉伯糖的LB培养基中在30℃下培养，直到OD600达到0.5，并用10％甘油洗涤3次以便使用。电穿孔在2500V下进行。回收的菌株平板接种在包含30μg/L氯霉素的LB平板培养基上，在37℃下培养1到2天，并且选择对氯霉素显示抗性的菌株。

[0082] 选择的菌株在与上面描述的相同条件下使用SEQ ID NO:16和17的引物经历PCR，并且metA基因的缺失通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在基因的1.5kb带而确认。

[0083] SEQ ID NO:16)5’-CTCATTAACGTTGGTTGTCA-3’

[0084] SEQ ID NO:17)5’-TATCTTGCTGCTGCTGAATG-3’

[0085] 如此确认的菌株转化有pCP20载体并且在含有100μg/L的氨苄青霉素的LB培养基中培养。具有减小大小的metA基因缺失的最终菌株——其在1.0％琼脂糖凝胶中确认——通过在相同的条件下进行PCR构建，并且确认了氯霉素标记物从菌株中去除。如此构建的菌株命名为“CC03-0132”。

[0086] 3-4.构建引入有表达源自Sideroxydans lithotrophicus ES-1的metX基因的质粒的菌株

[0087] 为了表征底物特异性的和源自Sideroxydans lithotrophicus ES-1的metX基因的活性，使CC03-0132菌株引入有实施例2中构建的质粒pCL-PcysK-metX(sli)，CC03-0132菌株是metB、thrB和metA基因缺失的大肠杆菌(K12)W3110菌株。

[0088] 引入有pCL-PcysK-metX(sli)的CC03-0132菌株命名为“CC03-0136”并且在2013年6月10日以登录号KCCM11424P保藏于由布达佩斯条约认可的国际保藏机构——韩国微生物保藏中心(KCCM)，所述韩国微生物保藏中心位于韩国首尔的361-221,Hongje-1-dong,Seodaemun-gu，是韩国培养物保藏协会(Korean Federation of Culture Collection)(KFCC)的子公司。

[0089] 通过引入质粒pCL-PcysK-metA构建菌株，其以与实施例2中相同的方式构建——除了使用CC03-0132菌株中的野生型metA作为对照组。如此构建的菌株命名为“CC03-0132/pCL-PcysK-metA”。

[0090] 另外，使用产苏氨酸菌株CJM002以与实施例3-1和3-3中相同的方式构建菌株，并且如此构建的菌株命名为“CJM-BTA”，所述产苏氨酸菌株CJM002经由人工突变使用NTG基于产L-苏氨酸菌株TF4076(登录号：KFCC-10718)解除甲硫氨酸需要(登录号：KCCM-10568)，所述产L-苏氨酸菌株TF4076是韩国专利号10-0905381中公开的需要甲硫氨酸的菌株。

[0091] 基于CJM-BTA菌株，将如上面所描述的质粒pCL-PcysK-metX(sli)和pCL-PcysK-metA引入，并且如此构建的菌株分别命名为“CJM-BTA/pCL-PcysK-metX(sli)”和“CJM-BTA/pCL-PcysK-metA”。

[0092] 实施例4：使用菌株生产O-琥珀酰高丝氨酸

[0093] 4-1.烧瓶培养实验

[0094] 为了表征底物特异性和源自Sideroxydans lithotrophicus ES-1的metX基因的活性——被引入在实施例3中构建的菌株，进行锥形瓶培养。该烧瓶中的组合物在下面的表1中显示。

[0095] [表1]

[0096]

[0097] 将CC03-0132菌株和CJM-BTA菌株接种入LB平板培养基中作为对照组。将CC03-0136菌株(转化有metX表达载体)、CC03-0132/pCL-PcysK-metA菌株(转化有使用相同的载体制备的metX表达载体)、和两种其它菌株CJM-BTA/pCL-PcysK-metX(sli)和CJM-BTA/pCL-PcysK-metA(分别转化有基于CJM-BTA菌株的metX表达载体或metA表达载体)接种入含有壮观霉素的LB平板培养基中，在33℃下培养过夜。然后，将单菌落接种入含有壮观霉素的2mL的LB33℃下培养2小时，再次接种入含有的25mL烧瓶培养基的250mL锥形瓶中至OD600下的吸光度为0.07，在33℃下以200rpm的速率培养48小时，并经由HPLC分析比较O-琥珀酰高丝氨酸生产的量。结果在下面的表2中显示。

[0098] [表2]

[0099]

[0100] 结果，确认了源自Sideroxydans lithotrophicus ES-1的metX基因，与大肠杆菌的metA基因的情况相同，使用琥珀酰-辅酶A作为底物产生了O-琥珀酰高丝氨酸但是没有产生O-乙酰高丝氨酸。当源自Sideroxydans lithotrophicus ES-1的metX基因被引入时，甚至利用没有引入任何修饰的野生型自身，加入到培养基的甲硫氨酸的反馈抑制没有出现。

[0101] 本领域普通技术人员将认识到，本发明可以以其它具体的形式体现而不背离其精神或基本特征。描述的实施方式在所有方面都仅被视为说明性而不是限制性的。因此，本发明的范围由所附权利要求书而不是由上面的描述指示。在权利要求书的等价意义和范围内的所有的变化都包括在本发明的范围内。

[0102]