一种苯酚茶酸素及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种苯酚茶酸素及其制备方法和应用；将五毫摩尔二氢杨梅素加入到20毫升甲醇溶解30分钟，将溶解的溶液放置入冰槽，将5.5毫摩尔的哌啶，在‑10℃的氩气存在下滴定入二氢杨梅素甲醇液，放置20分钟使其反应完全，然后在抽真空，以减少空气压力20％下浓缩反应液，过滤后，用甲醇洗三遍即可获得苯酚茶酸素；可用于阿尔茨海默氏症痴呆症及其它神经/神经系统进行性退化病变的治疗药物；苯酚茶酸素是有效的预防和治疗阿尔茨海默氏痴呆症的有潜力的化合物；能够有效改善焦虑症，认知障碍，睡眠障碍，由于各种原因引起或出现的认知，学习/记忆能力的其他形式的功能减退症状；其结构式如下：

权利要求

1.一种苯酚茶酸素的应用，其特征在于：

所述的苯酚茶酸素其结构式为：

所述的苯酚茶酸素的制备方法为：

将五毫摩尔二氢杨梅素加入到20毫升甲醇溶解30分钟，将溶解的溶液放置入冰槽，将

5.5毫摩尔的哌啶，在-10℃的氩气存在下滴定入二氢杨梅素甲醇液，放置20分钟使其反应完全，然后在抽真空，以减少空气压力20％下浓缩反应液，过滤后，用甲醇洗三遍即可获得苯酚茶酸素；

所述的苯酚茶酸素的应用：用于阿尔茨海默氏症痴呆症及其神经/神经系统进行性退化病变的治疗药物。

2.根据权利要求1所述的苯酚茶酸素的应用，其特征在于：用于阿尔茨海默氏症痴呆症及其神经/神经系统进行性退化病变的治疗药物，用于治疗的一次有效量为0.1-1000毫克/公斤体重，每天早晚或早中晚饭后给药。

3.根据权利要求1所述的苯酚茶酸素的应用，其特征在于：用于阿尔茨海默氏症痴呆症及其神经/神经系统进行性退化病变的治疗药物，用于治疗的一次有效量为0.5-500毫克/公斤体重。

4.根据权利要求1所述的苯酚茶酸素的应用，其特征在于：用于阿尔茨海默氏症痴呆症及其神经/神经系统进行性退化病变的治疗药物，用于治疗的一次有效量为0.5-10毫克/公斤体重。

5.根据权利要求1所述的苯酚茶酸素的应用，其特征在于：用于阿尔茨海默氏症痴呆症及其神经/神经系统进行性退化病变的治疗药物，用于治疗的一次有效量为0.5-5毫克/公斤体重。

说明书

一种苯酚茶酸素及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种苯酚茶酸素及其制备方法，可用于阿尔茨海默氏症(也阿尔茨海默症)痴呆症及其它神经/神经系统进行性退化病变的治疗药物。

背景技术

[0002] 目前全世界有3600万人生活在阿尔茨海默氏症的痛苦当中。世界上有九分之一年龄在65岁以上的人有痴呆症状，在2013年，与阿尔茨海默痴呆症有关的社会经济负担超过二万二千亿美金，阿尔茨海默痴呆症是最常见的痴呆症，占总的痴呆症的50％至75％，随着年龄的增加比例也增加。根据世界卫生组织2013报告，全世界有超过25％-50％的85岁老人患阿尔茨海默痴呆症。人超过60岁，老年痴呆症(主要含阿尔茨海默氏症)在低/中收入地区的人数是高收入地区的两倍。这些阿尔茨海默痴呆症目前在世界上所构成的社会负担的经济成本超过每年两千零四亿美金。在高收入国家，非正式护理(45％)和正式的社会护理(40％)占大多数的成本，而直接医疗费用占(15％)，主要是由于没有有效的药物。在低收入和中等偏低收入国家，患有老年痴呆症是得不到护理的，老年痴呆症患者是没有希望的，而且无法生存。中国人口占世界总人口的四分之一，是一个中等收入国家。是继美国之后的第二大老龄化国家。因此，整个中国需要抗阿尔茨海默氏症/老年痴呆症的产品是当务之急。世界卫生组织报告说，到2050年，阿尔茨海默痴呆症人数的增长将是现在的双倍。在低/中收入国家有71％的65岁以上的人将会生活在阿尔茨海默氏症痛苦中。此外，痴呆症研究小组对拉丁美洲，亚洲和加勒比海的20个低或中等收入国家的衰老状况的研究表明，有三分之二的痴呆症病例发生在这些发展中国家，但目前的数据只有10％是在这些国家和地区产生的。事实上在低收入国家中，估计有更高的老年痴呆症的发生率。根据美国疾病控制中心(2013)的报告，相比于糖尿病，癌症，心脏病和中风的死亡率的下降，阿尔茨海默痴呆症的死亡率却显著增加，原因是由于缺乏有效的药物治疗。因此，阿尔茨海默痴呆症目前被认定为“世纪疾病”。低收入国家更为需要阿尔茨海默痴呆症的药物。世界各国已经组织研究，为能找到一种可对抗阿尔茨海默痴呆症治疗方法。截至2012年，超过1000个单位组织的临床试验已经或正在开展，以寻找方法来治疗阿尔茨海默痴呆症，但结果是不理想的和未知的。
到目前为止，现有的治疗方法只能暂时改善症状，但都不能逆转疾病的进展和预防阿尔茨海默痴呆症的发生。最近的研究发现，各种对抗阿尔茨海默痴呆症药物的开发主要集中在减少过度的β淀粉状蛋白沉淀(Aβ)，而降低β淀粉状蛋白沉淀的治疗的临床实验都失败了。
这说明了过度的β淀粉状蛋白沉淀只是阿尔茨海默痴呆症的病理改变中的一种现象，它不是产生、治疗效果的关键靶点。而导致阿尔茨海默痴呆症进展的机理还是未知的。“β淀粉状蛋白沉淀”是阿尔茨海默痴呆症发病原因或仅仅是阿尔茨海默痴呆症的一个副产品是不清楚的。

[0003] 除了过度的β淀粉状蛋白沉淀的发病理论之外，乙酰胆碱理论，钙代谢理论，过氧化理论等及与其相关的药物使用，都没有得到临床认可的结果。中利凡斯的明，胆碱酯酶抑制剂，和伐尼克兰的烟碱型乙酰胆碱受体α4β2亚型，在阿尔茨海默痴呆症患者的给药研究中与安慰剂相比，给药患者的日常活动和认知能力表现有轻度改善或无改善。在美金刚的安全性的系统评价中，试用美金刚去治疗阿尔茨海默痴呆症的轻度认知功能障碍，但结果显示和安慰剂比较，美金刚并没有改善患者的轻度认知功能障碍和认知功能，而且它会有增加胃肠道损害的风险。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种苯酚茶酸素及其制备方法，用于阿尔茨海默氏症(也阿尔茨海默症)痴呆症及其它神经/神经系统进行性退化病变的治疗药物。

[0005] 本发明所述的苯酚茶酸素(PDTOP)，是合成出来的黄酮类化合物。又名苯酚二氢黄酮醇，英文：piperidinium2，3-dihydroxy-5-((2R，3R)-3，5，7-trihydroxy-4-oxochroman-2-yl)phendate)

[0006]

[0007] 本发明所述的苯酚茶酸素的制备方法：

[0008] 将五毫摩尔(5mmol，1.6g)二氢杨梅素加入到20毫升甲醇溶解30分钟，将溶解的溶液放置入冰槽，用5.5毫摩尔的哌啶，在-10℃的氩气存在下滴定入二氢

[0009]

[0010] 杨梅素甲醇液，放置20分钟使其反应完全，然后，在低压真空情况下浓缩反应液，过滤后，用甲醇洗三遍即可获得苯酚茶酸素(～2g)。

[0011] 二氢杨梅素的制备方法：

[0012] 紫杉叶素二氢橡黄素在黄酮羟化酶和黄酮单氧化酶存在下常温反应，成为二氢杨梅素。

[0013] 苯酚茶酸素的制备：

[0014]

[0015] 二氢杨梅素属黄酮类化合物，存在于许多植物的花、叶、果实中，多以苷的形式存在，如芦丁(芸香苷)，槲皮苷，金丝桃苷等。

[0016] 二氢杨梅素的来源可以是从枳具子，藤茶，杜鹃科花类，和松类叶/籽的自然产物中提取，也可以是合成。两种方法在中国已经形成大规模生产模式。但是由于对光照的易感性和溶解度低的特点，使得二氢杨梅素在使用上受到了局限，药用效果也会存在不稳定。

[0017] 阿尔茨海默氏痴呆症(AD)是神经进行性退化疾病变，阿尔茨海默症的病患除了认知/学习能力减退，精神神经症状，如焦虑和癫痫发作都分别在阿尔茨海默痴呆症患者中看到高达70％和17％，这表明中枢抑制神经—伽马氨基丁酸(GABARs)神经间的传递功能障碍，而且这也是伽马氨基丁酸参与阿尔茨海默痴呆症的发病的机制的证据。苯酚茶酸素是一种合成的苯酚黄酮物，是伽马氨基丁酸的调节剂。苯酚茶酸素的效果和目前二氢杨梅素和临床上使用的美金刚(30毫克/公斤/天)的效果进行比较，对阿尔茨海默氏痴呆症的基因改造(Tg2576)四月龄小鼠给与苯酚茶酸素(0.5毫克/公斤/天)3个月口服治疗。这种阿尔茨海默氏痴呆症样病变小鼠已经被证明，在成年(6月龄)以后，会逐渐产生阿尔茨海默氏痴呆症具有的脑神经内β淀粉状蛋白沉淀(Aβ)，认知能力和学习能力障碍等阿尔茨海默氏痴呆症样病理生理改变。开始给药以后每月进行一次测试，以随时观察苯酚茶酸素对阿尔茨海默氏痴呆症发病的预防和治疗作用。比较与二氢杨梅素，行为实验观察结果显示，苯酚茶酸素给药的小鼠在有阿尔茨海默氏痴呆症的基因改造的情况下没有出现明显的认知能力改变，没有出现焦虑增加和癫痫发作的易感性。病理上，苯酚茶酸素明显的降低脑神经内β淀粉状蛋白沉淀。从阿尔茨海默氏痴呆症小鼠(8月龄)海马齿状回神经元的电生理(膜片钳)记录显示，伽马氨基丁酸介导的抑制性突触后自然电流释放(mIPSC)的频率和振幅减少，突触间维持抑制电流(synaptic tonic current)降低。而苯酚茶酸素的服用，阿尔茨海默氏痴呆症鼠海马齿状回神经元上的伽马氨基丁酸-介导的电流有效的得到恢复。定量分析显示，神经受体支撑蛋白(gephyrin)，也是调节伽马氨基丁酸受体突触形成和伽马氨基丁酸受体突触后可塑性的锚定蛋白，在阿尔茨海默氏痴呆症鼠脑内，支撑蛋白降低至50％以下，特别是海马和皮层。苯酚茶酸素的治疗有效的恢复支撑蛋白gephyrin水平。并且，经过苯酚茶酸素的给与，脑神经内β淀粉状蛋白沉淀明显减少。这些结果表明，苯酚茶酸素的给与不仅可以改善技艺和认知能力损伤，缓解忧郁，逆转阿尔茨海默氏痴呆症的病理改变包括减少增加了的β淀粉状蛋白沉淀，及停止或逆转渐进的神经病理变化，恢复gephyrin水平，及恢复伽马氨基丁酸系统的传输和功能性。更重要的是，苯酚茶酸素可以对有潜在阿尔茨海默氏痴呆症基因改变的生物体有预防作用。此项发明证明，苯酚茶酸素的作用靶点是神经系统内起连结和修复作用的蛋白质如gephyrin。苯酚茶酸素是一种很有潜力和前途的治疗阿尔茨海默氏痴呆症的候选药物。

[0018] 迄今为止，对阿尔茨海默氏病发病机理的研究具有建模的困难限制，不可能进行人体试验。转基因小鼠模型是经过技术改造，具有β淀粉状蛋白沉淀及携带一个或几个突变的家族性阿尔茨海默病基因的过度表达而产生的。虽然这些模型不能完全复制人类的阿尔茨海默氏病，但是已经获得科学界认可，它们可以提供有价值的对于给出阿尔茨海默氏痴呆症的发病机制的证据，以及进行药物开发的测试以检测药物的治疗效果。

[0019] 人的研究表明，认知/记忆和学习能力的丧失，伴有精神神经症状，如焦虑和癫痫等，在阿尔茨海默痴呆症患者中分别高达70％和17％。这提示伽马氨基丁酸能传输的功能障碍。伽马氨基丁酸是至关重要的参与调节必要的正常认知功能的神经传导物质。其伽马氨基丁酸突触的损失，和异常的伽马氨基丁酸突触活动导致阿尔茨海默痴呆症患者的认知缺陷有关。然而，发病机制尚不清楚。

[0020] Gephyrin是抑制性突触后的关键的支撑蛋白。Gephyrin是一种多聚体支架蛋白，功能为引导伽马氨基丁酸受体在神经突触后形成簇状抑制位点，并锚固伽马氨基丁酸受体在突触后膜的位置。Gephyrin基因去除和去除实验表明伽马氨基丁酸在突触后膜聚集减少，伴随伽马氨基丁酸突触间传导障碍。因此，正常质量和数量的gephyrin对维持伽马氨基丁酸突触间传导的功能是至关重要的。然而，虽然有报告指出gephyrin在阿尔茨海默痴呆症有减少，但是其发病机制及病理作用尚不清楚。

[0021] 二氢杨梅素的合成方法已经是成熟并且是多种多样的技术存在于原料供应业。但是不论是天然提取的或是合成的二氢杨梅素都具有对光照和高温的易感性，具有光照后降低成分易分解，不宜长期保存。作为药用，效果会降低；另外二氢杨梅素的水溶性较低等问题的存在，使制药剂型受到局限。合成苯酚茶酸素，不仅可以大大提高作为药用的二氢杨梅素成分的稳定性，而且可以显著提高作为药用的效力功效。本发明不仅局限于二氢杨梅素，对其它具有相同结构的黄酮类化合物有适用性。根据不同黄酮类化合物的特性合成出稳定，高效的二氢杨梅素，二氢杨梅素可以是合成也可以是从藤茶中提取。两种方法在中国已经形成大规模生产模式。但是由于对光照的易感性和不稳定性，使得二氢杨梅素在使用中功力功效上受到了局限，药用效果也不稳定。此发明具有使二氢杨梅素原有结构稳定性增加，同时作为药用的效力功效比二氢杨梅素本身可以提高至少五倍以上。由此方法，可以开拓二氢杨梅素作为药用的使用前景。

[0022] 本发明所述的苯酚茶酸素用于阿尔茨海默氏症痴呆症及其神经/神经系统进行性退化病变的治疗药物，用于治疗的有效量为0.1-1000毫克/公斤体重，优选0.5-500毫克/公斤体重，更优选为约0.5-10毫克/公斤体重，最优选约0.5-5毫克/公斤体重(受试者)。

[0023] 为能够对本发明进一步理解，参照附图，其中：

[0024] 1)苯酚茶酸素在4月龄转基因(Tg2576)阿尔茨海默痴呆症小鼠模型给药三个月后，提高探索/运动能力，降低焦虑程度和抽搐发作的敏感性(图3)。

[0025] 我们对阿尔茨海默痴呆症小鼠与年龄匹配的野生型小鼠比较，给与苯酚茶酸素三个月后，测试对阿尔茨海默痴呆症的行为变化影响。小鼠分为三组：(1)野生型(重量)的雄性小鼠(2％蔗糖，口服给药)，(2)的阿尔茨海默痴呆症小鼠(2％蔗糖，口服给药)，和(3)的阿尔茨海默痴呆症加苯酚茶酸素(PDTOP苯酚茶酸素0.5毫克/kg的2％蔗糖)中，分别为。3个月治疗后，小鼠进行了检查与行为分析。

[0026] 运动活性测定。运动距离作为量化运动活性(图1A)的参数之一。对照小鼠跑了891±59厘米/5分钟。阿尔茨海默痴呆症小鼠跑的距离275±12厘米/5分钟，而给与苯酚茶酸素治疗的阿尔茨海默痴呆症小鼠的跑动距离提高到609±101厘米/5分钟。对照小鼠显示出频繁探索行为(22.5±3.4次)，探讨了开放区的中心2.0±0.6次，停留在中心为0.1±0.1分钟(图1B，图1C和图1D)。阿尔茨海默痴呆症小鼠表现探索行为12.7±2.3次，探索开放领域(0.2±0.1次)的中心，停留在中心为仅0.02±0.01分钟。苯酚茶酸素治疗阿尔茨海默痴呆症小鼠增加探索行为(18.1±2.0次)，探索开放领域(1.3±2.0次)，停留在中心时间为0.12±0.03分。结果表明，阿尔茨海默痴呆症鼠模型中减少了探索/自主活动，探索能力降低。每日口服苯酚茶酸素，使4月龄转基因阿尔茨海默痴呆症小鼠没有进一步发展为阿尔茨海默痴呆症，保持了自主活动，探索活动能力。

[0027] 焦虑进行测定的高架十字迷宫(图三E)。对照组在封闭区的时间是48.5±7.5％和32.6±3.2％。在痴呆小鼠显著缩短明室区停留时间，而在暗室区停留时间明显加长。痴呆+苯酚茶酸素小鼠花费的时间和对照组相同。

[0028] 阿尔茨海默痴呆症鼠模型中减少了探索/自主活动，探索能力降低。每日口服苯酚茶酸素治疗阿尔茨海默痴呆症小鼠提高自主活动，提高探索活动能力。

[0029] 焦虑进行测定的高架十字迷宫(图1E)。对照组在封闭区的时间是48.5±7.5％和32.6±3.2％。在痴呆小鼠显著缩短明室区停留时间，而在暗室区停留时间明显加长。痴呆+PDTOP小鼠花费的时间和对照组相同。

[0030] 抽搐惊厥发作的易感性检测中用戊四氮(Pentylenetetrazol，PTZ)诱发抽搐惊厥。图2F示意抽搐惊厥发作持续时间。对照组的PTZ诱导抽搐发作持续时间是1.5±0.6分钟，在阿尔茨海默痴呆症组，PTZ诱导抽搐发作持续时间是5.0±0.8分钟。痴呆+苯酚茶酸素的PTZ诱导抽搐发作持续时间是2.0±0.5分钟。这些结果表明，在没有给苯酚茶酸素的4月龄转基因阿尔茨海默痴呆症小鼠随着年龄的增长，发展成了阿尔茨海默痴呆症，显示出行为缺陷，不安及高发抽搐的易感性。而给苯酚茶酸素三个月，预防了阿尔茨海默痴呆症的发病，没有显示出中枢抑制神经—伽马氨基丁酸受体系统的发育障碍，没有出现抽搐惊厥症状。

[0031] 2)苯酚茶酸素的口服显著改善阿尔茨海默症动物模型的识别及情境学习与记忆能力(图2)

[0032] 小鼠随机分成4组：(1)野生型(对照)雄性小鼠用2％蔗糖的口服给药的治疗；(2)野生型(给药对照)的雄性小鼠中加0.5毫克/千克苯酚茶酸素在2％蔗糖的口服给药，每天给药一次；(3)阿尔茨海默症痴呆小鼠，用2％蔗糖的口服给药，每天给药一次；和(4)的阿尔茨海默症痴呆小鼠在2％蔗糖加苯酚茶酸素0.5毫克/千克体重，每天给药一次；(5)的痴呆小鼠在2％蔗糖加二氢杨梅素2毫克/千克体重，，每天给药一次；及阿尔茨海默症痴呆小鼠给30毫克/千克体重的美金刚口服给药，每天给药一次。经过三个月的治疗，小鼠的认知记忆，用新物体识别进行测试和(图2A)评价。野生型对照组用于探索新的对象的时间(ORI＝68.9±6.8％)。在阿尔茨海默症痴呆小鼠降低至51.2±3.6％。苯酚茶酸素处理的野生型小鼠表现的识别能力相同于野生型对照组。在阿尔茨海默痴呆症+苯酚茶酸素(PDTOP)小鼠显著提高新物体识别能力(ORI＝67.8±6.6％)。虽然和阿尔茨海默痴呆症+二氢杨梅素(DHM)小鼠显著提高新物体识别能力没有有意显著差异，但是PDTOP给药组的认知能力的恢复更显著。美金刚治疗的阿尔茨海默痴呆症小鼠与相同年龄对照组阿尔茨海默痴呆症小鼠显示没有认知改善，但与相同年龄的对照组比较没有显著效果。

[0033] 接着，我们评估了连续性对新型物识别能力测试(图2B)。与野生型对照组相比，阿尔茨海默痴呆症小鼠表现出RI的降低(42.2±2.6％)。苯酚茶酸素的治疗逆转了阿尔茨海默痴呆症小鼠的RI的降低，并显示出显著的情景记忆改善。而美金刚治疗的阿尔茨海默痴呆症小鼠在与同年龄的阿尔茨海默痴呆症小鼠比较显示出认知能力的改善，但和野生型对照组相比没有显著效果。

[0034] 计算方法：对象识别指数(ORI)及识别指数(RI)进行计算(ORI)根据下式；指数＝(TN-TF/(TN+TF)，其中，TF和TN代表探索熟悉的对象或背景(TF次)和新物体或上下文(TN)。统计分析试验用单向ANOVA和Tukey检验。

[0035] 这组实验结果显示：

[0036] I)苯酚茶酸素(PDTOP)0.5毫克/千克给药和二氢杨梅素(DHM)2毫克/千克给药的效果比较，可以产生更强的预防4月龄转基因阿尔茨海默痴呆症小鼠没有进一步发展为阿尔茨海默痴呆症的功效。

[0037] II)苯酚茶酸素(PDTOP)0.5毫克/千克给药可以预防4月龄转基因阿尔茨海默痴呆症小鼠没有进一步发展为阿尔茨海默痴呆症，不出现知能力降低。而且具有逆转认知能力的降低的作用。

[0038] 3)苯酚茶酸素在阿尔茨海默痴呆症小鼠显著降低Aβ斑块在海马回的累积(图3)。

[0039] 研究证明，β淀粉状蛋白沉淀在阿尔茨海默痴呆症小鼠模型中包括β淀粉状蛋白沉淀斑块存在逐步积累。苯酚茶酸素3个月口服治疗后，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，在人类受GFAP基因所编码的蛋白质。GFAP的表达在中枢神经系统中被统称为星形胶质细胞星形胶质细胞中，有特征性星形胶质细胞的脑和脊髓。它参与了许多重要的中枢神经系统过程，包括细胞通讯和血脑屏障的功能。

[0040] GFAP涉及β淀粉状蛋白沉淀斑块在阿尔茨海默氏症的海马回的累积。因此，我们使用免疫测定法来确定阿尔茨海默氏症的动物中GFAP的变化(图3)。对照组(野生型，蔗糖治疗)，阿尔茨海默痴呆症(AD)(蔗糖治疗)，以及阿尔茨海默痴呆症接受PDTOP治疗组(AD+PDTOP 0.5mg/kg)，雄性，4个月大的年龄的小鼠。每日口服给药三个月。三个月后，所有动物的大脑取出进行GFAP检测。

[0041] 图3A-C显示GFAP的免疫反应性在从三组海马的切片。我们分析了多态层(PL)的密度。与对照组(图3A)相比，PL密度在AD组(图3B)显著增加。另外，图3B显示增加Aβ斑块(如箭头指向)。而苯酚茶酸素(PDTOP)治疗后，相对密度(ROD)降低，既Aβ斑块在AD+PDTOP组减少(图3C)。图3D示出了相对密度的结果。这说明水化茶酸素能降低Aβ斑块起到“清道夫的作用”。

[0042] 图3E-G显示可溶性和不溶性Aβ1-40和Aβ1-42的阿尔茨海默氏症小鼠在全脑内的水平用ELISA法测定。图3E和图3F示皮质β淀粉状蛋白沉淀的水平测定法。苯酚茶酸素治疗减少水溶性Aβ1-42(89.2±7.8与143.1±24.1未治疗的阿尔茨海默氏症小鼠)和不溶性Aβ1-42(209.1±55.0与453.6±147.3未治疗的阿尔茨海默氏症小鼠)。海马Aβ水平测定(图
3G)，苯酚茶酸素治疗减少水溶性Aβ1-40(830.3±27.4与1150.0±191.8)和不溶性Aβ1-40(4095.3±1079.4与6729.6±1620)的水平。

[0043] 这个结果表明，每日口服苯酚茶酸素可以预防4月龄转基因阿尔茨海默痴呆症小鼠没有进一步发展为阿尔茨海默痴呆症，预防Aβ1-40和Aβ1-42产生的可能。

[0044] 4)苯酚茶酸素可以降低过度的谷氨酸释放引起的神经毒反应(图4)。

[0045] 在海马长记忆依赖于谷氨酸受体(NMDA受体)。谷氨酸受体是钙离子通透性的受体。过度激活谷氨酸释受体会产生过多的钙离子内流，从而诱发阿尔茨海默痴呆症的各种病理变化。Aβ肽可结合和激活谷氨酸受体。在这项研究中，我们测试了过多的谷氨酸释放使用电生理记录技术记录水化茶酸素在海马的效果。

[0046] 大鼠在异氟烷麻醉下，手术线被保留在大鼠颈动脉的两侧下。经过两个天痊愈，大鼠被拉线10分钟，造成短瞬脑缺血，即刻将头外皮肤层关闭。图4显示苯酚茶酸素可以剂量依赖性地减少过多的谷氨酸释放。海马神经元全细胞电压钳制在-70mV。图4A显示了从海马齿状回神经元的记录。苯酚茶酸素灌流(0→0.01→0.03→0.1微摩尔)产生剂量依赖性地和显著降低mEPSC振幅(图4B)，频率(图4E)和总电荷转移(图4F)，而苯酚茶酸素并不影响从对照组大鼠神经元活动(图4C-D)。

[0047] 这说明，苯酚茶酸素可以降低脑神经损伤后发生的过度的谷氨酸释放引起的神经毒反应，从而起到保护脑神经的作用。而且能够起到抑制神经毒反应的苯酚茶酸素用量也比我们过去发表的二氢杨梅素用量降低了30倍。

[0048] 5)苯酚茶酸素的治疗可以修复阿尔茨海默症小鼠受损的伽马氨基丁酸神经传导系统障碍(图5)

[0049] 阿尔茨海默症小鼠四月龄雄雌性模型中观察到的行为表现均提示伽马氨基丁酸受体抑制系统的受损。为了测试这种可能性，我们在脑海马回的齿状神经细胞上评估伽马氨基丁酸介导的抑制性突触后自然电流释放(mIPSC)的动力学和抑制电流的幅度，对阿尔茨海默症鼠的预防和治疗效果进行评估。为了能够确认苯酚茶酸素的预防效果和治疗效果，我们对所有四月龄雄雌性阿尔茨海默症小鼠进行了分组。对照组，阿尔茨海默痴呆病组，阿尔茨海默痴呆病发展2月组后给苯酚茶酸素(痴呆2月+PDTOP2月，0.5毫克/公斤体重)，以此来测试苯酚茶酸素的治疗作用；和痴呆病发展4月组同时给苯酚茶酸素4月组(痴呆2月+PDTOP2月)，以此来测试苯酚茶酸素的预防作用。

[0050] 图5A显示了全细胞记录(电压钳在-70毫伏)。图5B显示出四组重叠的mIPSCs比较：对照鼠，痴呆，痴呆+DHM和痴呆+PDTOP(参照图示)。图5C是综述mIPSCs的动力学变化比较。
痴呆鼠的DG神经细胞的mIPSCs的动力学有改变。图5C中产生电流的频率痴呆4月组(AD4m)继续发展损伤，频率较2月组(AD2m)更低。而在发展了4月痴呆病理同时给与苯酚茶酸素4月(AD+P)，苯酚茶酸素明显的抑制了痴呆病理的发展。而在发展了2月痴呆病理后给与苯酚茶酸素2月

[0051] (AD2m+P2m),发展了的痴呆病理得到了逆转。电流升速各组没有差异。电流幅度AD2m和AD4m组有明显的降低，而给与苯酚茶酸素可以预防和逆转损伤。电流延迟(神经受体通道关闭速度)在AD2m和AD4m组有明显的降低维持神经受体通道开发，而给与苯酚茶酸素可以预防和逆转损伤。

[0052] 这些结果进一步证明，苯酚茶酸素的治疗，不仅能恢复海马神经元的伽马氨基丁酸受体的功能。而且它能预防有潜在阿尔茨海默症基因存在的情况下，预防伽马氨基丁酸受体不受损伤。并且也是重要的是，苯酚茶酸素的效果没有雌雄性别的明显差异。

[0053] 6)Gephyrin水平在阿尔茨海默氏症小鼠的脑内下降50％以下，而苯酚茶酸素的治疗可以恢复Gephyrin水平(图6)。

[0054] Gephyrin是关键支架蛋白组织，涉及伽马氨基丁酸受体聚集在突触部位的抑制性突触后受体密度。Gephyrin不仅具有伽马氨基丁酸能突触位点的结构功能，而且对于突触动力学至关重要的作用。因此，我们研究了gephyrin的蛋白质水平和伽马氨基丁酸受体γ2亚单位在海马和皮层(一起)在对照组，阿尔茨海默症组和阿尔茨海默症接受苯酚茶酸素治疗组的小鼠。

[0055] 免疫分析表明，阿尔茨海默氏症小鼠gephyrin水平与对照相比(图6A)下降了50％以下。苯酚茶酸素(0.5毫克/公斤体重)治疗后1.5个月，gephyrin水平部分恢复，经3个月水化茶酸素治疗后，gephyrin被恢复到对照水平(图6B)。在阿尔茨海默氏症小鼠中降低gephyrin水平可能导致伽马氨基丁酸受体功能受损。伽马氨基丁酸受体在神经传递中发挥作用的突触减少。其结果是，失去了神经之间的突触联系，神经信号不能传递，特别是大脑海马回的神经突触减少会直接影响认知和记忆。另外这些神经受损的动物表现出缺乏探索/运动活动能力，焦虑，癫痫发作的易感性增加。苯酚茶酸素治疗有效的恢复gephyrin的水平，并且，随着gephyrin的水平增加，在测定认知记忆测验中，阿尔茨海默氏症小鼠有了明显的认知记忆能力的改进。这就是苯酚茶酸素能够逆转阿尔茨海默痴呆症病理变化进而改善认知记忆，改善学习达到治疗效果的机制。

[0056] 7)苯酚茶酸素的药物动力学及通多血脑屏障(图7)

[0057] 为了更好地了解苯酚茶酸素的开发潜力，我们又对苯酚茶酸素的药物动力学及能否通多血脑屏障进行了测定(图7，MS-HPLC)。图7显示结果是从雄性实验白鼠(体重240±20克)获得。如图所示，共分五个剂量组(n＝8/组)。第一天，给动物口服苯酚茶酸素之后，15分，30分，1小时，4小时及8小时时间点采血取血清，测试苯酚茶酸素含量(图7A)。又在第14天，重复试验和给药剂量，以观察动物体是否产生耐药(耐受)性(图7B)。

[0058] 这组实验证明，苯酚茶酸素给药，可以产生剂量依赖性血液中苯酚茶酸素浓度升高。药物动力学表明苯酚茶酸素的最大浓度和平台值超过25.0毫克/公斤。没有发现动物体对苯酚茶酸素产生耐药性。另外，也测的苯酚茶酸素在口服后可以在3分钟之内通过血脑屏障(图7C)。

[0059] 综述：

[0060] 1)苯酚茶酸素(0.5毫克/公斤，口服三个月以上)对于阿尔茨海默症动物口服给药，使4月龄转基因阿尔茨海默痴呆症小鼠没有进一步发展为阿尔茨海默痴呆症，保持了自主活动，探索活动能力。

[0061] 2)苯酚茶酸素(0.5毫克/公斤，超过三个月的口服给药)预防了4月龄转基因阿尔茨海默痴呆症小鼠没有进一步发展为阿尔茨海默痴呆症，使之没有出现阿尔茨海默痴呆症常见的焦虑症状。

[0062] 3)在1)和2)中，苯酚茶酸素和二氢杨梅素比较，苯酚茶酸素显示出显著的预防和治疗作用，用药量5倍小于二氢杨梅素，而功效5倍以上强于二氢杨梅素。

[0063] 4)苯酚茶酸素(0.5毫克/公斤)与美金刚(30毫克/千克FDA的指示剂量)相比，对减少淀粉样蛋白-β(Aβ)肽有更显著及有效的疗效；

[0064] 5)苯酚茶酸素能够直接减少和抑制过多的由于神经受损引起的过度谷氨酸释放及释放引起的神经毒性反应；

[0065] 6)由于苯酚茶酸素有显著有效的疗效，减少淀粉样蛋白-β(Aβ)肽，苯酚茶酸素也可以提高识别和学习记忆减退的继发的老年痴呆症，重要的是苯酚茶酸素具有预防效果。

[0066] 7)由于苯酚茶酸素可降低谷氨酸介导的兴奋性中毒引起的神经元丢失。

[0067] 8)苯酚茶酸素给药后没有引起动物体产生耐药性。

[0068] 9)苯酚茶酸素给药后可以产生给药剂量依赖性血液中苯酚茶酸素浓度变化。

[0069] 10)苯酚茶酸素可口服后迅速通过血脑屏障进而达到作用靶点，并且没有性别差异。

[0070] 11)苯酚茶酸素在人体志愿者中，明显改善认知力和记忆能力

[0071] 总结以上，苯酚茶酸素是一个新的有效的预防和治疗阿尔茨海默氏痴呆症的有潜力的新型化合物。苯酚茶酸素也能够有效改善焦虑症，认知障碍，睡眠障碍，由于各种原因引起或出现的认知，学习/记忆能力的其他形式的功能减退症状。

附图说明

[0072] 图1苯酚茶酸对阿尔茨海默痴呆症的行为变化影响实验。

[0073] A长距离/5分钟；B探索频率；C探索能力；D停留空旷地时间；E探索迷宫能力；F抽搐惊厥发作持续时间；

[0074] 图2苯酚茶酸素口服改善阿尔茨海默症动物模型的识别及情境学习与记忆能力对照实验。

[0075] A用新物体识别进行测试和评价；B连续性对新型物识别能力测试；

[0076] 图3苯酚茶酸素在AD动物降低Aβ斑块在海马回的累积实验。

[0077] A-C显示GFAP的免疫反应性在从三组海马的切片；

[0078] D示出了相对密度的结果；

[0079] E-G显示可溶性和不溶性Aβ1-40和Aβ1-42的阿尔茨海默氏症小鼠在全脑内的水平用ELISA法测定；

[0080] 图4苯酚茶酸素降低过度的谷氨酸释放引起的神经毒反应实验。

[0081] A显示了从海马齿状回神经元的记录；B苯酚茶酸素灌流(0→0.01→0.03→0.1μM)产生剂量依赖性地和显著降低mEPSC振幅；E频率；F总电荷转移；

[0082] C-D大鼠神经元活动；

[0083] 图5苯酚茶酸素治疗修复阿尔茨海默症小鼠受损的伽马氨基丁酸神经传导系统障碍实验。

[0084] A显示了全细胞记录(电压钳在-70毫伏)；B显示出四组重叠的mIPSCs比较：

[0085] 对照鼠，痴呆，痴呆+DHM和痴呆+PDTOP；C综述mIPSCs的动力学变化比较；

[0086] 图6苯酚茶酸素的治疗恢复Gephyrin水平实验。

[0087] A阿尔茨海默氏症小鼠gephyrin水平与对照相比；B gephyrin被恢复到对照水平；

[0088] 图7苯酚茶酸素的药物动力学及通多血脑屏障测定实验。

[0089] A第1天PDTOP给药剂量测定；B第14天给药剂量测定；

[0090] 图8志愿者使用后结果。

[0091] 图9美国阿尔兹海默症协会网站上颁布的智力测验标准(中文译本)。

具体实施方式

[0092] 实施例1

[0093] 合成的五毫摩尔(5mmol，1.6g)二氢杨梅素加入到20毫升甲醇溶解30分钟，将溶解的溶液放置入冰槽。用5.5毫摩尔的哌啶(0.47克/升)，在-10℃的氩气存在下滴定入二氢杨梅素甲醇液，放置20分钟使其反应完全。然后，在低压下(抽真空，以减少空气压力约20％)浓缩反应液，过滤后，用甲醇洗三遍即可获得苯酚茶酸素(～2g)。

[0094] 实施例2

[0095] 将500克二氢杨梅素加入到6.25升甲醇溶解30分钟，将溶解的溶液放置入冰槽。用103.8克/升的哌啶，在-10℃的氩气存在下滴定入二氢杨梅素甲醇液，放置20分钟使其反应完全。然后，在低压下(抽真空，以减少空气压力约20％)浓缩反应液，过滤后，用甲醇洗三遍即可获得苯酚茶酸素(约625克)。

[0096] 实施例3

[0097] 将5000克二氢杨梅素加入到62.5升甲醇溶解30分钟，将溶解的溶液放置入冰槽。用1038克/升的哌啶，在-10℃的氩气存在下滴定入二氢杨梅素甲醇液，放置20分钟使其反应完全。然后，在低压下(抽真空，以减少空气压力约20％)浓缩反应液，过滤后，用甲醇洗三遍即可获得苯酚茶酸素(约6250克)。

[0098] 实施例4

[0099] 志愿者(26人)均为医院诊断有各种疾患引起的智力认知能力损伤或诊断有阿尔兹海默症的患者，服用其他药物未见明显改善者。首先，这些患者进行了由美国阿尔兹海默症协会网站上颁布的智力测验(图9)进行了服用前测试(服药时间0)记录的是平均得分。每半个月重复测试一次。满分为30分。受试者年龄从60至90岁，每天一次口服实施例1所制备的苯酚茶酸素，服用两个月后智力认知能力明显改善。停药也未见症状反弹。并且没有性别差异。

[0100] 治疗一次有效量为0.1毫克/公斤体重(受试者)。

[0101] 实施例5

[0102] 志愿者(260人)均为医院诊断有各种疾患引起的智力认知能力损伤或诊断有阿尔兹海默症的患者，服用其他药物未见明显改善者。首先，这些患者进行了由美国阿尔兹海默症协会网站上颁布的智力测验(图9)进行了服用前测试(服药时间0)记录的是平均得分。每半个月重复测试一次。满分为30分。受试者年龄从60至90岁，每天一次口服实施例2所制备的苯酚茶酸素，服用两个月后智力认知能力明显改善。停药也未见症状反弹。并且没有性别差异。

[0103] 治疗一次有效量为5毫克/公斤体重(受试者)。

[0104] 实施例6

[0105] 志愿者(260人)均为医院诊断有各种疾患引起的智力认知能力损伤或诊断有阿尔兹海默症的患者，服用其他药物未见明显改善者。首先，这些患者进行了由美国阿尔兹海默症协会网站上颁布的智力测验(图9)进行了服用前测试(服药时间0)记录的是平均得分。每半个月重复测试一次。满分为30分。受试者年龄从60至90岁，每天一次口服实施例2所制备的苯酚茶酸素，服用两个月后智力认知能力明显改善。停药也未见症状反弹。并且没有性别差异。

[0106] 治疗一次有效量为10毫克/公斤体重。

[0107] 实施例7

[0108] 志愿者(260人)均为医院诊断有各种疾患引起的智力认知能力损伤或诊断有阿尔兹海默症的患者，服用其他药物未见明显改善者。首先，这些患者进行了由美国阿尔兹海默症协会网站上颁布的智力测验(图9)进行了服用前测试(服药时间0)记录的是平均得分。每半个月重复测试一次。满分为30分。受试者年龄从60至90岁，每天一次口服实施例2所制备的苯酚茶酸素，服用两个月后智力认知能力明显改善。停药也未见症状反弹。并且没有性别差异。

[0109] 用于治疗的一次有效量为0.5毫克/公斤体重(受试者)。

[0110] 实施例8

[0111] 志愿者(26人)均为医院诊断有各种疾患引起的智力认知能力损伤或诊断有阿尔兹海默症的患者，服用其他药物未见明显改善者。首先，这些患者进行了由美国阿尔兹海默症协会网站上颁布的智力测验(图9)进行了服用前测试(服药时间0)记录的是平均得分。每半个月重复测试一次。满分为30分。受试者年龄从60至90岁，每天一次口服实施例3所制备的苯酚茶酸素，服用两个月后智力认知能力明显改善。停药也未见症状反弹。并且没有性别差异。

[0112] 用于治疗的一次有效量为500毫克/公斤体重。

[0113] 实施例9

[0114] 志愿者(26人)均为医院诊断有各种疾患引起的智力认知能力损伤或诊断有阿尔兹海默症的患者，服用其他药物未见明显改善者。首先，这些患者进行了由美国阿尔兹海默症协会网站上颁布的智力测验(图9)进行了服用前测试(服药时间0)记录的是平均得分。每半个月重复测试一次。满分为30分。受试者年龄从60至90岁，每天一次口服实施例3所制备的苯酚茶酸素，服用两个月后智力认知能力明显改善。停药也未见症状反弹。并且没有性别差异。

[0115] 用于治疗的一次有效量为1000毫克/公斤体重。