一种荧光铜纳米团簇探针的制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种荧光铜纳米团簇探针的制备方法和应用，属于荧光纳米材料。探针是以丝素蛋白作为模板和保护剂，在碱性环境中，利用“一锅法”制得大小均匀、稳定性好、对pH响应的荧光铜纳米团簇探针；该方法成本较低，操作简单，原料广泛易得，具有良好的重复性；而且制得的荧光铜纳米团簇探针水溶性好、稳定性强，可应用于实际水样中pH的检测。

权利要求

1.一种荧光铜纳米团簇探针的制备方法，其特征在于，步骤包括：(1)将蚕茧剪成1-2cm2的小片，将蚕茧小片置于0.01-0.03mol/L碳酸钠溶液中，在90-

110℃下加热脱胶0.5-2h，制得丝素蛋白；

(2)将步骤(1)得到的丝素蛋白用去离子水清洗2-4次，在CaCl2:水:乙醇＝1:8:2的混合溶液中，在70-90℃下加热1-3h，使丝素蛋白溶解；

(3)向步骤(2)得到的丝素蛋白溶液冷却至室温，过滤，透析48h，置于4℃冰箱中备用；

(4)量取步骤(3)得到的丝素蛋白溶液，不断搅拌下，向丝素蛋白溶液中加入8-15mmol/L硝酸铜溶液，继续搅拌使两者充分混匀，丝素蛋白溶液与硝酸铜溶液的体积比为1-4:1；

(5)向步骤(4)得到的混合溶液中加入25μL浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液，在25-95℃下继续搅拌2-10h；

(6)将步骤(5)得到的混合溶液经过离心，最终得到荧光铜纳米团簇探针溶液。

2.如权利要求1所述的一种荧光铜纳米团簇探针的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中碳酸钠溶液的浓度为0.02mol/L。

3.如权利要求1所述的一种荧光铜纳米团簇探针的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中蚕茧小片与碳酸钠溶液在100℃下加热1h。

4.如权利要求1所述的一种荧光铜纳米团簇探针的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中得到的脱胶后的丝素蛋白用去离子水清洗3次，在CaCl2:水：乙醇＝1:8:2的混合溶液中，在80℃下加热2h，使其溶解。

5.如权利要求1所述的一种荧光铜纳米团簇探针的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中透析是用截留分子量为8000-14000Da的透析袋透析。

6.如权利要求1所述的一种荧光铜纳米团簇探针的制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)中的硝酸铜溶液的浓度为10mmol/L。

7.如权利要求1所述的一种荧光铜纳米团簇探针的制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)中的丝素蛋白溶液与硝酸铜溶液的体积比为3:1。

8.如权利要求1所述的一种荧光铜纳米团簇探针的制备方法，其特征在于，所述的步骤(5)中，在55℃下搅拌6h。

9.如权利要求1所述的一种荧光铜纳米团簇探针的制备方法，其特征在于，所述的步骤(6)中离心是以13000r/min转速离心10min。

10.如权利要求1-9所述任一方法制备的荧光铜纳米团簇探针在pH检测中的应用。

说明书

一种荧光铜纳米团簇探针的制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及荧光纳米材料制备技术领域，具体涉及一种荧光铜纳米团簇探针的制备方法，以及所制备的探针在检测pH中的应用。

背景技术

[0002] 金属纳米团簇，是一种金属核心尺寸小于2nm的超小纳米粒子。最近几年，荧光强度高，稳定性好的金属纳米团簇被密集的报道作为新型荧光纳米团簇探针，用于检测很多种类的目标物。金属纳米团簇的一个明显特征是它强的光致发光，并且具有良好的光稳定性，大的斯托克斯位移和高的发射效率，因而引起了研究者广泛的兴趣。相对于金和银来说，铜更便宜。因此，铜纳米团簇逐渐成为金属纳米材料中的重要组成部分，并广泛应用于化学分析、生物传感、生物成像、离子检测等研究领域。

[0003] 生物大分子如多肽和蛋白质，具有良好的生物相容性，自身具备多种生物功能，易于实现铜纳米团簇的功能化，也常用作合成荧光铜纳米团簇探针的优良模板。文献(Ultra sensitive and wide-range pH sensor based on the BSA-capped Cu nanoclusters fabricated by fast synthesis through the use of hydrogen peroxide additive,X.Q.Liao,R.Y.Li,X.H.Long,Z.J.Li,RSC Adv.,2015,5,48835-48841)，用一种商业化的常见蛋白质----牛血清白蛋白，加入过氧化氢，合成了高发光的铜纳米团簇，对不同缓冲溶液的pH有响应，可以完成对实际水样中pH的检测。但是，该方法合成过程有些繁琐，成本较高，因此我们迫切需要一种合成简单，成本低廉的新方法。

发明内容

[0004] 本发明目的在于提供一种荧光铜纳米团簇探针的制备方法，该方法操作简单，反应条件温和，所得荧光铜纳米团簇探针粒径较小，分散性好，能用于实际水样中pH的检测。

[0005] 为实现上述目的，本发明提供的一种荧光铜纳米团簇探针的制备方法，步骤包括：

[0006] (1)将蚕茧剪成1-2cm2的小片，将蚕茧小片置于0.01-0.03mol/L碳酸钠溶液中，在90-110℃下加热脱胶0.5-2h，制得丝素蛋白；

[0007] (2)将步骤(1)得到的丝素蛋白用去离子水清洗2-4次，在CaCl2:水:乙醇＝1:8:2的混合溶液中，在70-90℃下加热1-3h，使丝素蛋白溶解；

[0008] (3)向步骤(2)得到的丝素蛋白溶液冷却至室温，过滤，透析48h，置于4℃冰箱中备用；

[0009] (4)量取步骤(3)得到的丝素蛋白溶液，不断搅拌下，向丝素蛋白溶液中加入8-15mmol/L硝酸铜，继续搅拌使两者充分混匀，丝素蛋白水溶液与硝酸铜溶液的体积比为1-
4:1；

[0010] (5)向步骤(4)得到的混合溶液中加入25μL浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液，在25-95℃下继续搅拌2-10h；

[0011] (6)将步骤(5)得到的混合溶液经过离心，最终得到荧光铜纳米团簇探针溶液。

[0012] 步骤(1)中碳酸钠溶液的浓度优选为0.02mol/L。

[0013] 步骤(1)中蚕茧小片与碳酸钠溶液优选在100℃下加热1h。

[0014] 步骤(2)中得到的脱胶后的丝素蛋白用去离子水清洗优选3次，在CaCl2:水：乙醇＝1:8:2的混合溶液中，优选在80℃下加热2h,使其溶解。

[0015] 步骤(3)中透析是用截留分子量为8000-14000Da的透析袋。

[0016] 步骤(4)中的硝酸铜溶液的浓度优选为10mmol/L。

[0017] 步骤(4)中的丝素蛋白水溶液与硝酸铜溶液的体积比优选为3:1。

[0018] 步骤(5)中，优选在55℃下搅拌6h。

[0019] 步骤(6)中离心是以13000r/min转速离心10min。

[0020] 本发明方法制备的荧光铜纳米团簇探针可用于检测实际水样中的pH。

[0021] 与现有技术相比，本发明的优点在于：

[0022] (1)以丝素蛋白为模板，原料广泛易得，绿色环保，制备方法简单，成本低廉。

[0023] (2)制得的荧光铜纳米团簇探针具有良好的蓝色发光性能，将其用于构建实际水样中检测pH的传感体系，可以避免其它金属离子的干扰。本发明制备的荧光铜纳米团簇探针可检测实际水样中的pH。

[0024] (3)制得的荧光铜纳米团簇探针尺寸小、光稳定性强、毒副作用小、水溶性好，荧光强度高，在生物成像、生物标记等领域有广阔的应用前景。

附图说明

[0025] 图1为本发明制备的荧光铜纳米团簇探针的作用机理示意图

[0026] 图2为本发明制备荧光铜纳米团簇探针溶液分别在日光灯(1)和波长为365nm紫外灯(2)照射下的照片

[0027] 图3为本发明制备荧光铜纳米团簇探针溶液的荧光-紫外图，图中a为紫外-可见吸收光谱图，b为荧光光谱图

[0028] 图4为本发明制备的荧光铜纳米团簇探针溶液加入不同金属离子与pH＝10.05的BR缓冲溶液时荧光峰强度的变化

[0029] 图5本发明制备的荧光铜纳米团簇探针溶液随离子强度(氯化钠的浓度)的变化其荧光峰强度的变化

[0030] 图6本发明制备的荧光铜纳米团簇探针溶液在BR缓冲溶液中的荧光强度随pH的变化

[0031] 图7本发明制备的荧光铜纳米团簇探针溶液与不同pH的BR缓冲溶液之间的线性关系

[0032] 图8本发明制备的荧光铜纳米团簇探针溶液在HEPES-NaOH缓冲溶液中的荧光强度随pH的变化

[0033] 图9本发明制备的荧光铜纳米团簇探针溶液与不同pH的HEPES-NaOH缓冲溶液之间的线性关系

[0034] 图10本发明制备的荧光铜纳米团簇探针溶液在Tris-HCl缓冲溶液中的荧光强度随pH的变化

[0035] 图11本发明制备的荧光铜纳米团簇探针溶液与不同pH的Tris-HCl缓冲溶液之间的线性关系

具体实施方式

[0036] 本发明是以丝素蛋白为模板，在碱性环境中，通过“一锅法”制备荧光铜纳米团簇探针溶液，并用于实际水样中pH的检测。下面通过实施例结合附图对本发明作进一步说明。

[0037] 实施例1

[0038] 以丝素蛋白为模板的荧光铜纳米团簇探针的制备：

[0039] (1)蚕茧脱胶制备丝素蛋白：将蚕茧剪成1-2cm2的小片，将蚕茧小片置于0.02mol/L碳酸钠溶液中，在100℃下加热1h；

[0040] (2)将步骤(1)得到的脱胶后的丝素蛋白用去离子水清洗3次，在CaCl2:水:乙醇＝1:8:2的混合溶液中，在80℃下加热2h,使其溶解；

[0041] (3)向步骤(2)得到的丝素蛋白溶液冷却至室温，过滤，透析48h，置于4℃冰箱中备用；

[0042] (4)量取步骤(3)得到的丝素蛋白溶液，不断搅拌下，向丝素蛋白溶液中加入10mmol/L硝酸铜，继续搅拌使两者充分混匀，丝素蛋白水溶液与硝酸铜溶液的体积比为3:
1；

[0043] (5)向步骤(4)得到的混合溶液中加入25μL浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液，在55℃下继续搅拌6h；

[0044] (6)将步骤(5)得到的溶液以13000r/min转速离心10min，最终得到荧光铜纳米团簇探针溶液。

[0045] 制备的荧光铜纳米团簇探针的作用机理示意图见图1。

[0046] 制备的荧光铜纳米团簇探针溶液分别在日光灯和波长为365nm紫外灯照射下的照片见图2，图中1为荧光铜纳米团簇探针溶液在日光灯照射下的图片，颜色为浅紫色，2为波长为365nm紫外灯照射下的图片，颜色为蓝色。

[0047] 此外，制备的荧光铜纳米团簇探针溶液的荧光-紫外图见图3，其中荧光图(b)表明制备的荧光铜纳米团簇探针在固定激发波长为326nm条件下，发射峰位置在420nm左右。

[0048] 实施例2

[0049] 金属离子对实施例1制备的荧光铜纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响实验：

[0050] 用pH＝7的BR缓冲溶液和Pb(NO3)2、Mg(NO3)2、Mn(NO3)2、Fe(NO3)3、Zn(NO3)2、Cd(NO3)2、Cu(NO3)2、Hg(NO3)2、KNO3、Ca(NO3)2、NaNO3、Ni(NO3)2、Al(NO3)3、Cr(NO3)3、Co(NO3)2分别配制成金属离子浓度为100μmol·L-1的溶液，分别将0.1mL实施例1制备的荧光铜纳米团簇探针溶液加入到0.9mL上述含不同金属离子的溶液中。再取0.1mL实施例1制备的荧光铜纳米团簇探针溶液加入到0.9mL pH＝10.05的BR缓冲溶液中，固定激发波长为326nm，在室温下进行荧光光谱检测，根据420nm左右的荧光峰强度，检测金属离子和pH对荧光铜纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响。

[0051] 金属离子和pH对荧光铜纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响见图4：在326nm激发下，从含金属离子的荧光铜纳米团簇探针溶液的荧光强度与含pH＝10.05的BR缓冲的荧光铜纳米团簇探针溶液的荧光峰强度F得出：pH＝10.05的BR缓冲的荧光铜纳米团簇探针溶液变化最大，其他金属离子变化相对较小，说明本发明制备的荧光铜纳米团簇探针溶液能够定性检测pH。

[0052] 实施例3

[0053] 离子强度对实施例1制备的荧光铜纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响实验：

[0054] 将100μL实施例1制备的荧光铜纳米团簇探针溶液加入到900μL BR缓冲溶液(pH＝7.0)中，固定激发波长为326nm，加入不同浓度的氯化钠溶液(0.04-0.22mol/L)，根据420nm左右的荧光峰强度，检测离子强度对荧光铜纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响。

[0055] 离子强度对荧光铜纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响见图5：在326nm激发下，荧光铜纳米团簇探针溶液在不同浓度的氯化钠溶液(0.04-0.22mol/L)范围内，荧光峰强度基本不变，说明本发明制备的荧光铜纳米团簇探针溶液抗离子干扰性强。

[0056] 实施例4

[0057] 实施例1制备的荧光铜纳米团簇探针溶液在BR缓冲溶液中的荧光强度随pH的变化实验：

[0058] 取实施例1制备的荧光铜纳米团簇探针溶液100μL加入到900μL不同pH的BR缓冲溶液中，固定激发波长为326nm，在室温下进行荧光光谱检测，根据420nm左右的荧光峰强度，检测不同pH的BR缓冲溶液对荧光铜纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响。

[0059] 不同pH的BR缓冲溶液对荧光铜纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响见图6：在326nm激发下，荧光铜纳米团簇探针溶液在加入不同pH的BR缓冲溶液，荧光峰强度逐渐增强；其中pH值分别是1.82,2.27,3.05,4.00,5.03,6.08,7.00,8.06,9.07,10.05,11.02,
12.00的BR缓冲溶液对荧光铜纳米团簇探针溶液荧光峰强度影响的荧光光谱图，说明本发明制备的荧光铜纳米团簇探针溶液能够实现对不同pH的检测。

[0060] 此外，本发明制备的荧光铜纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的变化与不同pH的BR缓冲溶液呈线性关系，如图7所示，随着pH值的增长，荧光峰强度逐渐增强，线性方程的R2＝0.9992。

[0061] 实施例5

[0062] 实施例1制备的荧光铜纳米团簇探针溶液在HEPES-NaOH缓冲溶液中的荧光强度随pH的变化实验：

[0063] 取实施例1制备的荧光铜纳米团簇探针溶液100μL加入到900μL不同pH的HEPES-NaOH缓冲溶液中，固定激发波长为326nm，在室温下进行荧光光谱检测，根据420nm左右的荧光峰强度，检测不同pH的HEPES-NaOH缓冲溶液对荧光铜纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响。

[0064] 不同pH的HEPES-NaOH缓冲溶液对荧光铜纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响见图8：在326nm激发下，荧光铜纳米团簇探针溶液在加入不同pH的HEPES-NaOH缓冲溶液，荧光峰强度逐渐增强；其中pH值分别是6.80,7.05,7.25,7.64,7.98,8.18的HEPES-NaOH缓冲溶液对荧光铜纳米团簇探针溶液荧光峰强度影响的荧光光谱图，说明本发明制备的荧光铜纳米团簇探针溶液能够实现对不同pH的检测。

[0065] 此外，本发明制备的荧光铜纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的变化与不同pH的HEPES-NaOH缓冲溶液呈线性关系，如图9所示，随着pH值的增长，荧光峰强度逐渐增强，线性方程的R2＝0.9946。

[0066] 实施例6

[0067] 实施例1制备的荧光铜纳米团簇探针溶液在Tris-HCl缓冲溶液中的荧光强度随pH的变化实验：

[0068] 取实施例1制备的荧光铜纳米团簇探针溶液100μL加入到900μL不同pH的Tris-HCl缓冲溶液中，固定激发波长为326nm，在室温下进行荧光光谱检测，根据420nm左右的荧光峰强度，检测不同pH的Tris-HCl缓冲溶液对荧光铜纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响。

[0069] 不同pH的Tris-HCl缓冲溶液对荧光铜纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响见图10：在326nm激发下，荧光铜纳米团簇探针溶液在加入不同pH的Tris-HCl缓冲溶液，荧光峰强度逐渐增强；其中pH值分别是6.95,7.24,7.56,7.99,8.68,9.00的Tris-HCl缓冲溶液对荧光铜纳米团簇探针溶液荧光峰强度影响的荧光光谱图，说明本发明制备的荧光铜纳米团簇探针溶液能够实现对不同pH的检测。

[0070] 此外，本发明制备的荧光铜纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的变化与不同pH的Tris-HCl缓冲溶液呈线性关系，如图11所示，随着pH值的增长，荧光峰强度逐渐增强，线性方程的R2＝0.9843。

[0071] 实施例7

[0072] 实施例1制备的荧光铜纳米团簇探针溶液用于实际水样中pH的检测实验：

[0073] 分别用商业化的pH计(pHa)与实施例1制备的荧光铜纳米团簇探针溶液(pHb)检测自来水样和湖水样的pH，来计算两者的相对偏差，如表1所示。

[0074] 表1为商业化的pH计与本发明制备的荧光铜纳米团簇探针溶液用于实际水样中pH的检测

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