石墨烯量子点防治骨质疏松的应用

摘要

本发明公开了石墨烯量子点防治骨质疏松的应用，具体包括抑制破骨细胞前体细胞融合或分化成熟的应用，抗成熟破骨细胞噬骨能力的应用，抑制破骨细胞分化、融合或成熟相关基因表达中的应用，抑制破骨细胞TRAP酶活性的应用以及抑制破骨细胞前体细胞融合形成多核成熟破骨细胞的应用。有效剂量内石墨烯量子点浓度依赖性抑制RANKL诱导的BMMs细胞向破骨细胞的分化成熟、抑制RANKL诱导的BMMs细胞分化成熟的破骨细胞的噬骨能力、抑制破骨细胞的融合，另外，石墨烯量子点可以显著降低破骨细胞分化特异基因的表达，因此石墨烯量子点最终能够起到防治骨质疏松的作用，进而可以应用于骨质疏松的防治。

权利要求

1.石墨烯量子点在制备防治骨质疏松的药物中的应用；所述石墨烯量子点的使用量至少为1mg/kg体重。

2.含石墨烯量子点的化合物在制备用于防治骨质疏松的药物中的应用。

3.石墨烯量子点在制备用于抑制破骨细胞前体细胞融合或分化成熟的药物中的应用。

4.石墨烯量子点在制备用于抗成熟破骨细胞噬骨能力的药物中的应用。

5.石墨烯量子点在制备用于抑制破骨细胞分化相关基因表达的药物中的应用，所述相关基因为Ctsk、c-fos、NFATc1或DC-STAMP。

6.石墨烯量子点在制备用于抑制破骨细胞TRAP酶活性的药物中的应用。

7.石墨烯量子点在制备抑制破骨细胞前体细胞融合形成多核成熟破骨细胞的药物中的应用。

说明书

石墨烯量子点防治骨质疏松的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及骨质疏松的防治技术领域，具体涉及石墨烯量子点防治骨质疏松的应用。

背景技术

[0002] 骨质疏松症(osteoporosis,OP)是由全身骨量减少、骨密度降低为标志的全身性、进行性骨病。在OP患者中，骨矿密度(BMD)降低，骨微结构遭到破坏，蛋白量及种类均发生改变，容易导致骨折。该症在绝经后妇女和75岁以上老年人中极为常见，是威胁老年人健康和降低生活质量的重要因素。

[0003] 破骨细胞(Osteoclast,OC)由造血干细胞系髓系单核细胞分化而来，是人体骨骼系统中唯一具有吸收和重塑骨骼形态的生理性多核巨细胞。破骨细胞的活性和数量与人体正常生理稳态电解质平衡中的钙磷平衡以及诸多内分泌疾病包括骨质疏松症密切相关。OP患者中破骨细胞活性明显提高，噬骨活动增加，破骨细胞与成骨细胞耦连作用下降，最终导致骨吸收大于骨形成，骨生理稳态遭到破坏，骨密度下降。

[0004] 石墨烯量子点(Graphene Quantumn Dots,GQDs)作为石墨烯家族的最新一员，除了具有石墨烯的优异性能，还因量子限制效应和边界效应而展现出一系列新的特性，因此吸引了化学、物理、材料和生物等各领域科学家的广泛关注。在生物学领域，除其在生物传感和成像中的应用，其良好的生物相容性和较低的毒性都为其进一步的药理学价值探索做了铺垫。目前已有报道石墨烯能够促进人间充质干细胞(hMSCs)向成骨分化，然而，还未见其对于破骨细胞作用以及对实验动物整体骨量的影响的相关报道。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种石墨烯量子点防治骨质疏松的应用，石墨烯量子点通过对破骨细胞形成进行抑制、同时抑制成熟破骨细胞的噬骨能力、抑制骨吸收、促进骨形成，最终起到防治骨质疏松的作用。

[0006] 本发明采取的技术方案如下：

[0007] 1、石墨烯量子点在制备防治骨质疏松的药物中的应用。

[0008] 优选的，所述石墨烯量子点的使用量至少为1mg/kg体重。

[0009] 2、含石墨烯量子点的化合物在制备用于防治骨质疏松的药物中的应用。

[0010] 3、石墨烯量子点在制备用于抑制破骨细胞前体细胞融合或分化成熟的药物中的应用。

[0011] 4、石墨烯量子点在制备用于抗成熟破骨细胞噬骨能力的药物中的应用。

[0012] 5、石墨烯量子点在制备用于抑制破骨细胞分化、融合或成熟相关基因表达的药物中的应用。

[0013] 优选的，所述破骨细胞分化、融合或成熟相关基因包括Ctsk、c-fos、NFATc1或DC-STAMP。

[0014] 6、石墨烯量子点在制备用于抑制破骨细胞TRAP酶活性的药物中的应用。

[0015] 7、石墨烯量子点在制备抑制破骨细胞前体细胞融合形成多核成熟破骨细胞中的应用。

[0016] 本发明具有以下有益的技术效果：在有效剂量内，石墨烯量子点对小鼠原代骨髓单核巨噬细胞(BMMs)无毒性作用；有效剂量内浓度依赖性抑制RANKL诱导的BMMs向破骨细胞的分化成熟；有效剂量内浓度依赖性抑制RANKL诱导的BMMs分化成熟的破骨细胞的噬骨能力；有效剂量内浓度依赖性抑制破骨细胞的融合；石墨烯量子点可以显著降低NFATc1、c-fos、p38\MAPK及NFκB等破骨细胞分化特异基因的表达。

[0017] 由于BMMs细胞是研究破骨细胞分化、融合、成熟的常用细胞模型，鉴于石墨烯量子点对RANKL诱导的破骨细胞形成具有抑制作用，同时可以抑制成熟破骨细胞的噬骨能力，抑制骨吸收，促进骨形成，因此石墨烯量子点最终能够起到防治骨质疏松的作用，进而可以应用于骨质疏松的防治。

附图说明

[0018] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

[0019] 图1不同浓度石墨烯量子点对BMMs细胞增殖的影响，图中A图为作用时间24h结果，B图为作用时间72h结果；横坐标为石墨烯量子点的上样终浓度，纵坐标为以各组的吸光度OD值同空白对照组的OD值比较百分数表述的细胞活力值。

[0020] 图2石墨烯量子点浓度依赖性抑制破骨细胞生成的TRAP染色结果，图中A图为不同浓度石墨烯量子点对RANKL诱导的破骨细胞形成的TRAP染色显微镜图；图中B图为不同浓度石墨烯量子点作用下每孔破骨细胞数量及相对TRAP强度。

[0021] 图3不同浓度石墨烯量子点对破骨细胞形成以及多核破骨细胞形成的影响，图中A图为不同浓度石墨烯量子点对RANKL诱导的破骨细胞形成的FAK免疫荧光染色；图中B图为破骨细胞数量及其细胞核数量的计数统计。

[0022] 图4石墨烯量子点抑制破骨细胞骨吸收能力结果，图中A图为不同浓度石墨烯量子点对破骨细胞噬骨能力的影响甲苯胺蓝染色结果；图中B图为骨表面吸收分数统计。

[0023] 图5石墨烯量子点抑制破骨细胞分化特异性基因c-fos、Ctsk、NFATc1、DC-STAMP的表达结果，A-D图为不同浓度石墨烯量子点对RANKL诱导的破骨细胞分化的基因NFATc1、c-fos、DC-STAMP及Ctsk表达水平的影响。

[0024] 图6平均骨密度检测与骨代谢标志物检测结果，图中A图为microCT成像；图中B图为骨参数分析结果。

具体实施方式

[0025] 下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

[0026] BMMs为小鼠单核巨噬细胞，其在RANKL以及M-CSF的刺激诱导下可以向破骨细胞分化，是研究破骨细胞分化、融合、成熟、噬骨等生物学行为的常用的细胞模型。同时破骨细胞与成骨细胞、骨细胞、基质细胞等都有密切的关联和耦合作用，是体内骨稳态及电解质稳态的重要调控元素。骨质疏松往往由过多的骨吸收导致，是破骨细胞过度活化的结果。因此，本发明以BMMs作为细胞模型，研究石墨烯量子点对RANKL诱导的破骨细胞生成的影响，进而探索石墨烯量子点在防治骨质疏松方面的用途。

[0027] 1、高浓度石墨烯量子点抑制破骨细胞前体的增殖

[0028] 将BMMs细胞以1×103个/孔接种于96孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+10％胎牛血清+1％双抗(青链霉素)，以终浓度为0(空白对照组)、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL将石墨烯量子点加入各个含新鲜培养基的孔板中，同时以RANKL(终浓度50ng/mL)、M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导BMMS细胞向破骨细胞分化，分别培养24h和72h，利用CCK-8法对细胞活性进行检测，观察石墨烯量子点对RNAKL诱导下BMMs细胞增殖作用的影响。

[0029] 结果如图1所示，由图可见，在24h组或是72h组中，低浓度的石墨烯量子点(小于100μg/mL)对破骨细胞分化过程中的细胞增殖无明显影响，高浓度的石墨烯量子点(大于
150μg/mL)对破骨细胞分化过程中的细胞增殖具有明显的抑制效应，*P＜0.05，**P＜0.01。

[0030] 2、石墨烯量子点浓度依赖性减少RANKL诱导的TRAP阳性细胞产生

[0031] 分组情况：

[0032] 组1：无RANKL、M-CSF诱导，无石墨烯量子点阴性对照组；

[0033] 组2：RANKL(终浓度50ng/mL)+M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导，无石墨烯量子点阳性对照组；

[0034] 组3：RANKL(终浓度50ng/mL)+M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导，终浓度1μg/mL石墨烯量子点实验组；

[0035] 组4：RANKL(终浓度50ng/mL)+M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导，终浓度5μg/mL石墨烯量子点实验组；

[0036] 组5：RANKL(终浓度50ng/mL)+M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导，终浓度10μg/mL石墨烯量子点实验组；

[0037] 组6：RANKL(终浓度50ng/mL)+M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导，终浓度50μg/mL石墨烯量子点实验组；

[0038] 组7：RANKL(终浓度50ng/mL)+M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导，终浓度100μg/mL石墨烯量子点实验组；

[0039] 组8：RANKL(终浓度50ng/mL)+M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导，终浓度150μg/mL石墨烯量子点实验组；

[0040] 将BMMs细胞以1×103个/孔接种于96孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+10％胎牛血清+1％双抗(青链霉素)，以终浓度为0、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL将石墨烯量子点加入各个含新鲜培养基的孔板中，同时以RANKL(终浓度50ng/mL)、M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导BMMS细胞向破骨细胞分化。诱导培养72h后行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色：弃置培养基后用PBS清洗3次，一次3min，4％多聚甲醛固定20min，PBS清洗3次，一次3min，抗酒石酸酸性磷酸酶染液染色(0.1mg/ml of naphthol AS-MX phosphate,0.3mg/ml of Fast Red Violet LB复染)，避光染色1h，弃置染液，PBS漂洗3次后每孔加入100μL PBS待观察。光镜下可见TRAP阳性细胞被染成紫红色(图2中A图)。

[0041] 根据细胞核数量统计TRAP阳性细胞个数，分别统计破骨细胞数量(TRAP阳性，核大于3)，TRAP相对强度。结果提示破骨细胞总细胞数量在毒性浓度范围内随着石墨烯量子点用量的增加而降低(图2中B图)，同时，TRAP相对强度随着石墨烯量子点的用量增加而降低(图2中C图)，证明石墨烯量子点具有浓度依赖性抑制破骨细胞的生成。当石墨烯量子点终浓度为临界毒性浓度50μg/mL时，抑制效果最明显(**P＜0.01)。

[0042] 3、石墨烯量子点浓度依赖性减少RANKL诱导的多核成熟破骨细胞形成

[0043] 分组情况：

[0044] 组1：RANKL(终浓度50ng/mL)+M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导，无石墨烯量子点对照组；

[0045] 组2：RANKL(终浓度50ng/mL)+M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导，终浓度5μg/mL石墨烯量子点实验组；

[0046] 组3：RANKL(终浓度50ng/mL)+M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导，终浓度10μg/mL石墨烯量子点实验组；

[0047] 组4：RANKL(终浓度50ng/mL)+M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导，终浓度100μg/mL石墨烯量子点实验组。

[0048] 将BMMs细胞以1×103个/孔接种于96孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+10％胎牛血清+1％双抗(青链霉素)，以终浓度为0、5μg/mL、10μg/mL、100μg/mL将石墨烯量子点加入各个含新鲜培养基的孔板中，同时以RANKL(终浓度50ng/mL)、M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导BMMs细胞向破骨细胞分化。诱导培养72h后行FAK(Actin Cytoskeleton and Focal Adhesion Staining)免疫荧光染色(图3中A图)：细胞取出后弃置培养基，1×PBS洗两遍，4％多聚甲醛室温下固定20min，1×PBS洗两遍，0.1％TritonX-
100穿透细胞5min，1×PBS洗两遍，封闭缓冲液(1％BSA in 1×PBS)固定30min，一抗(Anti-Vinculin)于封闭缓冲液稀释至工作浓度(1：300)，室温孵育细胞1h；1×冲洗缓冲液(0.05％Tween-20in 1×PBS)洗三遍，每次5-10min；二抗(Alexa Fluor 488Goat Anti-Mouse IgG(H+L)抗体,Invitrogen)稀释至工作浓度(1：500)，同时加入TRITC标记的鬼笔环肽(1:500)，室温下共同孵育1h；1×wash buffer洗三遍，每次5-10min；室温下DAPI(1:
1000)复染核5min，1×冲洗缓冲液洗三遍，每次5-10min；荧光显微镜观察细胞。

[0049] 统计视野下破骨细胞数量以及破骨细胞平均核数，结果提示当石墨烯量子点终浓度超过5μg/mL时，破骨细胞的形成收到了明显的抑制，**P＜0.01(图3中B图)。同时可见当石墨烯量子点终浓度超过5μg/mL时，多核破骨细胞(核数量大于3)的形成显著降低，**P＜0.01(图3中B图)。

[0050] 4、石墨烯量子点抑制破骨细胞骨吸收能力

[0051] 分组情况：

[0052] 组1：无RANKL、M-CSF诱导，无石墨烯量子点对照组；

[0053] 组2：RANKL(终浓度50ng/mL)+M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导，无石墨烯量子点对照组；

[0054] 组3：RANKL(终浓度50ng/mL)+M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导，终浓度10μg/mL石墨烯量子点实验组；

[0055] 组4：RANKL(终浓度50ng/mL)+M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导，终浓度100μg/mL石墨烯量子点实验组。

[0056] 将BMMs细胞以4×103个/孔接种于铺200μm小牛骨片的48孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+10％胎牛血清+1％双抗(青链霉素)，以终浓度为0、10μg/mL、100μg/mL将石墨烯量子点加入各个含新鲜培养基的孔板中，同时以RANKL(终浓度50ng/mL)、M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导BMMs细胞向破骨细胞分化(空白对照组除外)。96小时后取出含小牛骨片的48孔板，弃置培养基，10％漂白剂(HClO)室温漂白5min，双蒸水清洗3遍，每次5min，室温下放置至干燥(3-5小时)，甲苯胺蓝染液染色5min，双蒸水漂洗3-5遍，每次5min，每孔加入200μl双蒸水或1×PBS，光镜下观察。

[0057] 骨表面经破骨细胞吸收后可被甲苯胺蓝染成蓝色，根据蓝色噬骨面积的大小和占总骨面的百分比评价破骨细胞的噬骨能力。结果如图4所示，可见未加入RANKL诱导的空白对照组无骨吸收。加入RANKL(终浓度50ng/mL)、M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导，无石墨烯量子点对照组骨吸收表面比例与实验组相比最大(**P<0.01)。各实验组随着石墨烯量子点浓度的提高，破骨细胞骨吸收能力显著下降，毒性剂量内最明显的石墨烯量子点终浓度为10μg/mL(**P<0.01)。

[0058] 5、石墨烯量子点抑制破骨细胞分化特异基因的表达

[0059] 分组情况：

[0060] 组1：无RANKL、M-CSF诱导，无石墨烯量子点对照组；

[0061] 组2：RANKL(终浓度50ng/mL)+M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导，无石墨烯量子点对照组；

[0062] 组3：RANKL(终浓度50ng/mL)+M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导，终浓度10μg/mL石墨烯量子点实验组；

[0063] 组4：RANKL(终浓度50ng/mL)+M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导，终浓度100μg/mL石墨烯量子点实验组。

[0064] 将BMMs细胞以1×103个/孔接种于96孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+10％胎牛血清+1％双抗(青链霉素)，以终浓度为0、10μg/mL、100μg/mL将石墨烯量子点加入各个含新鲜培养基的孔板中，同时以RANKL(终浓度50ng/mL)、M-CSF(终浓度50ng/mL)诱导BMMs细胞向破骨细胞分化，诱导培养72h后取出，弃置培养基，用Trizol裂解细胞，提取细胞内的总RNA，实时定量RT-PCR对目的基因Ctsk、c-fos、NFATc1、DC-STAMP行定量检测。引物信息如下：

[0065] Ctsk正向引物：5’-gcggcattaccaacat-3’，(SEQ ID NO.1)；

[0066] Ctsk反向引物：5’-ctggaagcaccaacga-3’，(SEQ ID NO.2)；

[0067] c-fos正向引物：5’-aggcagaaccctttga-3’，(SEQ ID NO.3)；

[0068] c-fos反向引物：5’-ggtgaccacgggagta-3’，(SEQ ID NO.4)；

[0069] NFATc1正向引物：5’-gaggagttggctcagtg-3’，(SEQ ID NO.5)；

[0070] NFATc1反向引物：5’-tagcgttccgttcgtt-3’，(SEQ ID NO.6)；

[0071] DC-STAMP正向引物：5’-gacagagtacgtagccacacgtt-3’，(SEQ ID NO.7)；

[0072] DC-STAMP反向引物：5’-agcccacagaccaaatatcaa-3’，(SEQ ID NO.8)。

[0073] 每组做独立实验5复孔，双内参(GAPDH,actin)对照。

[0074] 实验结果见图5，结果提示石墨烯量子点浓度依赖性抑制破骨细胞标志物Ctsk和DC-STMAP的表达，石墨烯量子点浓度为10μg/mL时产生抑制作用(***P<0.001)，石墨烯量子点浓度升高至100μg/mL时抑制作用进一步加强(**P<0.01)。通过进一步检测破骨细胞分化特异相关基因，筛选出变化显著的基因如下：c-fos、Ctsk、NFATc1、DC-STAMP。另外，c-fos、Ctsk、NFATc1、DC-STAMP基因表达均在石墨烯量子点浓度为10μg/mL时显著降低(**P<0.01)。可得出结论石墨烯量子点通过抑制破骨细胞分化特异性基因c-fos、Ctsk、NFATc1、DC-STAMP的表达进而抑制破骨细胞的分化，形成，成熟和骨吸收能力。

[0075] 6、石墨烯量子点明显改善OVX小鼠(卵巢切除小鼠)骨质疏松

[0076] OVX骨质疏松小鼠模型建立：取48只8周龄C57BL/6J雌性小鼠，体重为18-22g，戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉，手术组(OVX组)背侧入路切除小鼠双侧卵巢，对照组(Sham组)行假手术，暴露卵巢后缝合关闭切口。术后一周开始给予石墨烯量子点，共持续8周，每周2次。石墨烯量子点给予方法为溶解于无菌生理盐水中腹腔注射，给予剂量为10mg/kg，对照组则给予同等剂量的生理盐水。小鼠被随机分为四组：①手术组+给予石墨烯量子点组(n＝12)，②手术组+给予生理盐水对照组(n＝12)，③Sham组+给予石墨烯量子点组(n＝12)，④Sham组+给予生理盐水对照组(n＝12)。

[0077] 平均骨密度检测与骨代谢标志物检测：8周给药完成后每只小鼠分离左侧股骨，去除多余软组织，固定，心脏采血获得血液样本，通过小动物microCT检测骨微结构进行分析，管电压为50kV，管电流为0.1mA，分辨率为8mm。股骨扫描区域限定为远端干垢端，向近端的初级松质近末端区域延伸2mm。选定的感兴趣区(ROI)的3D参数用于数据分析，包括：骨矿物质密度、骨小梁数量、相对骨体积分数。

[0078] 结果如图6所示，相对于假手术组(Sham组)，OVX小鼠的骨密度和骨体积分数明显下降，同时连接密度、骨小梁数量、骨小梁厚度也有所降低。然而，通过给予石墨烯量子点后，OVX组小鼠的骨密度、骨体积分数、连接密度、骨小梁数量和骨小梁厚度相对OVX组都显著提高，结果具有统计学差异(P<0.05)。因此得出结论石墨烯量子点能够对雌激素缺乏导致的骨质疏松起到保护作用。

[0079] 综上所述，石墨烯量子点对破骨细胞的分化、形成、成熟以及骨吸收能力均有显著的抑制作用，基于该功能，石墨烯量子点可应用于骨质疏松的防治，尤其是破骨细胞活跃相关的骨质疏松症中。

[0080] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。