一种Legumain响应释放阿霉素缓释纳米制剂及制备方法与作为制备载体药物的应用

摘要

一种Legumain响应释放阿霉素缓释纳米制剂及制备方法与作为制备载体药物的应用，本发明利用肿瘤组织高表达Legumain的生物学特性，制备Legumain响应的纳米水凝胶，从而实现对肿瘤组织的双重靶向效应（主动靶向和被动靶向），减少阿霉素对正常组织的次生伤害，本发明以透明质酸作为阿霉素药物载体的基础材料，透明质酸广泛存在与生物体的正常组织中，相对其他外源材料，具有较高的生物相容性和安全性，肿瘤组织还高表达透明质酸受体，因此以透明质酸作为载体材料，还能进一步达到靶向的效果。

权利要求

1.一种Legumain响应释放阿霉素缓释纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

（1）阿霉素的多肽衍生物合成：按以下用量比例，称取Dox•HCl 1mmol和Fmoc-A-A-N(Trt)-L-OH(即PEP) 1mmol溶于50ml DMF中，加入2mmol DIPEA后，室温，避光条件下磁力搅拌15min，加入1.2mmol HATU溶液,溶于2mlDMF中，室温，避光条件下搅拌4h，然后将反应置于-20℃冷冻条件下使反应停止，再置于MWCO=100-500的透析袋内透析，产物冷冻干燥，加入20% 哌啶反应5min去除Fmoc保护基团形成DOX-LN(Trt)AA –NH2（也即DOX-PEP–NH2），然后调节PH值至7.0，并用MWCO=100-500的透析袋内透析去除小分子副产物，冻干；

（2）产物分离纯化：将步骤（1）产物用甲醇复溶，用Sephadex LH-20柱层析的方法分离纯化，用甲醇做洗脱剂洗脱，收集组分，用硅胶板薄层色谱法观测分离纯化组分，所用的展开剂为比例是1:9的甲醇：乙酸乙酯，将相同组分合并，旋干之后加入少量超纯水溶解，并冷冻干燥得到纯的产物，进行结构解析；

（3）透明质酸嫁接阿霉素多肽衍生物：取0.1molMES与0.3molNaCl于试剂瓶中，加入1L超纯水完全溶解，准备三个小烧杯，取200 ml的上步溶液于烧杯中，再分别取190mg 的透明质酸（HA）于三个烧杯中，磁力搅拌48 hr至完全溶解；

（4）往烧杯中加入9.7 mg EDC和7.2 mg NHS反应15 min后，将24 mg Dox-PEP-NH2用DMF溶解后，加入到上述烧杯中，进行交联反应，得到产物；

（5）将产物装入MWCO=14000的透析袋，超纯水透析，将透析袋中的产物取出预冻后，冷冻干燥得到HA-PEP-Dox，所述的HA-PEP-Dox的化学结构式如下：；

（6）载药纳米水凝胶制备：取100mg HA-PEP-Dox溶于20ml超纯水中，加入0.1mol的HCl，磁力搅拌至HA-PEP-Dox完全溶解，再加入100mg ADH、120mg EDC、80ml液体石蜡和1ml司班

80，用均质机均质乳化，乳化完成后避光静置反应24h，反应结束后离心，上清加入150ml异丙醇，剧烈搅拌后离心收集沉淀，沉淀加入90% 异丙醇洗涤两次离心收集沉淀，将沉淀合并后加水后置于-20℃条件下预冻，冷冻干燥得到产物，再加入20 mL三氟乙酸、20 mL二氯甲烷、800 uL三异丙基硅烷反应1 h 去除三苯甲基氨基保护基团，旋蒸去除二氯甲烷，和三氟乙酸，加水复溶，将产物装入MWCO=14000的透析袋，超纯水透析得最终产物。

2.据权利要求1所述的Legumain响应释放阿霉素缓释纳米制剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤（3）中透明质酸（HA）的Mw=1300000 Da。

3.一种权利要求1所述的制备方法制备的Legumain响应释放阿霉素缓释纳米制剂在制备抗肿瘤药物中应用。

说明书

一种Legumain响应释放阿霉素缓释纳米制剂及制备方法与作

为制备载体药物的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基于透明质酸的环境因子响应型纳米水凝胶药物缓释体系领域，具体涉及一种Legumain响应释放阿霉素缓释纳米制剂及其制备方法与作为制备抗肿瘤药物缓释载体药物的应用。

背景技术

[0002] 阿霉素是一种常用的广谱抗肿瘤化学药物，然而，阿霉素作为一种强细胞毒性药物，对正常组织（如心脏、肝、肾以及肿瘤周围正常组织等）带来不可逆转的伤害。如何实现药物靶向肿瘤组织，减少对正常组织的次生伤害，是恶性肿瘤药物治疗中的一大难点。由于恶性肿瘤组织具有“渗透和滞留增强效应”，纳米尺度下的药物-载体体系能够透过肿瘤组织的新生血管壁而不能透过正常组织的血管壁，达到“被动靶向”肿瘤组织效果，增强药物在肿瘤组织的聚集，从而减少对正常组织的伤害。然而，大量的研究表明这种仅仅依靠“被动靶向”效应，在实践中往往很难达到实际需要的靶向效率。利用肿瘤组织自身及其微环境的生物学特性（如低PH值，高还原势，过表达叶酸受体等），制备环境因子响应型纳米药物载体，达到对肿瘤组织“主动”和“被动”双重或多重靶向效应，能够极大提高药物在肿瘤组织中的聚集，从而提高药物治疗的效果。Legumain是哺乳动物中唯一的特异性水解天冬酰胺残基的酶，研究表明Legumain在许多恶性肿瘤及肿瘤相关细胞中高表达，可作为恶性肿瘤药物靶向设计的新靶点。以往利用肿瘤组织高表达Legumain蛋白酶特性的药物缓释体系包括将药物与Legumain底物肽段直接相连，并在肽段另一端连接细胞膜不透性因子，从而使药物只能Legumain高活性的肿瘤组织中才能透过细胞（如PCT）。但这种设计的产物仍然是小分子药物，不具有纳米尺度下药物-载体体系的被动靶向效应，也没有在机体中长时间缓释的效果。

发明内容

[0003] 为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种Legumain响应释放阿霉素缓释纳米制剂及其制备方法与作为制备抗肿瘤药物缓释载体药物的应用，本发明利用肿瘤组织高表达Legumain的生物学特性，制备Legumain响应的纳米水凝胶，从而实现对肿瘤组织的双重靶向效应（主动靶向和被动靶向），减少阿霉素对正常组织的次生伤害。

[0004] 本发明采用的技术解决方案是：一种Legumain响应释放阿霉素缓释纳米制剂，其化学结构式如下：

[0005] 。

[0006] 一种所述的Legumain响应释放阿霉素缓释纳米制剂的制备方法，所述的方法包括以下步骤：

[0007] （1）阿霉素的多肽衍生物合成：按以下用量比例，称取Dox· HCl 1mmol和Fmoc-A-A-N(Trt)-L-OH(即PEP) 1mmol溶于50ml DMF中，加入2mmol DIPEA后，室温，避光条件下磁力搅拌15min，加入1.2mmol HATU溶液,溶于2mlDMF中，室温，避光条件下搅拌4h，然后将反应置于-20℃冷冻条件下使反应停止，再置于MWCO=100-500的透析袋内透析，产物冷冻干燥，加入20% 哌啶反应5min去除Fmoc保护基团形成DOX-LN(Trt)AA –NH2（也即DOX-PEP–NH2），然后调节PH值至7.0，并用MWCO（截留分子量）=100-500的透析袋内透析去除小分子副产物，冻干；

[0008] （2）产物分离纯化：将步骤（1）产物用甲醇复溶，用Sephadex LH-20柱层析的方法分离纯化，用甲醇做洗脱剂洗脱，收集组分，用硅胶板薄层色谱发观测分离纯化组分，所用的展开剂为比例是1:9的甲醇：乙酸乙酯，将相同组分合并，旋干之后加入少量超纯水溶解，并冷冻干燥得到纯的产物，进行结构解析；

[0009] （3）透明质酸嫁接阿霉素多肽衍生物：取0.1molMES与0.3molNaCl于试剂瓶中，加入1L超纯水完全溶解，准备三个小烧杯，取200 ml的上步溶液于烧杯中，再分别取190mg 的透明质酸（HA）于三个烧杯中，磁力搅拌48 hr至完全溶解；

[0010] （4）往烧杯中加入9.7 mg EDC（可溶于水的碳二亚胺）和7.2 mg NHS反应15 min后，，将24 mg Dox-PEP-NH2用DMF溶解后，加入到上述烧杯中，进行交联反应，得到产物；

[0011] （5）将产物装入MWCO=14000的透析袋，超纯水透析，将透析袋中的产物取出预冻后，冷冻干燥得到HA-PEP-Dox；

[0012] （6）载药纳米水凝胶制备：取100mg HA-PEP-Dox溶于20ml超纯水中，加入0.1mol的HCl，磁力搅拌至HA-PEP-Dox完全溶解，再加入100mg ADH、120mg EDC（可溶于水的碳二亚胺）、80ml液体石蜡和1ml司班80，用均质机均质乳化，乳化完成后避光静置反应24h，反应结束后离心，上清加入150ml异丙醇，剧烈搅拌后离心收集沉淀，沉淀加入90% 异丙醇洗涤两次离心收集沉淀，将沉淀合并后加水后置于-20℃条件下预冻，冷冻干燥得到产物，再加入20 mL三氟乙酸、20 mL二氯甲烷、800 uL三异丙基硅烷反应1 h 去除三苯甲基氨基保护基团，旋蒸去除二氯甲烷，和三氟乙酸，加水复溶，将产物装入MWCO=14000的透析袋，超纯水透析得最终产物。

[0013] 所述的步骤（3）中透明质酸（HA）的Mw=1300000 Da。

[0014] 一种所述的Legumain响应释放阿霉素缓释纳米制剂作为制备抗肿瘤药物缓释载体药物的应用。

[0015] 本发明的有益效果是：本发明提供了一种Legumain响应释放阿霉素缓释纳米制剂及其制备方法与作为制备抗肿瘤药物缓释载体药物的应用，本发明利用肿瘤组织高表达Legumain的生物学特性，制备Legumain响应的纳米水凝胶，从而实现对肿瘤组织的双重靶向效应（主动靶向和被动靶向），减少阿霉素对正常组织的次生伤害，本发明以透明质酸作为阿霉素药物载体的基础材料，透明质酸广泛存在与生物体的正常组织中，相对其他外源材料，具有较高的生物相容性和安全性，肿瘤组织还高表达透明质酸受体，因此以透明质酸作为载体材料，还能进一步达到靶向的效果。

附图说明

[0016] 图1为本发明技术路线图。

[0017] 图2为本发明核磁共振图谱。

[0018] 图3为本发明纳米粒子粒径、电位分布图。

[0019] 图4为本发明透射电镜和扫描电镜图。

[0020] 图5为本发明肿瘤细胞抑制效果表。

具体实施方式

[0021] 一种Legumain响应释放阿霉素缓释纳米制剂，其化学结构式如下：

[0022] 。

[0023] 根据上述技术路线图，可将制备过程详细分为以下四个部分：

[0024] 1、Legumain底物多肽的设计合成

[0025] 根据Legumain的结构和催化特性，设计合成底物肽段，设计原则是：以天冬酰胺为中心，两侧连接若干中性氨基酸。

[0026] 2、阿霉素的多肽衍生物合成

[0027] （1）称取Dox· HCl(579 mg即1mmol)和Fmoc-A-A-N(Trt)-L-OH(即PEP：磷酸烯醇式丙酮酸)(923mg即1mmol)溶于DMF（50ml）中，加入DIPEA（即N，N-二异丙基乙胺）(0.36ml即2mmol)后，磁力搅拌15min(室温，避光)，加入HATU（化学名称为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯）溶液（0.42g HATU，即1.2mmol,溶于2mlDMF中）。搅拌4h（室温避光）。然后将反应置于-20℃冰箱中使反应停止。置于MWCO=100-500的透析袋内透析。产物冷冻干燥，加入20% 哌啶反应5min去除Fmoc保护基团形成DOX-LN(Trt)AA –NH2（也即DOX-PEP–NH2）。用冰醋酸调节PH值7.0，并用MWCO=100-500的透析袋内透析去除小分子副产物，冻干。

[0028] （2）产物分离纯化：将上述产物用甲醇复溶，Sephadex LH-20柱层析的方法分离纯化，用甲醇做洗脱剂洗脱，收集组分，用硅胶板薄层色谱发观测分离纯化组分（展开剂比例是甲醇：乙酸乙酯=1:9）。将相同组分合并，旋干之后加入少量超纯水溶解，并冷冻干燥得到纯的产物，进行结构解析。

[0029] 3、透明质酸嫁接阿霉素多肽衍生物

[0030] 1、透明质酸（HA， Mw=1300000 Da）溶解：取0.1molMES（即2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物）与0.3molNaCl于试剂瓶中，加入1L超纯水完全溶解，准备三个洗净的小烧杯，取200 ml的上步溶液于烧杯中，再分别取190mg HA于三个烧杯中，磁力搅拌至完全溶解（48 hr）。

[0031] 2、往1：20的烧杯中加入9.7 mg EDC（即可溶于水的碳二亚胺）和7.2 mg NHS（即N-羟基琥珀酰亚胺）； 15 min后， 24 mg Dox-PEP-NH2，将上述Dox-PEP-NH2用少量DMF溶解后，将24mg Dox-PEP-NH2加入到1:20的烧杯中，进行中交联反应。

[0032] 3、用透析袋透析所得产物：将产物装入透析袋（MWCO=14000），超纯水透析。

[0033] 4、冷冻干燥：将透析袋中的产物取出预冻后，冷冻干燥得到HA-PEP-Dox。

[0034] 4、载药纳米水凝胶制备

[0035] 取100mg HA-PEP（Trt）-Dox溶于20ml超纯水中，加入0.5ml 0.1mol的HCl，磁力搅拌至HA-PEP（Trt）-Dox完全溶解，再加入100mg ADH、120mg EDC、80ml液体石蜡和1ml司班80，用均质机均质乳化，乳化完成后用锡纸包住避光静置反应24h。反应结束后离心，上清加入150ml异丙醇，剧烈搅拌后离心收集沉淀；沉淀加入90% 异丙醇洗涤两次离心收集沉淀。
将沉淀合并后加水后置于-20℃冰箱中预冻，冷冻干燥得到产物。加入20 mL三氟乙酸、20 mL二氯甲烷、800 uL三异丙基硅烷反应1 h 去除三苯甲基（Trt）氨基保护基团。旋蒸去除二氯甲烷，和三氟乙酸，加水复溶，将产物装入透析袋（MWCO=14000），超纯水透析。

[0036] 5、细胞毒性检测

[0037] 用CCK-8试剂盒法对比分析Legumain响应HA-PEP-Dox纳米粒子与游离阿霉素对肿瘤细胞和正常体细胞的抑制效果。

[0038] 6、实验结果分析

[0039] 核磁共振图谱（图2）可以看出表明我们已经成功合成了HA-PEP-DOX，交联后形成了粒径为360 nm，电位-24 mV的纳米粒子，且具有较窄的粒径分布(PDI=0.225)(如图3所示)。在透射电镜和扫描电镜下观察可发现该纳米粒子具有较好的球形结构（如图4所示），大小较均一。阿霉素（DOX）纳米粒子包载后，显著促进阿霉素的抗癌效果（如图5所示）[0040] 7、结论

[0041] 1）本发明利用肿瘤组织高表达Legumain的生物学特性，制备Legumain响应的纳米水凝胶，从而实现对肿瘤组织的双重靶向效应（主动靶向和被动靶向），减少阿霉素对正常组织的次生伤害；

[0042] （2）本发明以透明质酸作为阿霉素药物载体的基础材料，透明质酸广泛存在与生物体的正常组织中，相对其他外源材料，具有较高的生物相容性和安全性；

[0043] （3）肿瘤组织还高表达透明质酸受体，因此以透明质酸作为载体材料，还能进一步达到靶向的效果。