一种新的血清代谢物的组合及其作为肝癌诊断标志物的用途

摘要

本发明公开了一种新的血清代谢物的组合及其作为标志物在制备早期肝癌诊断试剂盒中的用途。所述血清代谢物组合包括：甘氨胆酸、色氨酸、组氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、溶血磷脂酰胆碱16∶1和苯丙氨酰色氨酸，该血清代谢物的组合可用于肝癌的早期诊断，具有检测成本低，重复性和诊断灵敏度高的特点，并与传统的临床诊断标志物血清甲胎蛋白(AFP)具有良好的互补性。

权利要求

1.一种能够用于肝癌早期诊断的血清代谢物的组合，其由下述血清代谢物组成：甘氨胆酸、色氨酸、组氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、溶血磷脂酰胆碱16∶1和苯丙氨酰色氨酸。

2.权利要求1所述的血清代谢物的组合在制备早期肝癌诊断试剂盒中的用途，其中所述试剂盒包含血清样品提取溶液和检测所述血清代谢物的浓度所需要的内标，其中诊断步骤包括：(1)通过检测血清样品中甘氨胆酸、组氨酸、胆碱、溶血磷脂酰胆碱16∶1和苯丙氨酰色氨酸的浓度来诊断受试者是否患有肝病，并且(2)通过检测步骤(1)中被诊断为患有肝病的受试者的血清样品中甘氨胆酸、色氨酸、苯甲酰胺、尿苷和苯丙氨酰色氨酸的浓度来确定所述受试者是否是肝癌患者。

3.根据权利要求2所述的用途，其中检测权利要求1所述的各种血清代谢物的内标为D5-色氨酸、D3-肉碱、D5-甘氨胆酸、D8-缬氨酸、LPC 19∶0和D3-脂肪酸18∶0。

4.根据权利要求2所述的用途，其中步骤(1)区分肝病患者和健康受试者的逻辑回归判别公式1为：Prob＝1/(1+e-X)，

其中Prob表示受试者患有肝病的概率，X＝9.876-0.509×苯丙氨酰色氨酸浓度值+

2.339×甘氨胆酸浓度值-0.482×组氨酸浓度值-0.454×溶血磷脂酰胆碱16∶1浓度值-

0.566×胆碱浓度值，

其中血液样品中各代谢物的浓度单位为μg/ml，

其中截点值为0.5，大于该截点值的Prob指示所述受试者患有肝病。

5.根据权利要求2所述的用途，其中步骤(2)区分肝硬化患者和肝癌患者的逻辑回归判别公式2为：Prob’＝1/(1+e-X’)，

其中Prob'表示受试者患有肝癌的概率，X’＝7.709-0.413×苯丙氨酰色氨酸浓度值-

1.803×甘氨胆酸浓度值-0.118×色氨酸浓度值-10.983×苯甲酰胺浓度值-1.455×尿苷浓度值，其中血液样品中各代谢物的浓度单位为μg/ml，

其中截点值为0.5，大于该截点值的Prob’指示所述受试者患有肝癌。

6.一种早期肝癌诊断试剂盒，所述试剂盒包含检测血液样品中权利要求1所述的每种血清代谢物的浓度的试剂和内标，其中所述内标为D5-色氨酸、D3-肉碱、D5-甘氨胆酸、D8-缬氨酸、LPC 19∶0和D3-脂肪酸18∶0。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，所述试剂盒基于液相色谱质谱联用技术来检测每种血清代谢物的浓度。

说明书

一种新的血清代谢物的组合及其作为肝癌诊断标志物的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种新的组合标志物在制备早期肝癌诊断试剂盒中的应用。属于分析化学及临床医学领域。

背景技术

[0002] 肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是指发生于肝脏的恶性肿瘤，据统计每年肝癌新发患者约60万，其发病率居恶性肿瘤的第五位，致死率居第三位。肝癌的病因复杂，大部分是由于肝炎病毒感染引起的，在我国肝癌多在乙肝肝硬化的基础上发展而来。肝癌由于其早期症状不明显难以被发现，而对于中晚期肝癌又缺乏有效的治疗，其5年存活率为7％，而到IV阶段仅为3.9％，因此早发现、早治疗对肝癌极其重要。目前，肝癌的诊断主要有影像学检查和血清甲胎蛋白(AFP)检测，但是前者检查作用有限，往往到了中、晚期才能够发现和确诊，缺少预警价值；后者其诊断的敏感性和特异性较低，检出率一般只有50％-
75％左右。因此，为了提高肝癌早期临床诊断的灵敏度和特异性，开发新的诊断方法势在必行。

[0003] 有研究表明肝癌的发生和发展与多种小分子代谢紊乱密切相关，例如：氨基酸代谢，脂质代谢，胆汁酸代谢等等。本发明首次发现血清中的甘氨胆酸、色氨酸、组氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、溶血磷脂酰胆碱16：1和苯丙氨酰色氨酸苯丙氨酰色氨酸可以作为一种新的肝癌标志物组合，并采用步进式判别法(见图1)，用于辅助诊断早期肝癌。甘氨胆酸是种甘氨酸结合型胆汁酸的胆汁，胆汁酸是一种类固醇酸，由胆固醇在肝脏中合成，可加速脂肪的代谢和脂溶性的维生素和固醇类的吸收，同时它也被认为是一种多功能的重要信号分子，在能量动态平衡、磷脂代谢、糖代谢以及细胞增殖或凋亡等整合调节中起重要调节作用[1]。胆碱是卵磷脂的基本组成部分，它是乙酰胆碱的合成前体，同时也是很多代谢过程中的甲基供体(如脂质代谢)，目前它也被认为是一个重要的维生素，涉及到脂质代 谢和葡萄糖体内平衡调节[2、3]；色氨酸是人体中常见的必需氨基酸和生糖氨基酸，有研究报道肿瘤患者中色氨酸代谢异常，可能是由于机体对恶性肿瘤做出抵抗性免疫应答或者是恶性肿瘤的免疫逃逸机制导致色氨酸的损耗[4、5]；组氨酸是一种蛋白氨基酸，在机体中组氨酸利用其咪唑环具有清除活性氧的特性来保护有炎症的组织和器官，具有抗氧化，抗炎和氧化应激的特性[6]；尿苷涉及到嘧啶代谢；苯甲酰胺是苯甲酸降解的中间物；溶血磷脂酰胆碱类代谢物对病理生理学的刺激非常灵敏，在细胞增殖、肿瘤细胞入侵和促炎、抗炎[7、8]等生理过程起着重要调控作用。鉴于此，测定血清中以上8种小分子代谢物的含量变化情况有利于了解肝细胞的代谢变化，以便辅助诊断早期肝癌。

发明内容

[0004] 本发明的目的是为克服肝癌早期隐蔽性强而诊断难的问题，提供一种新的血清代谢物组合，该代谢物组合可作为标志物应用于肝癌的早期诊断。

[0005] 本发明首次公开了一种能够用于肝癌早期诊断的血清代谢物的组合，该组合包括甘氨胆酸、色氨酸、组氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、溶血磷脂酰胆碱16：1和苯丙氨酰色氨酸8种血清小分子。优选地，所述组合由甘氨胆酸、色氨酸、组氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、溶血磷脂酰胆碱16：1和苯丙氨酰色氨酸这8种血清小分子组成。

[0006] 换言之，本发明提供一种用于肝癌早期诊断的组合的标志物，其包括甘氨胆酸、色氨酸、组氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、溶血磷脂酰胆碱16：1和苯丙氨酰色氨酸8种血清小分子，优选地，其由甘氨胆酸、色氨酸、组氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、溶血磷脂酰胆碱16：1和苯丙氨酰色氨酸这8种血清小分子组成。

[0007] 该组合的质谱靶向分析离子信息如表1所示。

[0008] 表1.8种组合标志物的靶向分析的信息表

[0009]

[0010]

[0011] 根据上述小分子代谢物的组合，采用步进式判别法(见图1)，以逻辑回归公式可应用于早期肝癌的诊断，包括对肝癌、肝硬化患者与健康人进行区分以及对肝癌及肝硬化患者进行判别。

[0012] 本发明还涉及甘氨胆酸、色氨酸、组氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、溶血磷脂酰胆碱16：1和苯丙氨酰色氨酸的血清代谢物组合在制备早期肝癌诊断试剂盒中的应用。

[0013] 本发明还提供一种早期肝癌诊断试剂盒，所述试剂盒包含检测血液样品中权利要求1所述的每种血清代谢物的浓度的试剂和内标。

[0014] 其中所述内标为D5-色氨酸、D3-肉碱、D5-甘氨胆酸、D8-缬氨酸、LPC 19：0和D3-脂肪酸18：0。

[0015] 根据上述血清代谢物组合标志物的试剂盒采用基于液相色谱质谱联用的靶向方法检测，试剂盒中包含的提取溶剂内标及其浓度见表2。

[0016] 表2.提取剂中内标及其浓度

[0017]

[0018] 根据该试剂盒的检测方法如下：

[0019] a)血清样本预处理方法：

[0020] 血样在4℃下解冻，取80μL血清样本，加入320μL含有试剂盒内标 的乙腈提取液沉淀蛋白：涡旋30-90s，静置15-30mins后，4℃条件下10000-14000rpm转速离心10-15mins，取上清冷冻干燥。

[0021] b)目标代谢物靶向检测方法如下：

[0022] 分离系统为Waters超高效液相色谱仪，流动相流速为0.35ml/min，柱温为50℃，进样量为5ul；正离子模式：色谱柱为C8柱，洗脱液A相为0.1％(v/v)甲酸的水溶液、B相为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液；负离子模式：色谱柱为T3柱，流动相A为含5mM的碳酸氢铵水溶液，B相为含5mM的碳酸氢铵的甲醇溶液；检测器为适合定量分析的单四极杆质谱或串联四级杆质谱仪。待检测的离子对及其相关的碰撞电压见表1。

[0023] c)基于质谱检测数据的判断模型：首先，基于正常对照组和肝病组(肝硬化和肝癌组)数据建立了判别正常人和肝病组的模型I；回归方程如下式1：

[0024] 模型I

[0025] X＝9.876-0.509*A+2.339*B-0.482*H-0.454*G-0.566*E

[0026] Prob(肝病)＝1/(1+e-X)(截点值(Cutoff)＝0.5)  (式1)

[0027] 其次基于肝硬化组和肝癌组数据建立了判别肝硬化组和肝癌组的模型II，回归方程如下式2：

[0028] 模型II

[0029] X’＝7.709-0.413*A-1.803*B-0.118*C-10.983*D-1.455*F

[0030] Prob’(肝癌)＝1/(1+e-X’)(截点值(Cutoff)＝0.5)  (式2)

[0031] 其中A、B、C、D、E、F、G、H分别为苯丙氨酰色氨酸、甘氨胆酸、色氨酸、苯甲酰胺、胆碱、尿苷、溶血磷脂酰胆碱16：1、和组氨酸的在取自受试者的血清样品中的浓度值(ug/ml)，Prob(肝病)表示诊断为肝病的概率，截点值(Cutoff)＝0.5，即当Prob(肝病)值大于0.5时，诊断所述受试者患有肝病；Prob’(肝癌)表示诊断为肝癌的概率，截点＝0.5，即当Prob’(肝癌)值大于0.5时，诊断所述受试者患有肝癌。

[0032] 由此，本发明提供一种诊断受试者中的早期肝癌的方法，所述方法包括：

[0033] (1)从所述受试者采集血液样品，提取血清，加入内标，利用质谱法 定量血清样品中的甘氨胆酸、组氨酸、胆碱、溶血磷脂酰胆碱16：1和苯丙氨酰色氨酸的浓度值，单位为ug/ml，利用逻辑回归判别公式1计算所述受试者患有肝病的可能性：

[0034] 逻辑回归判别公式1：

[0035] Prob(肝病概率)＝1/(1+e-X)，

[0036] 其中X＝9.876-0.509×苯丙氨酰色氨酸浓度值+2.339×甘氨胆酸浓度值-0.482×组氨酸浓度值-0.454×溶血磷脂酰胆碱16：1浓度值-0.566×胆碱浓度值，

[0037] 其中截点值为0.5，大于该截点值的Prob(肝病概率)指示所述受试者患有肝病；

[0038] (2)定量步骤(1)中被诊断为患有肝病的受试者的血清样品中甘氨胆酸、色氨酸、苯甲酰胺、尿苷和苯丙氨酰色氨酸的浓度值，单位为ug/ml，利用逻辑回归判别公式2计算所述受试者患有肝癌的可能性：

[0039] 逻辑回归判别公式2：

[0040] Prob’(肝癌概率)＝1/(1+e-X’)，

[0041] 其中X’＝7.709-0.413×苯丙氨酰色氨酸浓度值-1.803×甘氨胆酸浓度值-0.118×色氨酸浓度值-10.983×苯甲酰胺浓度值-1.455×尿苷浓度值

[0042] 其中截点值为0.5，大于该截点值的Prob’(肝病概率)指示所述受试者患有肝癌。

[0043] 在该诊断方法中，所用的内标为D5-色氨酸、D3-肉碱、D5-甘氨胆酸、D8-缬氨酸、LPC 19：0和D3-脂肪酸18：0。

[0044] 因此，本发明提供下述方案：

[0045] 1.一种能够用于肝癌早期诊断的新的血清代谢物的组合，其包含下述血清代谢物：甘氨胆酸、色氨酸、组氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、溶血磷脂酰胆碱16：1和苯丙氨酰色氨酸。

[0046] 2.第1项所述的血清代谢物的组合在制备早期肝癌诊断试剂盒中的用途，其中所述试剂盒包含血清样品提取溶液和检测所述血清代谢物的浓度所需要的内标，其中诊断步骤包括：

[0047] (1)通过检测血清样品中甘氨胆酸、组氨酸、胆碱、溶血磷脂酰胆 碱16：1和苯丙氨酰色氨酸的浓度来诊断受试者是否患有肝病，并且

[0048] (2)通过检测步骤(1)中被诊断为患有肝病的受试者的血清样品中甘氨胆酸、色氨酸、苯甲酰胺、尿苷和苯丙氨酰色氨酸的浓度来确定所述受试者是否是肝癌患者。

[0049] 3.根据第2项所述的用途，其中检测第1项所述的各种血清代谢物的内标为D5-色氨酸、D3-肉碱、D5-甘氨胆酸、D8-缬氨酸、LPC 19：0和D3-脂肪酸18：0。

[0050] 4.根据第2项所述的用途，其中步骤(1)区分肝病患者和健康受试者的逻辑回归判别公式1为：

[0051] Prob(肝病概率)＝1/(1+e-X)，

[0052] 其中X＝9.876-0.509×苯丙氨酰色氨酸浓度值+2.339×甘氨胆酸浓度值-0.482×组氨酸浓度值-0.454×溶血磷脂酰胆碱16：1浓度值-0.566×胆碱浓度值，

[0053] 其中血液样品中各代谢物的浓度单位为ug/ml，

[0054] 其中截点值为0.5，大于该截点值的Prob(肝病概率)指示所述受试者患有肝病。

[0055] 5.根据第2项所述的用途，其中步骤(2)区分肝硬化患者和肝癌患者的逻辑回归判别公式2为：

[0056] Prob’(肝癌概率)＝1/(1+e-X’)，

[0057] X’＝7.709-0.413×苯丙氨酰色氨酸浓度值-1.803×甘氨胆酸浓度值-0.118×色氨酸浓度值-10.983×苯甲酰胺浓度值-1.455×尿苷浓度值

[0058] 其中血液样品中各代谢物的浓度单位为ug/ml，

[0059] 其中截点值为0.5，大于该截点值的Prob’(肝病概率)指示所述受试者患有肝癌。

[0060] 6.一种早期肝癌诊断试剂盒，所述试剂盒包含检测血液样品中第1项所述的每种血清代谢物的浓度的试剂和内标。

[0061] 7.根据第6项所述的试剂盒，其中所述内标为D5-色氨酸、D3-肉碱、D5-甘氨胆酸、D8-缬氨酸、LPC 19：0和D3-脂肪酸18：0。

[0062] 8.根据第6项所述的试剂盒，所述试剂盒利用基于液相色谱质谱联用技术来检测每种血清代谢物的浓度。

[0063] 9.一种诊断受试者中的早期肝癌的方法，所述方法包括：

[0064] (1)从所述受试者采集血液样品，提取血清，加入内标，利用质谱法定量血清样品中的甘氨胆酸、组氨酸、胆碱、溶血磷脂酰胆碱16：1和苯丙氨酰色氨酸的浓度值，单位为ug/ml，利用逻辑回归判别公式1计算所述受试者患有肝病的可能性：

[0065] 逻辑回归判别公式1：

[0066] Prob(肝病概率)＝1/(1+e-X)，

[0067] 其中X＝9.876-0.509×苯丙氨酰色氨酸浓度值+2.339×甘氨胆酸浓度值-0.482×组氨酸浓度值-0.454×溶血磷脂酰胆碱16：1浓度值-0.566×胆碱浓度值，

[0068] 其中截点值为0.5，大于该截点值的Prob(肝病概率)指示所述受试者患有肝病；

[0069] (2)定量步骤(1)中被诊断为患有肝病的受试者的血清样品中甘氨胆酸、色氨酸、苯甲酰胺、尿苷和苯丙氨酰色氨酸的浓度值，单位为ug/ml，利用逻辑回归判别公式2计算所述受试者患有肝癌的可能性：

[0070] 逻辑回归判别公式2：

[0071] Prob’(肝癌概率)＝1/(1+e-X’)，

[0072] 其中X’＝7.709-0.413×苯丙氨酰色氨酸浓度值-1.803×甘氨胆酸浓度值-0.118×色氨酸浓度值-10.983×苯甲酰胺浓度值-1.455×尿苷浓度值

[0073] 其中截点值为0.5，大于该截点值的Prob’(肝病概率)指示所述受试者患有肝癌，[0074] 其中所用的内标为D5-色氨酸、D3-肉碱、D5-甘氨胆酸、D8-缬氨酸、LPC 19：0和D3-脂肪酸18：0。

[0075] 本发明具有的效果是：首次将甘氨胆酸、色氨酸、组氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、LPC 16：1和苯丙氨酰色氨酸8种血清小分子代谢物组合，并采用步进式判别法(见图1)，应用于早期肝癌的诊断，具有高灵敏、高特异性特征，并且通过发现、验证、再验证在三批共计579例临床样本验证了该组合标志物稳定性和可靠性。同时，该组合标志物可以与传统的标志物AFP互补，联合使用能够辅助诊断早期肝癌，具有临床开发应用的价 值。

附图说明

[0076] 从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

[0077] 图1显示8种血清小分子组合对早期肝癌诊断的步进式判别图，其中甘氨胆酸、组氨酸、胆碱、溶血磷脂酰胆碱16：1(LPC(16：1))和苯丙氨酰色氨酸组成“组合标志物I”，甘氨胆酸、色氨酸、苯甲酰胺、尿苷和苯丙氨酰色氨酸组成“组合标志物II”，所述“组合标志物I”用来判断受试者是否患有肝病，所述“组合标志物II”进一步区分所述受试者是患有肝硬化还是肝癌。

[0078] 图2显示实施例1中甘氨胆酸(GCA)、色氨酸(Tryptophan)、尿苷(Uridine)、胆碱(Choline)、苯甲酰胺(Benzamide)、溶血磷脂酰胆碱16：1(LPC(16：1)、组氨酸(Histidine)和苯丙氨酰色氨酸(Phenylalanyl-Tryptophan)在各实验组的检测浓度值。

[0079] 图3显示实施例1中各组合标志物在各个批次实验中判别健康对照组和肝病组(肝硬化和肝癌组)的诊断结果图，以及在判别肝硬化组和肝癌组的诊断结果图。

[0080] 图4显示实施例2中甘氨胆酸(GCA)、色氨酸(Tryptophan)、尿苷(Uridine)、胆碱(Choline)、苯甲酰胺(Benzamide)、溶血磷脂酰胆碱16：1(LPC(16：1)、组氨酸(Histidine)和苯丙氨酰色氨酸(Phenylalanyl-Tryptophan)在各实验组的检测浓度值。

[0081] 图5显示实施例2中各组合标志物在各个批次实验中判别健康对照组和肝病组(肝硬化和肝癌组)的诊断结果图，以及在判别肝硬化组和肝癌组的诊断结果图。

[0082] 图6显示实施例3中甘氨胆酸(GCA)、色氨酸(Tryptophan)、尿苷(Uridine)、胆碱(Choline)、苯甲酰胺(Benzamide)、溶血磷脂酰胆碱16：1(LPC(16：1)、组氨酸(Histidine)和苯丙氨酰色氨酸(Phenylalanyl-Tryptophan)在各实验组的检测浓度值。

[0083] 图7显示实施例3中各组合标志物在各个批次实验中判别健康对照组 和肝病组(肝硬化和肝癌组)的诊断结果图，以及在判别肝硬化组和肝癌组的诊断结果图。

具体实施方式

[0084] 下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。

[0085] 实施例1

[0086] 1.血清样品收集采集前，纳入志愿者签署知情同意书。

[0087] 正常对照、肝硬化和原发性肝癌组纳入标准：参考《黄家驷外科学(第7版)》人民卫生出版社2008北京

[0088] 健康对照组纳入标准：正常体检人群(40-70岁之间)。体检身体健康者。

[0089] 相同条件下采用血清样本：40例正常人、79例肝硬化和80例肝癌患者的血清样本；入院后24小时内留取患者空腹抗凝血及促凝血各4ml，半小时之内分离血清，置于-80℃冰箱保存，备检。

[0090] 2.分析方法

[0091] 2.1血清样本预处理

[0092] 血样在4℃下解冻，取80μL血清样本，加入320μL含有多个内标的乙腈提取液沉淀蛋白：涡旋30-90s，静置15-30mins后，4℃条件下10000-14000rpm转速离心10-15mins，取上清冷冻干燥。提取液中加入的内标及相应的浓度见表2。

[0093] 2.2超高效液相色谱质谱分析

[0094] (1)液相条件：色谱仪为WatersAcQuity超高效液相色谱(Waters，Ireland)；正离子模式：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC@BEH C8(1.7um，2.1mm X100mm)(Waters，Ireland)；流动相A为流动相：A相为含0.1％(v/v)甲酸水溶液，B相为0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液；洗脱梯度：初始流动相为10％B相，0-3min线性变化到40％B相，3min-15min线性变化到100％B，相保持5min，0.1min内线性降至2％B相平衡3mins；柱温为50℃；流动相流速为0.35mL/min；进样量为5μL。负离子模式： 色谱柱为Waters ACQUITY UPLC@HSS T3(1.7um，
2.1mm X100mm)(Waters，Ireland)；流动相A为流动相：A相为含5mM的碳酸氢铵水溶液，B相为含5mM的碳酸氢铵的甲醇溶液；洗脱梯度：初始流动相为2％B相，0-3min线性变化到40％B相，3min-12min线性变化到100％B，相保持4min，0.1min内线性降至2％B相平衡4mins；柱温为50℃；流动相流速为0.35mL/min；进样量为5μL。实际应用时流动相梯度总时间可以适当的缩短，以减少检测的时间。

[0095] (2)质谱条件：质谱为QTRAP 5500质谱(美国AB Sciex公司)。气帘气压力为0.241MPa，Gas1、Gas2压力均为0.276Mpa，正离子模式电喷雾离子源温度为550℃，喷雾电压为5500V；负离子模式电喷雾离子源温度为450℃，喷雾电压为-4500V；待检测的离子对及其相关的碰撞电压见表1。

[0096] 2.3血清测试结果及辅助诊断方法

[0097] 各组人群中色氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、LPC(16：1)、组氨酸和苯丙氨酰色氨酸，甘氨胆酸含量值见图2和表3。同时，将各标志物的含量(表3)带入对应的回归方程式(及，式1或式2)中，计算出概率，概率值及分布见图3。采用的截点值为0.5，即概率大于0.5则认为是肝病或肝癌，模型I在对正常人和肝病的诊断中，其正确诊断率分别为97.5％(39/40)、
97.5％(155/159)；模型II在对肝硬化和肝癌诊断中，其正确诊断率为96.2％(76/79)、
97.5％(78/80)，组合标志物的AUC＝0.947，灵敏度和特异性也比较高，分别为94.9％和
85.4％(图3)。

[0098]

[0099]

[0100]

[0101]

[0102]

[0103]

[0104]

[0105] 实施例2

[0106] 为了验证组合标志物对早期肝癌诊断的稳定性和可靠性，加入了肝癌中肿瘤直径小的小肝癌样本进行验证。此次实验所用分析方法、仪器和试剂都和实施例1中的完全一致。

[0107] 1.血清样品收集采集前，纳入志愿者签署知情同意书。

[0108] 正常对照、肝硬化和原发性肝癌组纳入标准：参考《黄家驷外科学(第7版)》人民卫生出版社2008北京

[0109] 健康对照组纳入标准：正常体检人群(40-70岁之间)。体检身体健康者。

[0110] 相同条件下采用血清样本：40例正常人、65例肝硬化和75例小肝癌患者和29例大肝癌患者的血清样本；入院后24小时内留取患者空腹抗凝血及促凝血各4ml，半小时之内分离血清，置于-80℃冰箱保存，备检。

[0111] 2.血清测试及辅助诊断结果

[0112] 相对于非肝癌组，色氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、LPC(16：1)、组氨酸和苯丙氨酰色氨酸显著性下降(见图4和表4)。同时，将各标志物的含量(表4)带入对应的回归方程式中，计算出概率(概率值及分布见图5)，采用的截点值值为0.5，即概率大于0.5则认为是肝病或肝癌或小肝癌，模型I在对正常人和肝病的诊断中，其正确诊断率分别为75％(30/40)、98.8％(2/169)，模型II在对肝硬化和肝癌诊断中，其正确诊断率为93.8％(61/65)、96.2％(100/104)，其中小肝癌的诊断正确率达96％(72/75)，可见，该组合标准物对于小粒径的肝癌肿瘤的正确诊断也很高；同时在肝癌患者中有42例病人是AFP假阴性，即血清甲胎蛋白(AFP)的浓度低于20ug/mL(截点值)，而使用模型II判别，这42人中仅有1人的Prob’(肝癌)＜0.5(截点值)；另一方面，在肝癌患者中有4例病人的Prob’(肝癌)＜0.5，而这4人中仅1人的(AFP)的浓度低于20ug/mL，可见新的组合标志物可以与传统的血清标志物AFP在诊断早期肝癌时具有良好的互补性(图5)。

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[0121] 实施例3

[0122] 为了验证组合标志物对早期肝癌诊断的稳定性和可靠性，加入了与实施例1、2不同地域的肝癌患者进行了验证实验II。此次实验所用分析方法、仪器和试剂都和实施例1中的完全一致。

[0123] 1.血清样品收集采集前，纳入志愿者签署知情同意书。

[0124] 正常对照、肝硬化和原发性肝癌组纳入标准：参考《黄家驷外科学(第7版)》人民卫生出版社2008北京

[0125] 健康对照组纳入标准：正常体检人群(40-70岁之间)。体检身体健康者。

[0126] 相同条件下采用血清样本：31例正常人、48例肝硬化和92例大肝癌患者的血清样本；入院后24小时内留取患者空腹抗凝血及促凝血各4ml，半小时之内分离血清，置于-80℃冰箱保存，备检。

[0127] 2.血清测试及辅助诊断结果

[0128] 相对于非肝癌组，色氨酸、尿苷、胆碱、苯甲酰胺、LPC(16：1)、组氨酸，苯丙氨酰色氨酸及甘氨胆酸显著性下降(见图6和表5)。同时，将各标志物的含量(表5)带入对应的回归方程式中，计算出概率，概率值及分布见图7。采用的截点值为0.5，即概率大于0.5则认为是肝病或肝癌，模型I在对正常人和肝病的诊断中，其正确诊断率分别为77.1％(24/31)、95.4％(134/140)；模型II在对肝硬化和肝癌诊断中，其正确诊断率为56.3％(27/48)、
80.8％(84/92)。同时，在肝癌患者中有36例病人呈AFP假阴性，即血清甲胎蛋白(AFP)的浓度低于20ug/mL(截点值)，而使用模型II判断，这36人中仅有4人的Prob’(肝癌)＜0.5(截点值)；另一方面，在肝癌患者中有8例病人的Prob’(肝癌)＜0.5，而这8人中有4人的(AFP)的浓度低于20ug/mL，可见新的组合标志物与传统的血清标志物AFP在诊断早期肝癌时具有良好的互补性(图7)。

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[0136] 应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

[0137] 参考文献

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