本发明涉及一种快速、简便、灵敏的黄热病毒((YellowFever Virus))IgG抗体的间接免疫荧光检测方法。本发明的检测方法原理是以间接免疫荧光法检测人抗黄热病毒病毒抗体。载玻片上是包被能表达黄热病毒NS1蛋白的293F细胞，阳性对照或阳性样品中抗NS1蛋白抗体在结合到细胞表面后，用荧光染料标记二抗捕获后在荧光显微镜下观察，可见绿色的荧光细胞，判定为黄热病毒IgG抗体阳性。若样本中无黄热病毒抗体，细胞不显示荧光。检测方法包括如下步骤：293F细胞载波片的制备，载波片上加入样本，荧光标记二抗的结合，洗涤，荧光检测，结果判定。本发明能对黄热病毒进行快速灵敏的检测，操作简便，通过本发明可大幅度提高出入境口岸一线检验检疫人员的检测效率，对防控外来烈性传染病的输入具有重要意义。
1.一种非诊断目的的黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，其特征在于：包括以下检测步骤：(1)表达黄热病毒NS1蛋白的293F细胞载玻片的制备:
将Expi293F细胞经贴壁培养至细胞状态良好时，经胰酶消化后细胞计数，将细胞密度调整至4X105个/毫升后，在腔室玻片Chamber Slide板上以250ul/孔加入细胞悬液，轻柔摇晃，置于细胞培养箱中培养24小时；此时细胞基本铺满孔底，再用黄热病毒NS1蛋白的全长基因表达质粒进行细胞转染；用脂质体2000转染质粒，以1ug质粒/2ul脂质体2000转染试剂的比例进行；细胞转染48小时后，得到表达的黄热病毒NS1蛋白，用多聚甲醛进行细胞固定，固定完成再进行5％山羊血清封闭，封闭后用10％甘油封片2-8℃冷藏保存；所用的黄热病毒为病毒株AEQ35299；
(3)表达黄热病毒NS1蛋白的293F细胞载玻片的平衡：将表达有黄热病毒NS1蛋白的
293F细胞载玻片Chamber Slide从2-8℃取至室温中，放置10分钟；
(4)加入待测样品、阳性对照、阴性对照；所述的阳性对照为抗黄热病毒NS1蛋白的兔阳性血清，其制备包括如下步骤：将表达黄热病毒毒株AEQ35299蛋白的全长基因经分子克隆的方法克隆到IneratorTM载体后，用基因免疫的方法免疫新西兰大白兔，经首次免疫、二次免疫后，耳静脉采血收集少量抗血清，经间接ELISA的方法检测抗血清的效价，效价检测>1:
64000后进行加强免疫，二次免疫间隔3周后，10天之后收集抗血清；所述的阴性对照为未免疫新西兰大白兔,制备过程同阳性对照；
(5)吸掉上清液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重复一次；
(7)吸掉样品溶液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重复一遍；
(8)结果判定：将载玻片Chamber Slide置于荧光显微镜下观察荧光,判定结果，有绿色荧光的为阳性反应，无绿色荧光则未有免疫反应，表示样本中不含有黄热病毒抗体。
2.根据权利要求1所述的非诊断目的的黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤(2)所述的稀释液成分为5％山羊血清溶于0.01M的磷酸盐缓冲液PBS中，所述的洗液成分为0.05％吐温20溶于0.01M磷酸盐缓冲液中。
3.根据权利要求1所述的非诊断目的的黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤(4)所述阳性对照用稀释液1：100稀释，阴性对照用稀释液1：100稀释。
4.根据权利要求1所述的非诊断目的的黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤(4)所述的待测样品、阳性对照、阴性对照，每孔加入200ul，盖上Chamber Slide盖子，室温放置60分钟。
5.根据权利要求1所述的非诊断目的的黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤(6)中所述的荧光标记二抗为羊抗兔与羊抗人二抗混合液。
6.根据权利要求1所述的非诊断目的的黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤(6)中所述的荧光二抗混合液加入前用样品稀释液1:2000倍稀释。
7.根据权利要求1所述的非诊断目的的黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤(6)中所述的荧光二抗每孔加入200ul，室温避光放置1小时，此步骤之后做避光处理。
8.根据权利要求1所述的非诊断目的的黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，其特征在于：与在载玻片外进行与步骤(1)同步的黄热病毒NS1蛋白制备与纯化验证实验，包括如下过程：将Expi293FTM细胞在Expi293FTM表达培养基中进行悬浮培养，待细胞浓度增长到合适浓度时进行细胞转染实验；细胞使用ExpiFectamineTM293转染试剂进行细胞转染；以30ml的培养体系进行转染时，取两个1.5ml的离心管A/B，A管中加入RPMI1640细胞培养液、病毒株AEQ35299 DNA 30ug，总体积1.5ml，轻柔混匀；B管中加入RPMI1640细胞培养液、TMExpiFectamine 转染试剂80ul，总体积1.5ml，轻柔混匀，室温孵育5分钟后，把A加入B中，轻柔混匀，室温孵育20分钟加入细胞中；在转染后96小时左右后收集蛋白；在蛋白制备过程中无需改变培养基或添加培养基，收集的细胞上清经Ni柱纯化，得到表达的黄热病毒NS1蛋白。
一种黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法。
[0002] 背景介绍
[0003] 随着我国经济贸易的飞速发展，日益频繁的国际贸易打破了疾病爆发流行的生态地域限制，已经成为传播传染病及其媒介生物的重要途径，加剧了传染病跨国界传播的风险。根据国家质检总局的统计,每年通过国境口岸的出入境人数超过2亿人次。传染病在国际间的广泛传播与流行,新发与再发传染病的不断出现,已越来越成为全球重大的公共卫生问题,因而现阶段国境口岸应对输入性传染病疫情正面临着巨大的挑战和考验。
[0004] 黄热病病毒为RNA病毒，具有嗜内脏性及嗜神经性，感染蚊叮咬人后，将含黄热病病毒的唾液注入人体皮下毛细血管，迅速扩散到局部淋巴结，不断繁殖，数日后进入血流，形成病毒血症。然后病毒定位于肝、肾、脾、心、骨髓和淋巴结等组织器官，即使血中病毒已经消失，而组织器官中病毒可依然存在。由于病毒的直接损害作用，引起广泛组织病变，其中肝脏病理变化最具诊断的特异性。城市型黄热病的主要传染源是病人，起病3天内传染性最强；丛林型黄热病的主要传染源是热带丛林中的猴子以及其他灵长类动物。传播媒介城市型黄热病的主要传播媒介为埃及伊蚊，丛林型黄热病的传播媒介主要有趋血蚊属，煞蚊属，蚊吸血感染后，37℃经4天即能传播。受感染的蚊可终生带毒，并可经卵传递。易感人群无免疫力的人群对黄热病普遍易感，隐性感染或发病后均能获得持久免疫力，其体内产生的中和抗体可保持终身，未发现再感染者。流行区内成人大多有免疫力，故以儿童发病占多数。黄热病是黄热病毒引起的急性传染病。临床以发热、黄疽、蛋白尿、相对缓脉和出血等为特征。1907年黄热病被《国际卫生公约》列为国际检疫传染病。近十年来，在非洲和拉丁美洲的十几个国家先后发生了数次黄热病散发流行，而在我国尚无发病。
[0005] 黄热病毒在我国尚未流行,但随着我国商贸、旅游业的快速发展,境内外人员交往日益密切,以及动物的进口等影响,烈性病毒输入的危险性日益增高，因此,尽快建立快速简便、特异敏感的检测方法防范黄热病毒输入并控制其暴发流行具有重要意义。对黄热病毒的检测方法目前大部分采用基因检测方法，较少采用免疫方法，本发明提供的IgG抗体间接免疫荧光法可检测人抗黄热病毒NS1蛋白抗体，为黄热病毒的检测提供了快速，简便，灵敏的免疫荧光检测方法，本发明可大幅度提高进出口口岸一线检验检疫人员的检测效率，最大限度地防止外来输入性传染病的发生。
发明内容
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏的黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法。本发明的黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，包括如下步骤：
[0007] 1.表达黄热病毒NS1蛋白的293F细胞载波片的制备:
[0008] 将Expi293F细胞经贴壁培养至细胞状态良好时，经胰酶消化后细胞计数，将细胞密度调整至4X105个/毫升后，在Chamber Slide板上以250ul/孔加入细胞悬液，轻柔摇晃，置于细胞培养箱中培养24小时。此时细胞基本铺满孔底，再用黄热病毒NS1蛋白的全长基因表达质粒进行细胞转染。用脂质体2000转染质粒，以1ug质粒/2ul脂质体2000转染试剂的比例进行。细胞转染48小时后，得到表达的黄热病毒NS1蛋白，用多聚甲醛进行细胞固定，固定完成再进行5％山羊血清封闭，封闭后用10％甘油封片2-8℃冷藏保存。
[0009] 2.样品稀释液和洗液的配置；
[0010] 3.表达黄热病毒NS1蛋白的293F细胞载波片的平衡：将表达有黄热病毒NS1蛋白的293F细胞载波片Chamber Slide从2-8℃取至室温中，放置10分钟。
[0011] 4.加入待测样品、阳性对照、阴性对照：每孔加入200ul，盖上Chamber Slide盖子，室温放置60分钟。
[0012] 5.吸掉上清液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重复一次。
[0013] 6.加入荧光标记二抗：每孔加入200ul，室温避光放置1小时，此步骤之后均需做避光处理，防止荧光衰退。
[0014] 7.吸掉样品溶液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重复一遍。
[0015] 8.结果判定：将Chamber Slide置于荧光显微镜下观察荧光,判定结果，有绿色荧光的为阳性反应，无绿色荧光则未有免疫反应，表示样本中不含有黄热病毒抗体。
[0016] 步骤1所述的黄热病毒为病毒株AEQ35299；
[0017] 步骤2所述的样品稀释液为5％山羊血清溶于0.01M PBS缓冲液中；洗液为0.05％的吐温20溶于0.01M PBS缓冲液中。
[0018] 步骤4所述的阳性对照为抗黄热病毒NS1蛋白GP的兔阳性血清，其制备包括如下步骤：将表达黄热病毒NS1蛋白GP的全长基因(AEQ35299毒株)经分子克隆的方法克隆到GIneratorTM载体后，用基因免疫的方法免疫新西兰大白兔，经首次免疫、二次免疫后，耳静脉采血收集少量抗血清，经间接ELISA的方法检测抗血清的效价，效价检测合格后(>1:64000)进行加强免疫(二次免疫间隔3周后)，10天之后收集抗血清；未免疫新西兰大白兔作为阴性对照,同时进行与阳性对照制备一样的操作和检测。
[0019] 步骤4所述阳性对照用稀释液1：100稀释，阴性对照用稀释液1：100稀释。
[0020] 步骤6所述的荧光标记二抗为羊抗兔与羊抗人二抗混合液；荧光二抗混合液加入前用样品稀释液1:2000倍稀释。
[0021] 黄热病毒在我国尚未流行,目前大部分采用基因检测方法，较少采用免疫方法，本发明以间接免疫荧光法检测人抗黄热病毒NS1蛋白抗体。载玻片上是包被能表达黄热病毒NS1蛋白的293F细胞，阳性对照或阳性样品中抗NS1蛋白抗体在结合到细胞表面后，用荧光染料标记的二抗捕获后在荧光显微镜下观察，可见绿色的荧光细胞，判定为黄热病毒IgG抗体阳性。此检测方法操作简单、节省时间、灵敏度高、特异性好，为黄热病毒的检测提供了快速，简便，灵敏的免疫荧光检测方法。通过本发明可大幅度提高进出口口岸一线检验检疫人员的检测效率，既可减少工作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存在的阳性漏检问题，从而最大限度地防止外来输入性传染病的发生。
附图说明
[0022] 图1实施例1中载波片外黄热病毒NS1蛋白表达后纯化的蛋白电泳图。
[0023] 图2实施例1中黄热病毒检测阳性对照荧光检测图。
[0024] 图中，左边为阳性对照的可见光图，右边为阳性对照的荧光图。
[0025] 图3实施例1中黄热病毒检测阴性对照荧光检测图。
[0026] 图中，左边为阴性对照的可见光图，右边为阴性对照的荧光图。
[0027] 图4实施例1中黄热病毒检测阳性模拟样本荧光检测结果。
[0028] 图中，左边为阳性模拟样本的可见光图，右边为阳性模拟样本的荧光图。
[0029] 图5实施例1中黄热病毒检测阴性样本荧光检测结果图。
[0030] 图中，左边均为健康人血清样本的可见光图，右边均为相应的健康人血清样本荧光图。
具体实施方式
[0031] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0032] 实施例1黄热病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法
[0033] 一、实验步骤
[0034] 1.样本准备
[0035] 本实施例中，由于阳性样本来源受限，故用抗黄热病毒NS1蛋白GP的兔阳性血清用不同的稀释浓度做为模拟阳性样本和阳性对照，阴性对照样本为健康人的血清。
[0036] 2.材料、试剂、仪器
[0037] Lab-Tek II Chamber Slide腔室玻片购自Nunc公司，GIneratorTM表达载体购自Immune Technology公司，Expi293FTM表达系统所有试剂购自Thermo Fisher Scientific公司，荧光照相显微镜AXIO SCOPE A1购自蔡司公司，羊抗兔和人的混合荧光二抗购自Jackson ImmunoResearch公司。
[0038] 3.方法
[0039] 3.1 黄热病毒NS1蛋白的制备与纯化
[0040] 3.1 抗黄热病毒NS1蛋白的兔阳性血清制备
[0041] 将表达黄热病毒NS1蛋白的全长基因(AEQ35299)经分子克隆的方法克隆到GIneratorTM载体后，用基因免疫的方法免疫新西兰大白兔，经首次免疫、二次免疫后，耳静脉采血收集少量抗血清，经间接ELISA的方法检测抗血清的效价，效价检测合格后(>1:64000)进行加强免疫(二次免疫间隔3周后)，10天之后收集抗血清。未免疫新西兰大白兔作为阴性对照,同时进行完全一样的操作和检测。
[0042] 3.2 黄热病毒抗体免疫荧光检测方法的建立
[0043] (1)表达黄热病毒NS1蛋白的293F细胞载波片的制备:
[0044] 将293F细胞经贴壁培养至细胞状态良好时，经胰酶消化后细胞计数，将细胞密度调整至4X105个/毫升后，在Chamber Slide板上以250ul/孔加入细胞悬液，轻柔摇晃，置于细胞培养箱中培养24小时。此时细胞基本铺满孔底，再用黄热病毒NS1蛋白的全长基因表达质粒进行细胞转染。用脂质体2000转染质粒，以1ug质粒/2ul脂质体2000转染试剂的比例进行。细胞转染48小时后，得到表达的黄热病毒NS1蛋白，用多聚甲醛进行细胞固定，固定完成再进行5％山羊血清封闭，封闭后用10％甘油封片2-8℃冷藏保存。
[0045] (2)样品稀释液和洗液的配置：5％山羊血清溶于0.01M PBS缓冲液中。洗液为0.05％的吐温20溶于0.01M PBS缓冲液中。
[0046] (3)表达黄热病毒NS1蛋白的293F细胞载波片的平衡：将表达有黄热病毒NS1蛋白的293F细胞载波片Chamber Slide从2-8℃取至室温中，放置10分钟。
[0047] (4)分别加入模拟阳性样本、阴性样本、阳性对照、阴性对照：模拟阳性样本为兔抗阳性血清用样品稀释液作1：10稀释，阴性对照样本为健康人的血清，阳性对照为兔抗阳性血清用样品稀释液作1：100稀释，阴性对照为用样品稀释液作1：100稀释的兔对照血清。每孔加入200ul。盖上Chamber Slide盖子，室温放置60分钟。
[0048] (5)吸掉上清液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重复一次。
[0049] (6)用样品稀释液1:2000倍稀释荧光标记二抗，每孔加入200ul，室温避光放置1小时。此步骤之后均需做避光处理，防止荧光衰退。荧光标记二抗为羊抗兔与羊抗人二抗混合液，这种二抗的混合液可保证兔抗阳性血清对照及真正阳性样本中的人抗黄热病毒NS1蛋白IgG均能结合被标记表现出阳性荧光信号。
[0050] (7)吸掉样品溶液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重复一遍。
[0051] (8)将Chamber Slide置于荧光显微镜下观察荧光,判定结果，有绿色荧光的为阳性反应，无绿色荧光则未有免疫反应，表示样本中不含有黄热病毒抗体。
[0052] 3.3 293F细胞载波片上黄热病毒NS1蛋白表达的验证：
[0053] 为了验证所制备的表达黄热病毒NS1蛋白的293F细胞载波片上NS1蛋白的表达情况，在载波片外进行了黄热病毒NS1蛋白制备与纯化的同步实验，考虑到表达量的问题，实验过程中的实验条件稍有变动，但不影响最后的表达结果，具体实验如下：
[0054] 将Expi293FTM细胞在Expi293FTM表达培养基中进行悬浮培养，待细胞浓度增长到合适浓度时进行细胞转染实验。细胞使用ExpiFectamineTM 293转染试剂进行细胞转染。以30ml的培养体系进行转染时，取两个1.5ml的离心管A/B，A管中加入RPMI 1640细胞培养液、病毒株AEQ35299DNA30ug，总体积1.5ml，轻柔混匀。B管中加入RPMI 1640细胞培养液、ExpiFectamineTM转染试剂80ul，总体积1.5ml，轻柔混匀，室温孵育5分钟后，把A加入B中，轻柔混匀，室温孵育20分钟加入细胞中。在转染后96小时左右后收集蛋白。在蛋白制备过程中无需改变培养基或添加培养基。收集的细胞上清经Ni柱纯化，得到表达的黄热病毒NS1蛋白。
[0055] 二、实验结果
[0056] 1.293F细胞载波片上黄热病毒NS1蛋白表达的验证结果：
[0057] 载波片外进行的黄热病毒NS1蛋白制备与纯化的同步实验中，在30ml的Expi293FTM表达系统中制备黄热病毒NS1蛋白，收集的细胞上清经Ni柱纯化后，进行蛋白电泳得到的蛋白电泳图，黄热病毒株AEQ35299蛋白的分子量应为43KD，蛋白电泳图在40-50KD间见明显条带，具体见图1。
[0058] 2.黄热病毒抗体免疫荧光检测方法的建立
[0059] (1)阳性对照检测结果
[0060] 利用阳性兔抗血清1:100稀释液作为本检测方法中的阳性对照。图2左边为可见光图，右边为荧光图。从图2可以看出，阳性对照孔荧光信号很强。
[0061] (2)阴性对照检测结果
[0062] 以未免疫兔血清1:100稀释作为阴性对照，图3左边为可见光图，右边为荧光图。从图3可以看出，阴性对照孔没有检测到任何荧光信号。
[0063] (2)阳性模拟样本检测结果
[0064] 将阳性模拟样本进行1:500稀释，经检测得到荧光信号图，具体见图4。图4左边为可见光图，右边为荧光图。从图4可以看出，模拟阳性对照孔可以检测到较强的荧光信号。
[0065] (3)黄热阴性样本检测结果
[0066] 健康人血清样本为阴性样本进行检测，得到荧光信号图。所有阴性样本均未检测到荧光，说明检测特异性较好，无交叉反应，具体见图5。图5左边均为可见光图，右边均为荧光图。
[0067] 本发明使用了表达黄热病毒NS1蛋白的293F细胞来提供检测靶位，真核细胞表达的NS1蛋白具有天然构象的特点，能够有效地检测到抗血清中抗黄热病毒NS1蛋白抗体。本方法具有专一性强(检测不同背景的人血清阴性对照10个，无交叉反应问题)，灵敏度较高(抗血清在1:500稀释是仍有较强信号)，使用简单的特点，为检测黄热病毒的感染提供了一个简单，快速，准确的方法。这表明本发明的黄热病毒IgG抗体免疫荧光方法的检测性能良好，能准确地区分阴性及阳性样本，特异性良好，没有出现错判现象。
