一种葵花盘小分子肽及制备方法和医用用途

摘要

本发明提供一种葵花盘小分子肽及制备方法和医用用途，为一种新的植物小分子肽，并公开葵花盘小分子肽在治疗痛风疾病中的医用用途。所述的葵花盘小肽，蛋白质分子量小，可不通过消化系统直接为人体吸收，吸收快速，高效起效；涉及的提取分离工艺简单，易于操作，无需特殊设备，成本低廉，所用的试剂对环境无污染，适合于大规模的工业化生产。

权利要求

1.一种葵花盘小分子肽的制备方法，包括以下步骤：

1）将葵花盘5-8kg粉碎至100-200目，加入6-10倍质量的去离子水，充分搅拌，用氢氧化钠调节pH 值为8-9，在45-50℃搅拌120-240分钟，得到葵花盘分离蛋白液；

2）将葵花盘分离蛋白液加热至85-90℃，搅拌1-3h，冷却至45-55℃，加入占葵花盘分离蛋白液总体积0.1％-0.3％的复合蛋白酶，酶解3-5h，反应终止时，5分钟内升温至85-90℃，保持5-10分钟，使复合蛋白酶失去活性，所得酶解液备用；

3）将步骤2）的酶解液在5000 转/分钟的转速下离心8-12分钟，收集上清液，得葵花蛋白小分子肽粗液；

4）将步骤3）的葵花蛋白小分子肽粗液经截流分子量为5000-20000的中空纤维膜超滤，除去大分子蛋白，得到葵花盘小分子肽液；

5）将步骤4）的葵花盘小分子肽液浓缩，使其体积浓缩至原来的四分之一到二分之一，喷雾干燥，即得葵花盘小分子肽；

其中，步骤2）所述的复合蛋白酶是由生姜蛋白酶、蜗牛蛋白酶、蝙蝠蛾幼虫蛋白消化酶按（0.7-1.2）：（0.2-0.6）：（0.8-1.2）的质量比例混合而成；所述的蝙蝠蛾幼虫蛋白消化酶的制备方法如下：将蝙蝠蛾幼虫去头并剔除虫皮和脂肪，取消化道整体，加入10倍质量的磷酸缓冲液，匀浆，在4℃下组织浆液，然后以3000rpm/min的速度离心，取上清液加热到40℃并迅速冷却至5℃，过滤除去脂肪，透析除盐，冷冻干燥，即得；

所述的葵花盘小分子肽中，粗蛋白质>93％，80％肽段的相对分子质量分布/u <1000；

肽含量为85.6％，水分含量为3.5％，灰分含量为7.4％。

说明书

一种葵花盘小分子肽及制备方法和医用用途

技术领域

[0001] 本发明属于中药领域，具体涉及以葵花盘为原料提取得到的葵花盘小分子肽，同时还提供了其制备方法及其在制备预防和/或治疗痛风的药物中的用途。

背景技术

[0002] 向日葵花盘为菊科植物向日葵（Helianthus annuuss L.）的花盘，亦称向日葵花托、向日葵饼和葵房，其性平、味甘淡、无毒、归肝经，主要功能有清热平肝、止痛、止血，用于治疗关节炎、乳腺炎、头晕、耳鸣、脘腹痛等。向日葵盘水煎液具有治疗肿瘤作用，向日葵花盘乙醇提取物有一定的降压作用，民间也用其作为调治萎缩性胃炎药膳。我国是向日葵的种植大国，葵花盘的资源丰富。但是，在传统应用中，通常是将除葵花子后葵花盘作为牲畜饲料喂养牲畜或作为烧材取暖做饭，没有发挥出其更大的经济效益和医疗作用，造成资源浪费。

[0003] 痛风是嘌呤代谢紊乱所致的一种代谢疾病，血尿酸浓度升高，尿酸钠晶体沉积于下肢骨关节、动脉、脊椎骨间隙组织而引起，表现为关节红、肿、热、痛，关节活动不利，严重者呈关节畸形及功能障碍，且具有反复发作的特点。痛风的存在还可导致冠心病、糖尿病、高血压等疾病的恶化。在治疗方面，西医药治疗痛风，尚无根治的方法，秋水仙碱、非甾体类抗炎药、别嘌呤醇等药物虽可减轻症状，降低血尿酸，但其作用较单一，很难从根本上治疗痛风，且长期服用此类西药对身体造成的伤害远比治疗效果多。

[0004] 我国的传统中医药可已被用来治疗痛风，并且副作用少，易被患者接受，从而达到长期用药、最终根治疾病的目的。但是，传统的中医药治疗痛风方法还存在以下问题：对痛风病机的认识还缺乏共识，辨证分型较难统一；临床报道较多，因缺乏对照，影响了治疗结果的可靠性；汤剂加减者多，固定剂型少，药物作用机制缺乏动物试验的验证。直到现在，尚未有很好的治疗痛风药物。

[0005] 中国专利申请CN201510589245.7公开了一种葵花盘水解复合粉剂在制备预防、缓解或治疗与血尿酸水平升高相关疾病的食品、药物或食品及药物组合物中的应用，并指出葵花盘水解复合粉剂不仅具有潜在的预防动物体内血尿酸升高的作用，同时还具有降低血中已经形成高尿酸水平的潜在性作用。但是，该专利文献中仅提及葵花盘水解复合粉剂是通过对葵花盘浸泡液酶水解得到小分子多肽，而没有披露更多的技术信息。

[0006] 因此，还需要对葵花盘提取物中活性小分子多肽的组成成分和制备工艺做进一步的研究，以获得更好的治疗效果。

发明内容

[0007] 为了克服现有技术中的研发缺限，以获得具有更显著药理活性的葵花盘活性成分，本发明提供了一种葵花盘小分子肽，是以葵花盘为原料，经由复合蛋白酶酶解精制后得到的一种新的小分子肽，对于痛风疾病具有显著的治疗作用，并且毒副作用小，可长期服用。

[0008] 本发明是通过以下的技术方案来实现的。

[0009] 一方面，本发明提供了一种葵花盘小分子肽，其中，粗蛋白质>93％，80％肽段的相对分子质量分布/u <1000；肽含量为85.6％，水分含量为3.5％，灰分含量为7.4％。具体地，所述葵花盘小分子肽的电泳图如图1所示。

[0010] 本发明提供的葵花盘小分子肽是将大分子的蛋白质，利用复合蛋白酶分解成小分子的物质，在不同位点进行酶切，由2到10个氨基酸残基分子组成。相比大分子多肽蛋白，小分子肽耐热耐酸碱，是重要的“生理调节物”，可以直接被胃肠道吸收调控激素和酶的分泌发挥作用，经过肠道毛细血管直接吸收，转运全身起效。特别是当应用于痛风疾病的治疗时，葵花盘小分子肽能够控制嘌呤合成的PRPP酰胺转移酶，从而抑制嘌呤的合成及抑制嘌呤代谢。另外，小分子肽可以干扰黄嘌呤氧化酶等嘌呤转化为尿酸的酶，从而控制体内尿酸含量。对于部分遗传性疾病的痛风患者，由于基因缺失，缺乏嘌呤代谢的酶，导致尿酸积累，小分子肽可以起到一定的缺失酶的作用，调控体内激素平衡以控制尿酸浓度。

[0011] 具体地，本发明的葵花盘小分子肽由包括以下步骤的方法制备得到：

[0012] 1）将葵花盘5-8kg粉碎至100-200目，加入6-10倍质量的去离子水，充分搅拌，用氢氧化钠调节pH 值为8-9，在45-50℃搅拌120-240分钟，得到葵花盘分离蛋白液；

[0013] 2）将葵花盘分离蛋白液加热至85-90℃，搅拌1-3h，冷却至45-55℃，加入占葵花盘分离蛋白液总体积0.1％-0.3％的复合蛋白酶，酶解3-5h，反应终止时，5分钟内升温至85-90℃，保持5-10分钟，使复合蛋白酶失去活性，所得酶解液备用；

[0014] 3）将步骤2）的酶解液在5000 转/分钟的转速下离心8-12分钟，收集上清液，得葵花蛋白小分子肽粗液；

[0015] 4）将步骤3）的葵花蛋白小分子肽粗液经截流分子量为5000-20000的中空纤维膜超滤，除去大分子蛋白，得到葵花盘小分子肽液；

[0016] 5）将步骤4）的葵花盘小分子肽液浓缩，使其体积浓缩至原来的四分之一到二分之一，喷雾干燥，即得葵花盘小分子肽。

[0017] 蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称。按其降解多肽的方式分成内肽酶和端肽酶两类。前者可把大分子量的多肽链从中间切断，形成分子量较小的朊和胨；后者又可分为羧肽酶和氨肽酶，它们分别从多肽的游离羧基末端或游离氨基末端逐一将肽链水解生成氨基酸。由于每一种蛋白酶酶切的位点不一样，单一蛋白酶只能酶切氨基酸多肽序列一个位点，酶解不完全，生成多肽序列单一。

[0018] 本发明葵花盘小分子肽的生产过程中，采用复合蛋白酶对葵花盘酶解，所述的复合蛋白酶是由生姜蛋白酶、蜗牛蛋白酶、蝙蝠蛾幼虫蛋白消化酶按（0.7-1.2）：（0.2-0.6）：（0.8-1.2）的质量比例混合而成；优选按1：0.5：1的质量比例混合。用多种蛋白酶可以对葵花盘蛋白质、长链多肽进行多位点、广谱性的酶切，得到更多种类的小分子肽，从而在治疗痛风中起到调控体内嘌呤，尿酸代谢平衡，调节肾小球蛋白，抑制炎症，抑制疼痛等全方位起效，治疗痛风效果明显。

[0019] 特别是本发明公开的蝙蝠蛾幼虫蛋白消化酶，是取自具有冬虫夏草前体蝙蝠蛾幼虫消化道的蛋白消化酶，由多种蛋白酶混合。蝙蝠蛾幼虫在西藏、青海等高海拔地区生长繁殖，由于高辐射以及植物资源种类稀少，四季苦旱寒，这就使得蝙蝠蛾幼虫对食物有强于一般动植物的消化吸收能力。蝙蝠蛾幼虫蛋白消化酶可以作用于各种类型的蛋白质，酶切位点高效广谱，经蝙蝠蛾幼虫蛋白消化酶分解的蛋白，可以产生大量有助于体内调控痛风疾病的多肽。

[0020] 优选地，所述的蝙蝠蛾幼虫蛋白消化酶的制备方法包括如下步骤：将蝙蝠蛾幼虫去头并剔除虫皮和脂肪，取消化道整体，加入10倍质量的磷酸缓冲液，匀浆，在4℃下组织浆液，然后以3000rpm/min的速度离心，取上清液加热到40℃并迅速冷却至5℃，过滤除去脂肪，透析除盐，冷冻干燥，即得。

[0021] 本发明的葵花盘小分子肽作为活性成分可被广泛应用于药品和/或保健品中。因此，本发明的另一目的是提供一种药物组合物，其包含上述的葵花盘小分子肽和任选的药学上可接受的赋形剂。本发明的药物组合物可以是本领域已知的任何制剂形式，例如片剂、胶囊剂、滴丸剂、颗粒剂、散剂、微丸、溶液剂、糖浆剂、乳剂或注射剂等。

[0022] 另一方面，本发明还提供了所述葵花盘小分子肽的制备方法，其包括以下步骤：1）将葵花盘5-8kg粉碎至100-200目，加入6-10倍质量的去离子水，充分搅拌，用氢氧化钠调节pH 值为8-9，在45-50℃搅拌120-240分钟，得到葵花盘分离蛋白液；

[0023] 2）将葵花盘分离蛋白液加热至85-90℃，搅拌1-3h，冷却至45-55℃，加入占葵花盘分离蛋白液总体积0.1％-0.3％的复合蛋白酶，酶解3-5h，反应终止时，5分钟内升温至85-90℃，保持5-10分钟，使复合蛋白酶失去活性，所得酶解液备用；

[0024] 3）将步骤2）的酶解液在5000 转/分钟的转速下离心8-12分钟，收集上清液，得葵花蛋白小分子肽粗液；

[0025] 4）将步骤3）的葵花蛋白小分子肽粗液经截流分子量为5000-20000的中空纤维膜超滤，除去大分子蛋白，得到葵花盘小分子肽液；

[0026] 5）将步骤4）的葵花盘小分子肽液浓缩，使其体积浓缩至原来的四分之一到二分之一，喷雾干燥，即得葵花盘小分子肽。

[0027] 优选地，步骤2）所述的复合蛋白酶是由生姜蛋白酶、蜗牛蛋白酶、蝙蝠蛾幼虫蛋白消化酶按（0.7-1.2）：（0.2-0.6）：（0.8-1.2）的质量比例混合而成，优选1：0.5：1的质量比例；优选地，所述的蝙蝠蛾幼虫蛋白消化酶的制备方法包括如下步骤：将蝙蝠蛾幼虫去头剔出虫皮和脂肪取消化道整体，加入10倍质量的磷酸缓冲液，匀浆，在4℃下组织浆液，然后以3000rpm/min的速度离心，取上清液加热到40℃并迅速冷却至5℃，过滤除去脂肪，透析除盐，冷冻干燥，即得。

[0028] 进一步地，本发明还提供了上述葵花盘小分子肽或包含该葵花盘小分子肽的药物组合物在制备预防和/或治疗痛风的药物中的应用。

[0029] 与现有技术相比，本发明的积极效果在于：本发明的葵花盘小分子肽为一种新的植物小分子肽，蛋白质分子量小，可不通过消化系统直接为人体吸收，吸收快速，可显著预防和/或治疗痛风；涉及的提取分离工艺简单，易于操作，无需特殊设备，成本低廉；本发明葵花盘小分子肽制备工艺中所用的试剂对环境无污染，适合于大规模的工业化生产。

附图说明

[0030] 图1为本发明葵花盘小分子肽及经不同酶解所得产物SDS-PAGE电泳电泳图。

[0031] 在图中，左起第1，2，3条带分别是实施例1-3的葵花盘小分子肽的上样结果，左起（4，5，6条带），（7，8，9条带）（10，11，12条带）分别为葵花盘经蝙蝠蛾幼虫消化蛋白酶、生姜蛋白酶、蜗牛蛋白酶分别酶解超滤后所得小分子肽的上样结果。复合蛋白酶（生姜蛋白酶、蜗牛蛋白酶、蝙蝠蛾幼虫蛋白消化酶按1：0.5：1的质量比例混合）与单一酶相比，酶解产物增多，有多种不同的小分子肽片段，尤其在小于20kd时，小分子肽更多于单一酶，蝙蝠蛾幼虫消化酶比生姜蛋白酶，蜗牛蛋白酶酶解效率更高。

具体实施方式

[0032] 通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

[0033] 实施例1

[0034] 葵花盘小分子肽的制备：

[0035] 1）将葵花盘5kg粉碎至100目，加入30kg的去离子水，充分搅拌，用氢氧化钠调节至pH 8，在45℃搅拌120分钟，得到葵花盘分离蛋白液；

[0036] 2）将葵花盘分离蛋白液加热至85℃，搅拌1h，冷却至45℃，加入占葵花盘分离蛋白液总体积0.1％的复合蛋白酶（生姜蛋白酶、蜗牛蛋白酶、蝙蝠蛾幼虫蛋白消化酶按1：0.5：1的质量比例混合），酶解3h，反应终止时，5分钟内升温至85℃，保持5分钟，使复合蛋白酶失去活性，所得酶解液备用；

[0037] 3）将步骤2）的酶解液在5000 转/分钟的转速下离心8分钟，收集上清液，得葵花蛋白小分子肽粗液；

[0038] 4）将步骤3）的葵花蛋白小分子肽粗液经截流分子量为5000的中空纤维膜超滤，除去大分子的蛋白，得到葵花盘小分子肽液；

[0039] 5）将步骤4）的葵花盘小分子肽液浓缩，将其体积浓缩至原来的四分之一，喷雾干燥，即得葵花盘小分子肽。

[0040] 实施例2

[0041] 葵花盘小分子肽的制备：

[0042] 1）将葵花盘7kg粉碎至150目，加入56kg的去离子水，充分搅拌，用氢氧化钠调节至pH 8.5，在48℃搅拌180分钟，得到葵花盘分离蛋白液；

[0043] 2）将葵花盘分离蛋白液加热至88℃，搅拌2h，冷却至48℃，加入占葵花盘分离蛋白液总体积0.2％的复合蛋白酶（生姜蛋白酶、蜗牛蛋白酶、蝙蝠蛾幼虫蛋白消化酶按0.9：0.6：1的比例混合），酶解4h，反应终止时，5分钟内升温至88℃，保持8分钟，使复合蛋白酶失去活性，所得酶解液备用；

[0044] 3）将步骤2）的酶解液在5000 转/分钟的转速下离心10分钟，收集上清液，得葵花蛋白小分子肽粗液；

[0045] 4）将步骤3）的葵花蛋白小分子肽粗液经截流分子为10000的中空纤维膜超滤，除去大分子的蛋白，得到葵花盘小分子肽液；

[0046] 5）将步骤4）的葵花盘小分子肽液浓缩，将其体积浓缩至原来的三分之一，喷雾干燥，即得葵花盘小分子肽。

[0047] 实施例3

[0048] 葵花盘小分子肽的制备：

[0049] 1）将葵花盘8kg粉碎至200目，加入80kg去离子水，充分搅拌，用氢氧化钠调节至pH 9，在50℃搅拌240分钟，得到葵花盘分离蛋白液；

[0050] 2）将葵花盘分离蛋白液加热至90℃，搅拌3h，冷却至50℃，加入占葵花盘分离蛋白液总体积0.3％的复合蛋白酶（生姜蛋白酶、蜗牛蛋白酶、蝙蝠蛾幼虫蛋白消化酶按1.2：0.4：0.8的质量比例混合），酶解5h，反应终止时，5分钟内升温至90℃，保持10分钟，使复合蛋白酶失去活性，所得酶解液备用；

[0051] 3）将步骤2）的酶解液在5000 转/分钟的转速下离心12分钟，收集上清液，得葵花蛋白小分子肽粗液；

[0052] 4）将步骤3）的葵花蛋白小分子肽粗液经截流分子量为20000的中空纤维膜超滤，除去大分子的蛋白，得到葵花盘小分子肽液；

[0053] 5）将步骤4）的葵花盘小分子肽液浓缩，将其体积浓缩至原来的二分之一，喷雾干燥，即得葵花盘小分子肽。

[0054] 试验例1：药理试验数据

[0055] 一、试验材料

[0056] 1.动物：昆明种小鼠，体重（20g±2g），由吉林大学临床动物研究中心提供。

[0057] 2.给药样品：空白对照组（蒸馏水），本发明组（实施例1、2、3制备得到的葵花盘小分子肽组）。

[0058] 二、试验方法

[0059] 1.镇痛实验：取雄性小鼠40只，随机分为空白对照组，实施例1、实施例2、实施例3组，按120mg kg-1给药，1次一天，空白对照组给予等量蒸馏水，连续给药5天，于末次给药1小时后，每组给各取10只小鼠腹腔注射0.7%醋酸0.1ml g-1，记录各组小鼠20min内扭体次数。结果见表1。表1. 对醋酸所致小鼠扭体反应的影响

[0060]

[0061] 与空白对照组比较，*P<0.05,**P<0.01

[0062] 2.小鼠血尿酸（UA）、黄嘌呤氧化酶（XOD）及尿素氮（BUN）

[0063] 取雄性小鼠100只，随机分为正常组、模型组、本发明组（实施例1、实施例2、实施例3），每组20只。除正常组外，每组均以酵母30g·kg-1灌胃，连续一周。从第3天开始本发明组灌胃，按120mg·kg-1给药，连续给药5d。小鼠摘除眼球法取血，分离血清，在波长690nm、
530nm和640nm处测定UA、XOD和BUN值。结果见表2。

[0064] 表2.对酵母膏致高尿酸血症小鼠血清UA、XOD及BUN的影响

[0065]

[0066] 三、试验结果

[0067] 由上述表1和表2的试验结果可以看出，本发明的葵花盘小分子肽能显著减轻化学物质产生的疼痛，说明本发明小分子肽有镇痛作用。另外，本发明的葵花盘小分子肽能显著抑制黄嘌呤氧化酶活性，减少尿酸的生成，表明能明显降低血中尿素氮，改善肾功能。

[0068] 试验例2：典型临床案例

[0069] 病例1：

[0070] 宋某，男，56岁，机关工作。患者无诱因于7年前出现手指、足趾关节肿痛，以夜间痛为甚，右手指关节僵硬破溃已2年。患者于7年前经常出差。频频饮酒，屡进膏粱厚味，兼之旅途劳顿，感受风寒，时感手指、足趾肿痛，因工作较忙，未曾介意。以后每于饮酒或劳累、受寒之后，即疼痛增剧，右手指关节及左足拇指内侧肿痛尤甚，以夜间痛为剧，即去医院就诊，血尿酸高达918umol/L，确诊为“痛风”。即服用别嘌呤醇、丙硫酸等，病情有所好转，但因胃痛不适而停服。因之肿痛有增剧，乃继续服用，迄今未愈。查体：右手食指中指肿痛破溃。左足大趾内侧亦肿痛较甚。夜间痛较甚。血尿酸714 umol/L，口苦，苔黄腻，脉弦数，右二有痛风石结节。

[0071] 治疗：服用本发明实施例1制备的药物2个疗程后，疼痛减轻，破溃处之分泌物有所减少，足趾之肿痛减清，继续服用2个疗程后，患者以上症状消失，血尿酸已接近正常，嘱患者继续巩固一个疗程，随访一年，未复发。 

[0072] 病例2：

[0073] 王某，男性，35岁，农民。患者左足趾、足背反复性肿痛6年。患者6年前在一次饮酒后，突然发生左足背，大拇指肿痛，难以入睡，局部灼热红肿。在当地服用消炎阵痛药后，一周后疼痛缓解。以后，每遇饮酒或感冒后即易发作，每遇发作，自服泼尼松等药。近一年来服用上药效果不佳。疼痛固定于左足背及左拇指。于2周前又因酒后卧睡受凉而引起本病发作，局部红肿热痛，功能受限，故来我处诊治。查体：面红，颇行，左足背及拇指红、肿、压痛、功能受限。舌质红，，苔黄腻，脉弦滑数。化验：血沉：80㎜/h，血尿酸：720 umol/L。X线示：左足跖骨骨头处出现溶骨性缺损。

[0074] 治疗：服用本发明实施例1制备的药物2疗程后，症状消失，行走自如，无跛行。为巩固疗效嘱继续服用5个疗程。随访1年，未复发。

[0075] 病例3：

[0076] 女性，杨XX，48岁，患痛风20年以上，福建人，原饮食习惯每日大量进食海鲜和啤酒，曾经有一顿两人进食30斤贝蟹类海鲜食物的记录。曾经有关节疼痛病史亦未在意，未作治疗，近两年来症状加重，全身各个关节基本全部受累，尤其是双手、双足、双踝、双膝关节严重，大量痛风石沉积使得关节严重变形，这次就诊，即因为全身剧烈疼痛，无法行走就医。多数医院以无治疗价值拒收。

[0077] 治疗：服用本发明实施例1制备的药物2疗程后，症状消失，正常行走活动没有影响，各项指标正常，饮食习惯已经基本改过来了，为巩固疗效嘱继续服用5个疗程。随访1年，未复发。

[0078] 病例4：

[0079] 张某某，男，40岁。主诉左足踝、足跖趾肿胀疼痛三天，因连续三天在下半夜患处剧烈疼痛、坐卧不宁而来诊，见患者形体丰满，痛苦面容，走路坡行，左足踝及足跖趾关节处明显肿胀，微红不热，因连续夜间疼痛影响睡眠而心烦，伴有脘腹痞满、大便干结，查舌质暗红，苔白稍厚，脉弦滑。血液检查提示，血脂偏高，血尿酸554umol/L。结合患者形体丰满，工作应酬多，生活无规律，偏食肥厚重味，嗜饮啤酒及可乐饮品，当属痰湿体质。

[0080] 治疗：服用本发明实施例1制备的药物后疼痛即有减轻，1个疗程后肿胀基本消失，唯疼痛时作，尤其是久立行走后明显，再服一个疗程痛渐向愈。舌质红，苔薄白，脉弦滑。服药效显不更方，继续维持原治疗。连续服用4个疗程，疼痛肿胀均已消失。随访1年，未复发。