一种呋喃甲酸类化合物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种呋喃甲酸类化合物及其制备方法和应用，所述呋喃甲酸类化合物是从烤烟烟叶中分离得到，其分子式为C14H14O5，命名为5‑(3＇‑羟基‑4＇‑甲氧基‑5＇‑甲基苯基)‑3‑甲基‑呋喃‑2‑甲酸，英文名为[5‑(3＇‑hydroxy‑4＇‑methoxy‑5＇‑methylphenyl)‑3‑methyl‑furan‑2‑carboxylic acid]，具有下述结构：所述呋喃甲酸类化合物制备方法是以烤烟烟叶为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤，具体为：将样品粉碎、提取、过滤、浓缩，层析，洗脱，洗脱液的1:1部分用高压液相色谱分离纯化即得所述的呋喃甲酸类化合物。所述呋喃甲酸类化合物经活性测试，对烟草花叶病毒具有很好的抑制作用。本发明化合物结构简单，活性较好，可作为抗烟草花叶病毒药物的先导性化合物。

权利要求

1.一种呋喃甲酸类化合物，其特征在于所述呋喃甲酸类化合物是从烤烟烟叶中分离得到，其分子式为C14H14O5，具有下述结构：该化合物命名为：5-(3＇-羟基-4＇-甲氧基-5＇-甲基苯基)-3-甲基-呋喃-2-甲酸。

2.一种权利要求1所述呋喃甲酸类化合物的制备方法，其特征在于以烤烟烟叶为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤制备，具体为：A．浸膏提取: 以烟叶为原料，将烟叶粉碎或切成小段，用60 100%的有机溶剂浸泡并提~取3 5次，每次24h 72h，合并提取液、过滤，减压浓缩成浸膏，有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮中~ ~的任意一种；

B．硅胶柱层析：浸膏用有机溶剂溶解，有机溶剂是浸膏重量比1.5 3倍量的纯甲醇、纯~乙醇或纯丙酮；然后用浸膏重量比0.8 1.2倍的80 100目硅胶拌样，再用浸膏重量比2 4倍~ ~ ~量的160 300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以体积配为1:0 1:2的氯仿-丙酮溶液进行~ ~梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，合并相同的部分；

C．高压液相色谱分离：B步骤洗脱液的1:1部分进一步用高压液相色谱分离纯化，高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm、5μm的C18色谱柱，流速为20mL/min，流动相为30%的甲醇，紫外检测器检测波长为306nm，每次进样200μL，收集19.5min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述呋喃甲酸类化合物。

3.根据权利要求2所述呋喃甲酸类化合物的制备方法，其特征在于所述A步骤中有机溶剂与烟叶的重量比是2 4:1。

~

4.根据权利要求2所述呋喃甲酸类化合物的制备方法，其特征在于所述B步骤中的氯仿-丙酮溶液体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2。

5.根据权利要求2所述呋喃甲酸类化合物的制备方法，其特征在于所述C步骤中高压液相色谱分离纯化后的物质再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化。

6.一种权利要求1所述呋喃甲酸类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。

说明书

一种呋喃甲酸类化合物及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于烟草化学技术领域，具体涉及一种从烟草中首次提取得到的呋喃甲酸类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 烟草是世界上化学成分最为复杂的植物，次生代谢产物非常丰富，据1982年Dube和Green等报道，烟草中已鉴定出的化学成分就超过2549种，到2008年，Rodgman和perfetti的报道称，烟草、烟草代用品以及卷烟烟气中发现的化合物总数大约为8700种。目前，人们从烟草中鉴定出来的单体化学物质就超过3000多种，而且还有许多成分尚未鉴定出来。烟草除主要用于卷烟抽吸用途外，还可从中提取多种有利用价值的化学成分，从中发现有开发利用价值的先导性化合物。

[0003] 呋喃类化合物在很多天然植物中存在，并且具有多种生物活性。据文献报道，该类化合物具有抗肿瘤，抗氧化，钙内流阻滞，血管紧张素II受体拮抗，腺苷Al受体拮抗，抗真菌、抗细菌活性和血小板聚集拮抗等药理作用。由于苯呋喃类化合物具有如此广谱的药理活性，国内外研究者对该类化合物进行了深入的研究，除从天然产物中寻找该类化合物外，还经过结构修饰而得到具有更优药理活性的化合物。为了研究这类化合物的构效关系，可进一步研究和开发更多的呋喃类化合物，从中寻找有效的先导化合物和活性基团。本发明从云南烤烟烟叶中分离得到了一种新的呋喃甲酸类化合物，该化合物至今尚未见到相关报道，值得一提的是该化合物具有显著的抗烟草花叶病病毒活性。

发明内容

[0004] 本发明的第一目的在于提供一种结构新颖的呋喃甲酸类化合物；第二目的在于提供所述呋喃甲酸类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述呋喃甲酸类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。

[0005] 本发明的第一目的是这样实现的，所述呋喃甲酸类化合物是从烟叶中分离得到，其分子式为C14H14O5，具有下述结构：

[0006]

[0007] 该化合物的命名为5-(3＇-羟基-4＇-甲氧基-5＇-甲基苯基)-3-甲基-呋喃-2-甲酸，英文名为[5-(3＇-hydroxy-4＇-methoxy-5＇-methylphenyl)-3-methyl-furan-2-carboxylic acid]，为浅黄色胶状物。

[0008] 本发明的第二目的是这样实现的，所述呋喃甲酸类化合物是以烤烟烟叶为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤，具体为：

[0009] A．浸膏提取: 以烟叶为原料，将烟叶粉碎或切成小段，用60 100%的有机溶剂浸泡~并提取3 5次，每次24h 72h，合并提取液、过滤，减压浓缩成浸膏；
~ ~

[0010] B．硅胶柱层析：浸膏用有机溶剂溶解后，用浸膏重量比0.8 1.2倍的80 100目硅胶~ ~拌样，再用浸膏重量比2 4倍量的160 300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以体积配为1:0~ ~
1:2的氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，合并相同的部分；
~

[0011] C．高压液相色谱分离：B步骤洗脱液的1:1部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所述的呋喃甲酸类化合物。

[0012] 以上述方法制备的呋喃甲酸类化合物的结构是通过以下方法测定出来的：

[0013] 本发明化合物为浅黄色胶状物；紫外光谱 (溶剂为甲醇), λmax (logε) 306 (2.70)、248 (3.35)、210 (3.74)；红外光谱 (溴化钾压片)νmax 3418、3419、3023、2942、1687、1613、1582、1240、1120、1048 cm-1；高分辨质谱 (HRESIMS) 给出准分子离子峰m/z 
285.0746 [M+Na]+ (计算值285.0739)。结合1H和13C NMR谱给出一个分子式C14H14O5，不饱和度为8。从化合物 1 的红外光谱数据证实化合物中有-OH (3418 cm-1)、–CO2H (br. 3023 cm-1), -CO2 (1687 cm-1) 和芳环(1613和1582 cm-1)官能团。化合物的核磁共振氢谱证实化合物中存在1个甲氧基(δH 3.86 s)、1个羧基(δH 10.05)、3个芳香次甲基(δH 6.21 s、
6.53 s和 6.68 s)、两个甲基(δH 1.85 s 和2.39 s)和1个酚羟基(δH 10.68 s)。其核磁共振碳谱也证实化合物中存在羧基碳(δC 167.3 s), 两个甲基碳 (δC 9.0 q 和18.2 q), 一个甲氧基碳(δC 61.4 q), 3个芳香次甲基碳(δC 105.8 d、111.3 d 和124.1 d)，4个sp2 氧化的季碳 (δC 162.7 s、156.9 s、146.1 s 和 155.2 s)，以及3个sp2 芳香季碳 (δC 
103.0 s、125.4 s 和 127.2 s)。根据H3-13 (δH 1.85) 和 C-2 (δC 162.7)、C-3 (δC 
103.0)、C-4 (δC 105.8) 和C-12 (δC 167.3)，H-4 (δH 6.21) 和C-2 (δC 162.7)、C-3 (δC 103.0)、C-5 (δC 156.9)，以及 (CO2H, δH 10.05) 和C-2 (δC 162.7) 的HMBC相关 (图-3) 证实化合物中存在 3-甲基-呋喃甲酸结构。进一步从H-4 (δH 6.21) 和C-6 (δC 
125.4)，H-7 (δH 6.53)、H-11 (δH 6.68)和C-5 (δC 156.9)的HMBC相关证实有苯环取代在呋喃环的C-5位。其它取代基的位置，另1个甲基取代在C-10位可通过H3-14 (δH 2.39) 和C-9 (δC 152.5)、C-10 (δC 127.2) 和 C-11 (δC 124.1) 的HMBC相关确认；甲氧基取代在 C-9 可由甲氧基氢(δH 3.86)和C-9 (δC 152.5) 的HMBC相关确定；酚羟基取代在 C-8 位可由酚羟基氢 (δH 10.68) 和C-7 (δC 111.3)、C-8 (δC 146.1) 和 C-9 (δC 152.5) 的HMBC相关得到证实。至此化合物的结构得到确定，并命名为5-(3＇-羟基-4＇-甲氧基-5＇-甲基苯基)-3-甲基-呋喃-2-甲酸。

[0014] 表-1.化合物的1H NMR 和13C NMR 数据 (C5D5N)

[0015]

[0016] 本发明的第三目的是这样实现的，即将所述呋喃甲酸类化合物应用于抗烟草花叶病毒药物的制备。

[0017] 本发明化合物是首次被分离出来的，通过核磁共振和质谱测定方法确定为呋喃甲酸类化合物，并表征了其具体结构。经对抗烟草花叶病毒的实验，其相对抑制率达36.2%，超过阳性对照品宁南霉素的相对抑制率（31.5%），具有很好的抗烟草花叶病毒活性。本发明化合物结构简单活性较好，可作为抗烟草花叶病毒药物的先导性化合物，具有良好的应用前景。

附图说明

[0018] 图1为本发明呋喃甲酸类化合物的核磁共振碳谱（13C NMR）；

[0019] 图2为本发明呋喃甲酸类化合物的核磁共振氢谱（1H NMR）；

[0020] 图3为本发明呋喃甲酸类化合物的主要HMBC相关。

具体实施方式

[0021] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。

[0022] 本发明所述呋喃甲酸类化合物，是从烤烟烟叶中分离得到，其分子式为C14H14O5，具有下述结构：

[0023]

[0024] 命名为5-(3＇-羟基-4＇-甲氧基-5＇-甲基苯基)-3-甲基-呋喃-2-甲酸，英文名为 [5-(3＇-hydroxy-4＇-methoxy-5＇-methylphenyl)-3-methyl-furan-2-carboxylic acid]。

[0025] 本发明所述呋喃甲酸类化合物的制备方法，是以烤烟烟叶为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤，具体为：

[0026] A．浸膏提取: 以烟叶为原料，将烟叶粉碎或切成小段，用60 100%的有机溶剂浸泡~并提取3 5次，每次24h 72h，合并提取液、过滤，减压浓缩成浸膏；
~ ~

[0027] B．硅胶柱层析：浸膏用有机溶剂溶解后，用浸膏重量比0.8 1.2倍的80 100目硅胶~ ~拌样，再用浸膏重量比2 4倍量的160 300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析；以体积配为1:0~ ~
1:2的氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，合并相同的部分；
~

[0028] C．高压液相色谱分离：B步骤洗脱液的1:1部分进一步用高压液相色谱分离纯化即得所述的呋喃甲酸类化合物。

[0029] 所述A步骤中有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮中的任意一种。

[0030] 所述A步骤中有机溶剂与烟叶的重量比是2 4:1。~

[0031] 所述B步骤中有机溶剂是浸膏重量比1.5 3倍量的纯甲醇、纯乙醇或纯丙酮。~

[0032] 所述B步骤中的氯仿-丙酮溶液体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2。

[0033] 所述C步骤中高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5μm的C18色谱柱，流速为20mL/min，流动相为30%的甲醇，紫外检测器检测波长为306nm，每次进样200μL，收集19.5min的色谱峰，多次累加后蒸干。

[0034] 所述C步骤中高压液相色谱分离纯化后的物质再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化。

[0035] 本发明所述呋喃甲酸类化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。

[0036] 本发明所用原料不受地区和品种限制，均可以实现本发明，下面以来源于云南中烟工业有限责任公司不同产地的烟叶原料，对本发明做进一步说明：

[0037] 实施例1

[0038] 烟草样品来源于云南玉溪，品种为玉溪K326。取烟叶2.0kg粉碎，用95%的甲醇提取5次，每次提取24h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏105g。浸膏用重量比2.0倍量的纯甲醇溶解后用120g的100目粗硅胶拌样，0.6kg的160目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为1:1的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以30%的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18 (21.2×250mm, 5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为306 nm，每次进样200μL，收集19.5min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-
20凝胶柱层析分离，即得该新化合物。

[0039] 实施例2

[0040] 烟草样品来源于云南大理，品种为云烟200。取烟叶3.5kg切碎，以95%的乙醇提取4次，每次提取48h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏250 g。浸膏用重量比2.0倍量的纯甲醇溶解后用250g的80目粗硅胶拌样，1.2kg 的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为1:1的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以30%的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18 (21.2×250mm, 5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为306nm，每次进样200μL，收集19.5 min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20 凝胶柱层析分离，即得该新化合物。

[0041] 实施例3

[0042] 烟草样品来源于云南昆明，品种为红花大金元。取烟叶5kg粉碎，以75%的丙酮用超声提取3次，每次提取72h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏380g。浸膏用重量比1.6倍量的纯甲醇溶解后用400g的90目粗硅胶拌样，2.4 kg的180目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为1:1的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以30％的甲醇为流动相，Zorbax SB-C18 (21.2×250 mm, 5μm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为306nm，每次进样200μL，收集19.5min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用Sephadex LH-20 凝胶柱层析分离，即得该新化合物。

[0043] 实施例4

[0044] 取实施例1制备的化合物，为浅黄色胶状物；

[0045] 测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构。

[0046] 本发明化合物为浅黄色胶状物；紫外光谱 (溶剂为甲醇), λmax (logε) 306 (2.70)、248 (3.35)、210 (3.74)；红外光谱 (溴化钾压片) νmax 3418、3419、3023、2942、1687、1613、1582、1240、1120、1048 cm-1；高分辨质谱 (HRESIMS) 给出准分子离子峰m/z 
285.0746 [M+Na]+ (计算值285.0739)。结合1H和13 C NMR谱给出一个分子式C14H14O5，不饱和度为8。从化合物 1 的红外光谱数据证实化合物中有-OH (3418 cm-1)、–CO2H  (br. 
3023 cm-1), -CO2 (1687 cm-1) 和芳环(1613和1582 cm-1)官能团。化合物的核磁共振氢谱证实化合物中存在1个甲氧基(δH 3.86 s)、1个羧基(δH 10.05)、3个芳香次甲基(δH 
6.21 s、6.53 s和 6.68 s)、两个甲基(δH 1.85 s 和2.39 s)和1个酚羟基(δH 10.68 s)。
其核磁共振碳谱也证实化合物中存在羧基碳(δC 167.3 s), 两个甲基碳 (δC 9.0 q 和
18.2 q), 一个甲氧基碳(δC 61.4 q), 3个芳香次甲基碳(δC 105.8 d、111.3 d 和124.1 d)，4个sp2 氧化的季碳 (δC 162.7 s、156.9 s、146.1 s 和 155.2 s)，以及3个sp2 芳香季碳 (δC 103.0 s、125.4 s 和 127.2 s)。根据H3-13 (δH 1.85) 和 C-2 (δC 162.7)、C-
3 (δC 103.0)、C-4 (δC 105.8) 和C-12 (δC 167.3)，H-4 (δH 6.21) 和C-2 (δC 162.7)、C-3 (δC 103.0)、C-5 (δC 156.9)，以及 (CO2H, δH 10.05) 和C-2 (δC 162.7) 的HMBC相关 (图-3) 证实化合物中存在 3-甲基-呋喃甲酸结构。进一步从H-4 (δH 6.21) 和C-6 (δC 125.4)，H-7 (δH 6.53)、H-11 (δH 6.68)和C-5 (δC 156.9)的HMBC相关证实有苯环取代在呋喃环的C-5位。其它取代基的位置，另1个甲基取代在C-10位可通过H3-14 (δH 2.39) 和C-9 (δC 152.5)、 C-10 (δC 127.2) 和 C-11 (δC 124.1) 的HMBC相关确认；甲氧基取代在 C-9 可由甲氧基氢(δH 3.86) 和C-9 (δC 152.5) 的HMBC相关确定；酚羟基取代在 C-8 位可由酚羟基氢 (δH 10.68) 和C-7 (δC 111.3)、C-8 (δC 146.1) 和 C-9 (δC 
152.5) 的HMBC相关得到证实。至此化合物的结构得到确定，并命名为5-(3＇-羟基-4＇-甲氧基-5＇-甲基苯基)-3-甲基-呋喃-2-甲酸。

[0047] 实施例5

[0048] 取实施例2所制备的化合物，为浅黄色胶状物。测定方法与实施例4相同，确认实施例2制备的化合物为所述呋喃甲酸类化合物。

[0049] 实施例6

[0050] 取实施例3所制备的化合物，为浅黄色胶状物。测定方法与实施例4相同，确认实施例3制备的化合物为所述呋喃甲酸类化合物。

[0051] 实施例7

[0052] 取实施例1 4所制备的呋喃甲酸类化合物进行抗烟草花叶病毒活性试验，试验情~况如下：

[0053] 采用半叶法，在药剂的质量浓度均为50mg/L时对本发明化合物进行抗烟草花叶病毒活性测定。在5 6龄烤烟的植株上，选取适用于测试的叶片(叶行正常，无病无虫)，先将叶~片均匀撒上细金刚砂，用毛笔将备用的烟草花叶病毒源(3.0×10-3)均匀抹在撒有金刚砂的叶片上，待所有中选的叶片接毒结束后，立即放在盛有药液的培养皿中处理20min，取出，擦去叶片上水珠和药液，将两个半叶复原排放在铺有卫生纸保湿的玻璃缸中，并盖上玻璃盖，控温(23±2)℃，放在温室自然光照射，2 3d即可见枯斑．每个处理都设另一半叶为对照，另~
外设有1组为商品宁南霉素的处理作为对比，按下公式计算相对抑制率。

[0054] XI％=(CK-T)／CK×100%

[0055] X：相对抑制率(%)，CK：浸泡于清水中半片接毒叶的枯斑数(个)，T浸泡于药液中半片接毒叶的枯斑数(个)。

[0056] 结果明本化合物的相对抑制率为36.2%，超过对照宁南霉素的相对抑制率31.5%，说明化合物有很好的抗烟草花叶病毒活性。