一株蓝莓根际促生阴沟肠杆菌及其应用

摘要

本发明提供一株蓝莓根际促生阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)BIA070，该菌株已于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11970。该菌株应用到蓝莓根系的土壤中，可有效适应并调节蓝莓根际土壤的生态环境，在一定程度上降低蓝莓土壤pH，同时可明显促进蓝莓主枝长和地径生长，从而有效促进的蓝莓生长发育。因此，本发明为蓝莓根际土壤环境的改善提供了优良的菌株资源和新的方法。

权利要求

1.一株蓝莓根际促生阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)BIA070，所述菌株已于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11970。

2.如权利要求1所述的一株蓝莓专用的根际促生阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)BIA070的培养方法，其特征在于，将菌株BIA070在LB液体培养基中在37℃，180rpm的条件下培养24h，按1％接种量将种子液接种至LB液体培养基中进行发酵，37℃，180rpm培养2d，制得活化菌液。

3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述LB液体培养基配方为：蛋白胨10g；

NaCl 10g；酵母浸膏5g；水1000ml；pH 7.0-7.2。

4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，还包括进一步离心收集获得阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)BIA070菌体。

5.一种微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)BIA070菌体或阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)BIA070的培养物。

6.权利要求1所述菌株或权利要求5所述菌剂在促进蓝莓生长中的应用。

说明书

一株蓝莓根际促生阴沟肠杆菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物微生物技术领域，具体涉及一株蓝莓根际促生阴沟肠杆菌及其应用。

背景技术

[0002] 蓝莓(Vacciniumssp.L.)，又名越橘、蓝浆果，属杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium L.)浆果类经济林木。其天然资源丰富，风味独特，而且具有相当的营养保健功效，有“水果皇后”美誉，经济价值极高。

[0003] 植物根际促生细菌是指生存在植物根圈范围中，对植物生长有促进或对病原菌有拮抗作用的有益细菌统称，对植物生长及病害防治有极其重要的作用。据不完全统计，已发现包括假单胞菌和芽抱杆菌等20多个属的植物根际促生细菌具有防病促生潜能的报道。植物根际促生细菌可分泌植物促生物质，包括植物激素、维生素、氨基酸和其它活性有机小分子及衍生物等；还可改善植物根际的营养环境，有效控制植物病害等。

[0004] 本发明人已从蓝莓根际土壤中筛选出了蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌L13(保藏编号为CGMCC No.7068)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)L5(保藏编号为CGMCC No.7667)，能适应蓝莓特定的根际土壤环境，并能促进蓝莓生长。

[0005] 然而蓝莓适宜在有机质含量高的酸性土壤(4.0～4.8)生长，限制蓝栽培的主要因素是土壤pH偏高，因此，土壤酸碱度的调节是非常重要的。在人工栽培条件下一般采用土壤施用硫磺粉的方法来调节和维持，这会导致蓝莓土壤pH持续降低，硫磺粉及土壤的强酸性使蓝莓根际土壤的微生物群落结构十分独特。使用微生物调节蓝莓土壤微环境特征是有必要的。而常用的功能微生物接种到蓝莓土壤中，难以存活和定殖，无法产生持续、稳定的功效。而基于上述原因，适宜蓝莓的PGPR菌株资源仍然十分匮乏。因此继续丰富蓝莓菌株资源，开发蓝莓专用菌剂，对蓝莓产业的健康发展具有重要意义。

发明内容

[0006] 针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一株蓝莓根际促生阴沟肠杆菌，该菌株具有降低蓝莓根际土壤pH，促进蓝莓生长的作用。

[0007] 具体的，本发明涉及以下技术方案：

[0008] 本发明的一个目的在于提供一株蓝莓根际促生阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)BIA070，该菌株已于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11970。

[0009] 所述阴沟肠杆菌菌落特征及菌体形态为：LB培养基上菌落形态呈规则圆形，生长24h后菌落大小约为1-2mm，表面凸起，湿润，微黄色，半透明，镜检菌体形态为短杆状，无芽孢。

[0010] 所述阴沟肠杆菌菌株生理生化特征为：吲哚试验阴性，甲基红试验阴性，柠檬酸盐试验阳性，脲酶试验阳性，苯丙氨酸脱氨酶试验阴性，赖氨酸脱羧酶试验阴性，鸟氨酸脱羧酶试验阳性，D-葡萄糖产酸试验阳性，D-葡萄糖产气试验阳性，卫矛醇试验阴性，棉籽糖试验阳性，氧化酶试验阴性，D-木糖试验阳性。

[0011] 所述阴沟肠杆菌具有产吲哚乙酸(IAA)能力，可促进蓝莓生长。

[0012] 所述阴沟肠杆菌的16SrDNA序列分析：：将所测16SrDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明：BIA070与阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae(ABA244288.1)的相似度达98.42％。结合菌落、菌体形态特征，生理生化特征和16SrDNA序列分析，将BIA070鉴定为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。

[0013] 本发明的另一目的在于提供上述阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)BIA070的培养方法，包括：将菌株阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)BIA070在LB液体培养基中在37℃，180rpm的条件下培养24h，按1％接种量将种子液接种至LB液体培养基中进行发酵，37℃，180rpm培养2d，制得活化菌液；进一步离心可收集阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)BIA070菌体。

[0014] LB液体培养基配为：蛋白胨10g；NaCl 10g；酵母浸膏5g；水1000ml；pH 7.0-7.2。

[0015] 本发明还提供一种菌剂，其包括上述阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)BIA070菌体或阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)BIA070的培养物。

[0016] 此外，本发明还提供上述菌株或菌剂在促进蓝莓生长中的应用。

[0017] 本发明具有如下优点：

[0018] 本发明的蓝莓根际阴沟肠杆菌应用到蓝莓根系的土壤中，可有效适应并调节蓝莓根际土壤的生态环境，在一定程度上降低蓝莓土壤pH，同时可明显促进蓝莓主枝长和地径生长，从而有效促进的蓝莓生长发育。因此，本发明为蓝莓根际土壤环境的改善提供了优良的菌株资源和新的方法。

附图说明

[0019] 图1为菌株BIA070的菌落形态图(LB固体培养基)；

[0020] 图2为菌株BIA070的光学显微镜镜检图；

[0021] 图3为实施例1实验组与对照组土壤pH变化图。

具体实施方式

[0022] 下面结合实施例对本发明做进一步说明

[0023] 实施例1菌株BIA070的筛选及鉴定

[0024] 阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)BIA070的筛选分离过程如下：

[0025] (1)于青岛市黄岛区佳沃蓝莓生产基地定植7-8年的蓝莓根际采集土样，分别称取两个土样10g，置于装有90mL液体富集培养基中(LB及PDA)，37℃，180rpm摇床培养24h；

[0026] (2)将富集后的菌液采用稀释涂布法涂布于溴甲酚紫显色平板，37℃培养1-2天，挑取使周围培养基由紫变黄的单菌落，并进行纯化；

[0027] (3)将纯化好的菌株进行编号，并保存于LB斜面，放于4℃冰箱备用，将筛选到的产酸菌株接种于含有溴甲酚紫显色剂的试管中，37℃，180rpm摇床培养24h，根据颜色变化程度选择产酸能力较强的菌株进一步测定。

[0028] (4)将初筛产酸效果较好的菌株接种于LB液体培养基试管中，37℃，180rpm摇床培养24h，制备种子液。按1％接种量将种子液接种于100mL发酵培养基中，每个菌株三个平行，37℃，180rpm摇床培养48h，测定发酵液pH，进一步选择产酸能力较强的细菌，最终确定一株蓝莓专用的根际促生细菌，编号为BIA070。

[0029] 该菌落特征及菌体形态为：LB培养基上菌落形态呈规则圆形，生长24h后菌落大小约为1-2mm，表面凸起，湿润，微黄色，半透明，镜检菌体形态为短杆状，无芽孢。

[0030] 该菌株生理生化特征为：吲哚试验阴性，甲基红试验阴性，柠檬酸盐试验阳性，脲酶试验阳性，苯丙氨酸脱氨酶试验阴性，赖氨酸脱羧酶试验阴性，鸟氨酸脱羧酶试验阳性，D-葡萄糖产酸试验阳性，D-葡萄糖产气试验阳性，卫矛醇试验阴性，棉籽糖试验阳性，氧化酶试验阴性，D-木糖试验阳性。

[0031] 该菌株产吲哚乙酸(IAA)能力测定：将所述阴沟肠杆菌BIA070接种于含有L-色氨酸的R2A液体培养基中，28℃，180rpm，摇床培养4d。用分光光度法测定菌悬液的OD600值，然后将菌悬液10000rpm离心10min，取上清液加入等体积Salkowski(50mL 35％HClO4+1mL0.5M FeCl3)比色液，避光静置30min，测定其OD530值。计算菌浓度OD600值为1时，单位体积发酵液中IAA的含量，通过IAA梯度稀释的标准曲线计算IAA的含量。通过测定，BIA070产IAA含量为193μg/(mL·OD600)-1。

[0032] 该菌株16SrDNA序列分析：：将所测16SrDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明：BIA070与阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae(ABA244288.1)的相似度达98.42％。结合菌落、菌体形态特征，生理生化特征和16SrDNA序列分析，将BIA070鉴定为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。

[0033] 菌株BIA070的16S rDNA序列如下：

[0034]ggccctggcggcaggctaccatgcagtcgacggtaacaggaagcagcttgctgcttcgctgacgagtggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcggatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcggggaggaaggcgataaggttaataaccttgtcgattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattcgaaactggcaggctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttgkaggttgtgccctttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaagggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaacttagcagagatgctttggtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggtccggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttactcacttgtgatccgtaccgg[0035] 该菌株为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，已于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11970。

[0036] 实施例2降低土壤pH试验

[0037] (1)BIA070菌剂制备

[0038] 将保存在斜面上的BIA070用三区划线的方法活化在LB(蛋白胨10g；NaCl 10g；酵母浸膏5g；琼脂15-20g；水1000ml；pH 7.0-7.2，分装，121℃灭菌20min)平板上。挑取单菌落至相应的10ml液体培养基中，37℃，180rpm培养24h。按1％接种量将种子液接种至相应的50ml液体培养基中进行发酵，37℃，180rpm培养2d。

[0039] (2)降低土壤pH试验

[0040] 将砂土，锯末，草炭按照一定比例进行混合(同蓝莓生长条件一致)，121℃，1h间歇灭菌；无菌条件下将1000g灭菌后基质加入200ml菌液，充分混匀，分装至4个锥形瓶中，棉塞封口，保持其透气性；定期补水，保持样品含水量不变，并取样测定灭菌样品pH变化。以不接种BIA070(浇灌相同量的培养基)作为对照，结果如图3所示。可以看出，在培养后期，添加BIA070处理的土壤pH显著降低。由此可见，BIA070在调节蓝莓土壤pH中具有较强的应用价值。

[0041] 实施例3蓝莓营养钵试验

[0042] (1)BIA070菌剂制备同实施例2

[0043] (2)营养钵苗试验于2015年4月17日，在山东省林业科学研究院苗圃进行，蓝莓苗为1年生蓝丰营养钵苗。将蓝莓容器苗定植后，取5ml菌液稀释10倍接种到蓝莓根部周围。以不接种菌液(浇灌相同量的培养基)作为对照组，每个处理10株，正常管理，调查主枝长和地径。试验结果如表1所示，同CK相比，接种BIA070处理的主枝长和地径分别增加了10.56％和15.05％，可见，BIA070具有促进蓝莓生长的作用。

[0044] 表1蓝莓营养钵苗试验结果

[0045]

[0046] 应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。