一种基于三维掺氮石墨烯/二硫化钼的γ-干扰素适体电极及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种基于三维掺氮石墨烯/二硫化钼的γ‑干扰素适体电极及其制备方法与应用。氮掺杂石墨烯/二硫化钼复合物(3D G‑N/MoS2)在溶液中带负电荷，辣根过氧化物酶(HRP)在溶液中带正电荷，通过静电吸引作用力结合成辣根过氧化物酶/氮掺杂石墨烯/二硫化钼复合物(HRP/3D G‑N/MoS2)。γ‑干扰素适体ssDNA通过静电吸引与π‑π分子间作用力与HRP/3D G‑N/MoS2结合，形成ssDNA/HRP/3D G‑N/MoS2/GCE适体修饰电极。该适体电极对γ‑干扰素的线性检测范围为10‑14‑10‑9M，最低检测限为3.3×10‑15M。实际样品的测定结果表明，该方法具有很好的适用性。

权利要求

1.一种基于三维掺氮石墨烯/二硫化钼的γ-干扰素适体电极的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料的制备；

2)辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料的制备称取适量三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料加入二次水中，超声共振一段时间后，加入辣根过氧化物酶，冰水浴搅拌，得到辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料，过滤后，将辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料分散在水中保存；

3)辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料适体修饰电极的制备玻碳电极预处理后，将步骤2)中得到的辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料滴涂在玻碳电极表面，制得辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼/裸玻碳修饰电极；

将制备的辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼/裸玻碳修饰电极浸在γ-干扰素适体ssDNA中进行培育，封闭电极，制得γ-干扰素电化学适体修饰电极。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中，三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料、辣根过氧化物酶和水加入的重量比为：1-3:4-12:1-3；

或步骤2)中，超声共振的时间为1-3h；

或步骤2)中，所述辣根过氧化物酶的浓度为2-6mg/mL；

或步骤2)中，冰水浴搅拌的时间为4-10h；

或步骤2)中，辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料的保存温度为4℃；

辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料分散在水中的浓度为8-12mg/mL。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中，辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料滴加到电极表面的体积为5-9μL；

或步骤3)中，所述ssDNA溶液的浓度为0.08-0.12mM；

或电极在ssDNA溶液中浸泡的时间为1-3h。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中，封闭电极的方法为：将浸泡过ssDNA的电极在0.8-1.5mM 6-巯基-1-己醇溶液中浸泡0.5-1.5h，避光放置1h，将电极再次用二次水和PBS清洗，制得γ-干扰素电化学适体电极。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：清洗的方法，包括如下步骤：依次用

100mM PBS、二次水和100mM PBS清洗。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中，裸玻碳电极的预处理方法，包括如下步骤：用Al2O3粉将电极表面打磨成镜面，清洗后，相继在二次水和乙醇溶液中超声

30s，将清洗干净的电极在0.5M的硫酸溶液中循环伏安至稳定，二次水冲洗干净后，室温晾干。

7.权利要求1-6任一所述方法制备得到的辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料适体修饰电极。

8.权利要求7所述辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料适体修饰电极在检测γ-干扰素中的应用。

9.权利要求7所述辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料适体修饰电极对γ-干扰素的检测方法，包括如下步骤：

1)配制不同浓度的干扰素标准溶液；

2)将制备的辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料适体修饰电极浸在步骤1)中制备的γ-干扰素的溶液中，36-38℃下静置0.8-1.2h，清洗后，得到组装的工作电极；

3)绘制工作曲线；

4)实际样品的检测。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：步骤3)中，电解槽中PBS的浓度为

100mM，亚甲基蓝的浓度为0.1mM，H2O2的浓度为2mM。

说明书

一种基于三维掺氮石墨烯/二硫化钼的γ-干扰素适体电极及

其制备方法与应用

背景技术

[0001] γ-干扰素(IFN-γ)，也被称为“免疫干扰素”或“免疫细胞干扰素”，是一种通过相关免疫基因的转录调控激活多种信号传导途径的细胞因子。γ-干扰素由活化的T细胞(胸腺衍化细胞)和自然杀伤细胞(NK细胞)分泌。γ-干扰素具有免疫调控、抗病毒、抗增殖和抗肿瘤的作用。与其他细胞因子相比，γ-干扰素在疾病发病前(2-5d)就有明显的变化，因此γ-干扰素是一种早期疾病检测的重要标记物。

[0002] γ-干扰素在人类血清和尿液中的浓度异常与许多疾病相关，如癌症、艾滋病和骨髓白血病。由于干扰素重要的生理特性，开发新的、快速、有效的方法对干扰素的检测具有重要意义。到目前为止，许多检测方法已经被报道，如电化学、表面增强拉曼光谱、比色法、荧光法等。其中，电化学适体传感器检测干扰素的方法引起了较大的研究兴趣。适体识别元件与各种电化学转换器的组合选择配用，决定着电化学适体传感器对目标物检测的选择专一性、灵敏性和检测精度。电极材料的选择，对于提高传感器的灵敏度至关重要。

[0003] 现有技术已经公开了多种针对γ-干扰素的电化学适体传感器及检测方法。刘等(Ying Liu，Nazgul Tuleouva，Erlan Ramanculov，and Alexander Revzin，Anal.Chem.，2010，82，8131-8136)报道了在金电极上，通过金硫键制备测定γ-干扰素的适体传感器，检测γ-干扰素的检出限为0.06nM。闫等(Genping Yan,Yonghong Wang,Xiaoxiao He,Kemin Wang,Jinquan Liu,Yudan Du，Biosensors and Bioelectronics，2013，44，57-63)报道了利用滚环放大技术在石墨烯界面可控组装的免标记电化学适体传感器用于γ-干扰素的测定，检测γ-干扰素的线性范围是0.1-0.7pM，检出限为0.065pM。

[0004] 石墨烯经氮掺杂后会影响碳原子的自旋密度和电荷分布，能带结构会有调整，导致石墨烯表面产生“活性位点”，这些活性位点可以直接参与催化反应，通过氮掺杂复合物的电化学活性得到明显提高。MoS2和石墨烯具有独特且类似的二维层状纳米结构，两者通过复合构成新的异质层间结构，该结构存在新的相互作用，有助于获得新的、更优异的性能。此外，基于两者在晶体结构和微观形貌上的匹配性和电学性能上的互补性，通过这两种材料复合所制备的新型纳米复合材料能够最大程度地显示二者之间的协同效应。

[0005] 虽然现有技术已经公开了多种电化学适体传感器及相应检测方法，但对于γ-干扰素的检测，如何提高其灵敏度，仍是本领域技术人员的关注热点。

发明内容

[0006] 针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种基于三维掺氮石墨烯/二硫化钼的γ-干扰素适体电极及其制备方法与应用。

[0007] 为了解决以上问题，本发明的技术方案为：

[0008] 一种基于三维掺氮石墨烯/二硫化钼的干扰素适体电极的制备方法，包括如下步骤：

[0009] 1)三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料(3D G-N/MoS2)的制备；

[0010] 2)辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料(HRP/3D G-N/MoS2)的制备

[0011] 称取适量三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料加入二次水中，超声共振一段时间后，加入辣根过氧化物酶，冰水浴搅拌，得到辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料，过滤后，将辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料分散在水中保存；

[0012] 3)辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料适体修饰电极(ssDNA/HRP/3D G-N/MoS2/GCE)的制备

[0013] 裸玻碳电极预处理后，将步骤2)中得到的辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料滴涂在玻碳电极(GCE)表面，制得辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼/裸玻碳(HRP/3D G-N/MoS2/GCE)修饰电极；

[0014] 将制备的HRP/3D G-N/MoS2/GCE修饰电极浸在γ-干扰素适体(ssDNA)中进行培育，封闭电极，制得γ-干扰素电化学适体修饰电极(ssDNA/HRP/3D G-N/MoS2/GCE)。

[0015] 优选的，步骤2)中，三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料、辣根过氧化物酶和水加入的重量比为：1-3:4-12:1-3。

[0016] 优选的，步骤2)中，超声共振的时间为1-3h，超声共振使得三维掺氮石墨烯/二硫化钼在水中分散均匀。

[0017] 优选的，步骤2)中，所述辣根过氧化物酶的浓度为2-6mg/mL。优选的，步骤2)中，冰水浴搅拌的时间为4-10h。

[0018] 优选的，步骤2)中，辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料的保存温度为4℃；辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料分散在水中的浓度为8-12mg/mL。

[0019] 优选的，步骤3)中，辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料滴加到电极表面的体积为5-9μL。

[0020] 优选的，步骤3)中，所述ssDNA溶液的浓度为0.08-0.12mM；

[0021] 或电极在ssDNA溶液中浸泡的时间为1-3h。

[0022] 优选的，步骤3)中，封闭电极的方法为：将浸泡过ssDNA的电极在0.8-1.5mM 6-巯基-1-己醇溶液中浸泡0.5-1.5h，避光放置1h，将电极再次用二次水和清洗液清洗，制得γ-干扰素电化学适体传感器，得到封闭的电极。

[0023] 进一步优选的，清洗的方法，包括如下步骤：依次用100mM磷酸盐缓冲溶液(PBS)、二次水和100mM PBS清洗。

[0024] 优选的，步骤3)中，裸玻碳电极的预处理方法，包括如下步骤：用Al2O3粉将电极表面打磨成镜面，清洗后，相继在二次水和乙醇溶液中超声30s，将清洗干净的电极在0.5M的硫酸溶液中循环伏安至稳定，二次水冲洗干净后，室温晾干。

[0025] 上述方法制备得到的辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料适体修饰电极。

[0026] 上述辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料适体修饰电极在检测γ-干扰素中的应用。

[0027] 上述辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料适体修饰电极对γ-干扰素的检测方法，包括如下步骤：

[0028] 1)配制不同浓度的γ-干扰素标准溶液；

[0029] 2)将制备的辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料适体修饰电极浸在步骤1)中制备的γ-干扰素溶液中，36-38℃下静置0.8-1.2h，清洗后，得到组装的工作电极；

[0030] 3)将参比电极、对电极和工作电极连接在电化学工作站上，在电解槽中加入PBS、亚甲基蓝(MB)和H2O2，然后用方波伏安法检测工作电极的电流响应，根据所得的电流响应与γ-干扰素标准溶液的浓度之间的关系，绘制工作曲线；

[0031] 4)实际样品的检测：对实际样品进行检测，根据测得的电流响应与步骤3)中的工作曲线，得出实际样品的γ-干扰素浓度。

[0032] 优选的，步骤3)中，电解槽中PBS的浓度为100mM，MB的浓度为0.1mM，H2O2的浓度为2mM。

[0033] 进一步的，本发明还公开了上述电化学适体传感器的再生方法，具体为检测后，传感器通过在1mMγ-干扰素适体溶液(ssDNA)中培育2h的方法再生。清洗后，再生的电极可以用于下一次检测。

[0034] 本发明的原理如下：

[0035] 本发明利用分子间静电吸引力，制备了γ-干扰素适体/辣根过氧化物酶/氮掺杂石墨烯/二硫化钼适体修饰电极(ssDNA/HRP/3D G-N/MoS2/GCE)。氮掺杂石墨烯/二硫化钼(3D G-N/MoS2)复合物在溶液中带负电荷，辣根过氧化物酶(HRP)在溶液中带正电荷，3D G-N/MoS2与HRP之间通过静电吸引作用力结合成辣根过氧化物酶/氮掺杂石墨烯/二硫化钼复合物(HRP/3D G-N/MoS2)，该材料具备良好的生物相容性。ssDNA通过静电吸引与π-π分子间作用力与辣根过氧化物酶/氮掺杂石墨烯/二硫化钼修饰电极(/HRP/3DG-N/MoS2/GCE)电极表面结合，形成ssDNA/HRP/3DG-N/MoS2/GCE适体修饰电极。在γ-干扰素存在的情况下，电极表面的γ-干扰素适体与γ-干扰素结合使得γ-干扰素适体离开电极表面，裸露出的辣根过氧化物酶HRP在MB-H2O2体系中产生电化学信号，从而实现对γ-干扰素的测定。

[0036] 本发明的有益技术效果为：

[0037] 类石墨烯化合物二硫化钼晶体由一个金属钼层和两个硫层构成，形成两个硫层夹着金属钼层的夹心结构，并通过范德华力堆积而成，每个钼原子被六个硫原子所包围，呈三角棱柱状，暴露出很多MoS2棱面，吸附力强。由于石墨烯具有大的比表面积、良好的导电性和化学稳定性，可以作为MoS2的载体，能有效改善MoS2的团聚问题，充分发挥两者在晶体结构和微观形貌上的匹配性和电学性能上的互补性及其协同效应。

[0038] 本方法制备的三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料，具有大的比表面积、良好的导电性和化学稳定性，大的比表面积可以增加电子的传输速率及测定灵敏度；石墨烯经氮掺杂后会影响碳原子的自旋密度和电荷分布，能带结构会有调整，导致石墨烯表面产生“活性位点”，这些活性位点可以直接参与催化反应，氮掺杂复合物的电化学活性得到明显提高，从而可进一步提高修饰电极的导电能力和灵敏度。

[0039] 本发明基于氮掺杂石墨烯/二硫化钼复合物(3D G-N/MoS2)复合材料结合适体识别技术及HRP-MB-H2O2体系，使传感器具有极高的灵敏度和选择性。使用本发明所述传感器进行检测，γ-干扰素的检测浓度线性范围为10-14-10-8M，最低检测限为3.3×10-15M。

附图说明

[0040] 图1为本发明适体传感器的制备及检测的原理图；

[0041] 图2为三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料的扫描电子显微镜图；

[0042] 图3本发明中HRP、ssDNA、3D G-N/MoS2和ssDNA/HRP/3DG-N/MoS2的紫外可见分光光谱图；

[0043] 图4干扰素的检测结果：A)为不同浓度γ-干扰素检测的SWV曲线，B)为峰电流与γ-干扰素浓度的负对数的线性关系。

具体实施方式

[0044] 下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

[0045] 实施例1

[0046] 试验试剂

[0047] γ-干扰素适体(ssDNA)：5’-GGGGTTGGTTGTGTTGGGTGTTGTGTC CAA CCC C-3’；干扰素适体的核苷酸序列与辣根过氧化物酶(HRP)购于生工生物有限公司。

[0048] 磷酸盐缓冲溶液(PBS)，6-巯基-1-己醇，亚甲基蓝(MB)，双氧水(H2O2)购于上海AIBI化学制剂有限公司。石墨粉、硫代乙酰胺、氯化钙、草酸、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)和盐酸，购自上海化学试剂公司。

[0049] 所有其他试剂均为分析纯。

[0050] 试验仪器

[0051] CHI 660C电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)、超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)、分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)；三电极系统中的参比电极、辅助电极和工作电极分别为饱和甘汞电极(SCE)、铂丝电极和修饰电极。

[0052] 本发明所提到的电位都是相对于SCE的电极电位，实验条件都是室温。

[0053] 三维掺氮石墨烯/二硫化钼的γ-干扰素适体电极的制备

[0054] 基于三维掺氮石墨烯/二硫化钼的γ-干扰素适体电极的制备方法，包括如下步骤：

[0055] 1)三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料的制备

[0056] 利用改进的Hummer法制备氧化石墨烯。采用专利(201510289262.9)制备三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料(3D G-N/MoS2)，取100mg GO分散于100mL水溶液(质量体积比为1:1)中，超声搅拌30min后，加入1.0g氯化钙和0.82g草酸粉末，同时将1.0g硫代乙酰胺和
0.32g钼酸钠溶于50ml二次水中，超声30min，将两种溶液混合，超声2h。转移到1000W的电磁炉上加热至80℃时，逐滴滴加NaOH(0.5M)将溶液的pH调节至10，同时继续加热，反应8h后，取沉淀，用二次水洗涤数次后，60℃下真空干燥8h，即得掺氮石墨烯/二硫化钼/草酸钙复合物。将制得的掺氮石墨烯/二硫化钼/草酸钙溶解在5M的盐酸水溶液中，超声震荡1h，重复洗涤三次，再用二次水洗涤数次到中性，过滤，随后在60℃的条件下真空干燥8h，得到三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料。

[0057] 2)辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料的制备

[0058] 取2mg三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料，加入2mL超纯水，超声共振1h后，加入2mL HRP(4mg/mL)，在冰水浴中搅拌6h，过滤，加水清洗三次，制得辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料(HRP/3DG-N/MoS2)分散到1mL的二次水中。在4℃的条件下保存。

[0059] 3)辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料适体修饰电极制备[0060] (1)裸玻碳电极用0.3μm的Al2O3粉打磨成镜面，二次水清洗后，相继在二次水和乙醇溶液中超声30s；将清洗干净的电极在0.5M的硫酸溶液中循环伏安至稳定，二次水冲洗干净后，室温晾干。

[0061] (2)取7.00μL HRP/3D G-N/MoS2滴涂在电极表面，避光低温晾干，制得HRP/3D G-N/MoS2/GCE。

[0062] (3)将经过(2)处理的电极浸在ssDNA(0.1mM)培育，室温2h，清洗。在含有50μL 1mM MCH(6-巯基-1-己醇)中1h，以封闭电极，之后清洗(100mM PBS，pH7.4；二次水清洗；100mM PBS，pH7.4)，制得辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料适体修饰电极(ssDNA/HRP/3DG-N/MoS2/GCE)。

[0063] 4)辣根过氧化物酶/三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料适体修饰电极对γ-干扰素的测定

[0064] (1)含有不同浓度的γ-干扰素检测溶液的制备：γ-干扰素在溶液(100mM PBS，pH 7.4，100mM NaCl，1mM MgCl2)中配制成浓度分别为10-14-10-9M的溶液(100μL)，储存在4℃下备用；

[0065] (2)制备的适体修饰电极浸在100μL已知浓度的γ-干扰素溶液中，37℃下静置1h，之后用二次水和清洗液(100mM PBS，pH 7.4)清洗，得到组装的工作电极；

[0066] (3)将参比电极、对电极和工作电极连接在电化学工作站上，在电解槽中加入10mL的溶液(100mM PBS，pH 7.4，0.1mM MB，2mM H2O2)，然后用方波伏安法检测适体修饰电极的电流响应，根据所得电流响应(ΔI＝I-I0，I0和I分别是HRP-MB-H2O2在γ-干扰素适体修饰电极与γ-干扰素作用之前和之后的峰电流)与γ-干扰素的标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线。

[0067] 检测原理示意图

[0068] γ-干扰素的检测原理如图1所示：氮掺杂石墨烯/二硫化钼(3D G-N/MoS2)复合物溶液带负电荷，辣根过氧化物酶(HRP)溶液带正电荷，3D G-N/MoS2与HRP之间通过静电吸引作用力结合成HRP/3D G-N/MoS2复合物，ssDNA在电极表面可以通过静电吸引与π-π分子间作用力，结合在HRP/3D G-N/MoS2电极表面，形成ssDNA/HRP/3D G-N/MoS2/GCE修饰电极。在γ-干扰素存在的情况下，γ-干扰素与γ-干扰素适体结合，γ-干扰素适体离开电极表面，电极在含有MB-H2O2溶液中电化学信号发生变化，随γ-干扰素浓度的增加电化学信号增加，从而间接实现适体修饰电极对γ-干扰素的电化学测定。

[0069] 实验结果

[0070] 1、表征：三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料的扫描电子显微镜图[0071] 如图2所示，三维掺氮石墨烯/二硫化钼复合材料为多孔状三维网络结构，具有大的比表面积、良好的导电性和化学稳定性，大的比表面积可以增加电子的传输速率及测定灵敏度；石墨烯经氮掺杂后会影响碳原子的自旋密度和电荷分布，能带结构会有调整，导致石墨烯表面产生“活性位点”，这些活性位点可以直接参与催化反应，通过氮掺杂复合物的电化学活性得到明显提高，从而可进一步提高适体电极的导电能力和灵敏度。

[0072] 由图3紫外可见吸收光谱图所示，HRP的吸收峰位置在402nm，复合物中402nm处仍然存在这个峰，说明HRP与3D-GN/MoS2通过静电作用相结合；γ-干扰素适体ssDNA的紫外可见吸收峰在260nm，ssDNA与HRP/3D-GN/MoS2复合后ssDNA的峰与3D-GN/MoS2的峰共存而发生重叠。

[0073] 3、γ-干扰素的检测：如图4所示，γ-干扰素的SWV的电化学信号的变化反映了γ-干扰素的浓度，检测范围大约为10-14-10-8M，检测限约为3.3×10-15M，实现γ-干扰素的高灵敏度检测。

[0074] 4、实际样品的γ-干扰素测定：对人血清样品中的γ-干扰素进行了测定，结果见表1。γ-干扰素的回收率分别为92.80-102.2％。实验中，每一个样品平行检测五次，相对标准偏差低于5％。以上结果表明，该方法具有很好的适用性。

[0075] 表1在稀释300倍的人血清中对γ-干扰素的检测

[0076]

[0077] 上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。