基于代谢组学的高尿酸性肾损伤早期诊断标志物及其应用

摘要

本发明公开了基于代谢组学的高尿酸性肾损伤早期诊断标志物，所述诊断标志物由以下化合物组成：尿素磷酸盐、吲哚丙烯酸、色氨酸、琥珀酸单薄荷酯、磷脂酰胆碱。本发明还公开了基于代谢组学的高尿酸性肾损伤早期诊断标志物的筛选方法。本发明还提供了基于代谢组学的高尿酸性肾损伤早期诊断标志物在制备和筛选高尿酸性肾损伤药物中的应用。本发明通过高效液相色谱‑串联质谱技术对患者血清进行微量代谢组学分析，发现正常人群和单纯性高尿酸（无肾损伤）人群之间的差异代谢物；进一步通过该技术分析正常人与尿酸性肾损伤患者之间的差异代谢物；找到由尿酸引起的肾损伤患者的特异性差异代谢产物，即高尿酸性肾损伤的早期诊断分子。

权利要求

1.基于代谢组学的高尿酸性肾损伤早期诊断标志物，其特征在于：所述诊断标志物由以下化合物组成：尿素磷酸盐、吲哚丙烯酸、色氨酸、琥珀酸单薄荷酯、磷脂酰胆碱，所述诊断标志物为血清标志物，所述磷脂酰胆碱为C23H48NO6P和C44H76NO8P。

2.权利要求1所述的基于代谢组学的高尿酸性肾损伤早期诊断标志物在制备和筛选高尿酸性肾损伤药物中的应用。

3.一种高尿酸性肾损伤诊断试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的诊断标志物。

说明书

基于代谢组学的高尿酸性肾损伤早期诊断标志物及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于临床检验诊断领域，具体涉及基于代谢组学的高尿酸性肾损伤早期诊断标志物及其应用。

背景技术

[0002] 高尿酸性肾损伤是由于血尿酸异常升高后对肾脏产生的病理损害，与血尿酸水平及持续时间成正比。高尿酸血症是发生慢性肾脏疾病的独立危险因素，已成为影响我国，尤其是经济较发达地区的重要公共卫生问题。

[0003] 目前临床上早期诊断尿酸性肾损伤主要通过测定血清尿酸水平，同时结合肌酐清除率、尿素氮等肾功能指标进行预判。但是这几种方法存在严重的不足，主要表现为以下几点：

[0004] 1)在高尿酸血症的居民中慢性肾病的患病率最高只有30％左右，因此，单独通过测定尿酸很难判断是否有肾脏损伤；

[0005] 2)即使尿酸升高且伴有肾功能不全，也有可能是糖尿病等其他疾病引起，并不一定是高尿酸单独引起的肾损伤，因此，容易受到其他疾病的干扰，特异性明显不足；

[0006] 3)目前主要的肾功能评判指标，肌酐、尿素氮、尿酸等均采用化学法检测，方法学上缺乏特异性性，只要是肾功能受损均会升高，无法确切反应该损伤是否由尿酸单独引起；

[0007] 4)肾功能其他评判指标，如肌酐、尿素氮等，均在肾脏显著受损时才会明显升高，因此，无法达到早期预警的目的，而且同样为非特异性检测指标，容易受到其他引起肾功能损伤的病因影响。

发明内容

[0008] 发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明通过高效液相色谱-串联质谱技术对患者血清进行微量代谢组学分析，发现正常人群和单纯性高尿酸(无肾损伤)人群之间的差异代谢物；进一步通过该技术分析正常人与尿酸性肾损伤患者之间的差异代谢物；找到由尿酸引起的肾损伤患者的特异性差异代谢产物，即高尿酸性肾损伤的早期诊断分子；本发明的第一个目的在于提供了基于代谢组学的高尿酸性肾损伤早期诊断标志物。本发明的第二个目的是提供了基于代谢组学的高尿酸性肾损伤早期诊断标志物的应用。

[0009] 技术方案：为了解决上述目的，本发明所采用的技术方案为：本发明提供了基于代谢组学的高尿酸性肾损伤早期诊断标志物，所述诊断标志物由以下化合物组成：尿素磷酸盐、吲哚丙烯酸、色氨酸、琥珀酸单薄荷酯、磷脂酰胆碱。

[0010] 所述诊断标志物为血清标志物。

[0011] 所述磷脂酰胆碱为C23H48NO6P和C44H76NO8P。

[0012] 所述的基于代谢组学的高尿酸性肾损伤早期诊断标志物的筛选方法，具体步骤如下：

[0013] 1)选取3组血清样本：正常对照组，高尿酸血症组，高尿酸合并肾损伤组，加入甲醇，涡旋静置，4℃下离心15分钟，取上清液即得供试品溶液；

[0014] 2)将供试品溶液进行液相色谱分析；

[0015] 3)然后再通过血清代谢组学轮廓分析、数据的前处理、多元统计分析并筛选差异代谢物，将这些差异代谢物的精确分子量与网络数据库进行比最终获得所述的基于代谢组学的高尿酸性肾损伤早期诊断标志物。

[0016] 所述的基于代谢组学的高尿酸性肾损伤早期诊断标志物在制备和筛选高尿酸性肾损伤药物中的应用。

[0017] 一种高尿酸性肾损伤诊断试剂盒，包括所述的诊断标志物。

[0018] 有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：

[0019] 1)本发明通过高效液相色谱-串联质谱技术对患者血清进行微量代谢组学分析，发现正常人群和单纯性高尿酸(无肾损伤)人群之间的差异代谢物；

[0020] 2)进一步通过该技术分析正常人与尿酸性肾损伤患者之间的差异代谢物；

[0021] 3)找到由尿酸引起的肾损伤患者的特异性差异代谢产物，即高尿酸性肾损伤的早期诊断分子。

附图说明

[0022] 图1为正，负离子模式下三组总离子流图(TICs)图.(A)正离子模式下正常对照组TIC图，(B)正离子模式下高尿酸组TIC图(C)正离子模式下肾损伤组TIC图。(D)负离子模式下正常对照组TIC图，(E)负离子模式下高尿酸组TIC图，(F)负离子模式下肾损伤组TIC图；

[0023] 图2为正常对照组和高尿酸组正负离子模式下PCA，PLS-DA的得分组。(A)正离子模式下PCA得分图(九个主成分，R2X＝0.603，Q2＝0.361)，(B)正离子模式下PLS-DA得分图(三个主成分，R2X＝0.372，R2Y＝0.991，Q2＝0.983)。(C)负离子模式下PCA得分图(八个主成分，R2X＝0.644，Q2＝0.464)，(D)负离子模式下PLS-DA得分图(四个主成分，R2X＝0.502，R2Y＝0.989，Q2＝0.959)；

[0024] 图3为正常对照组和肾损伤组正负离子模式下PCA，PLS-DA的得分组。(A)正离子模式下PCA得分图(七个主成分，R2X＝0.664，Q2＝0.429)，(B)正离子模式下PLS-DA得分图(两个主成分，R2X＝0.418，R2Y＝0.987，Q2＝0.975)。(C)负离子模式下PCA得分图(五个主成分，R2X＝0.607，Q2＝0.455)，(D)负离子模式下PLS-DA得分图(三个主成分，R2X＝0.488，R2Y＝0.985，Q2＝0.958)；

[0025] 图4为三组正负离子模式下PCA，PLS-DA的得分组。(A)正离子模式下PCA得分图(八个主成分，R2X＝0.649，Q2＝0.465)，(B)正离子模式下PLS-DA得分图(五个主成分，R2X＝0.527，R2Y＝0.986，Q2＝0.97。(C)负离子模式下PCA得分图(七个主成分，R2X＝0.632，Q2＝
0.489)，(D)负离子模式下PLS-DA得分图(七个主成分，R2X＝0.603，R2Y＝0.983，Q2＝
0.948)。

具体实施方式

[0026] 下面结合具体实施实例，进一步阐释本发明：

[0027] 实施例1：

[0028] 1.样品基本信息

[0029] 样本分为3组：分别为正常对照组，高尿酸血症组，高尿酸合并肾损伤组，初始样本120个，检测后剔除明显离群值，最后可进行表述的样本数依次为38,37,26个，共101个样本。基于上述样本进行代谢组学分析。具体分析如下：

[0030] 2.仪器与方法

[0031] 2.1仪器及试剂

[0032] 仪器：液相色谱Agilent 1290Infinity UHPLC，

[0033] 质谱Agilent 6530UHD and Accurate-Mass Q-TOF/MS

[0034] 色谱柱Waters ACQUITY UPLC@HSS T3(1.8um 100*2.1mm)

[0035] 试剂：甲醇、乙腈、甲酸为美国默克公司色谱级试剂

[0036] 2.2前处理条件

[0037] 取100μL血清，加入300μL甲醇，涡旋1分钟，4℃静置10min，13000转/分钟，4℃下离心15分钟，取上清液即得供试品溶液。

[0038] 2.3液相色谱方法

[0039] 流动相：A-0.1％甲酸溶液，B-乙腈(0.1％甲酸)

[0040] 流速：0.4ml/min，柱温：40℃，Post Time：5min，进样量：4ul

[0041] 样品分析梯度：

[0042]

[0043] 质谱方法正离子模式

[0044]

[0045]

[0046] 负离子模式：

[0047]

[0048]

[0049]

[0050] 二、数据分析

[0051] 1.血清代谢组学轮廓分析

[0052] 按照之前的色谱-质谱条件，对各组样本进行分析，各组样品正负离子模式下典型总离子流图(TIC)图1所示

[0053] 2.数据的前处理

[0054] 在R软件平台下采用XCMS程序代码进行峰的提取，对齐和反卷积分析，并根据80％原则进行峰的筛选，得到包含变量(保留时间Rt，质荷比m/z)、观测和峰强的三维可视化矩阵。将数据矩阵导入Simca-P软件(版本11.0)进行多元统计分析。

[0055] 3.多元统计分析

[0056] 为了考察各组与对照组相比代谢的变化，我们采用无监督的PCA和有监督的PLS-DA的分析方法来表征差异。见图2和图3。

[0057] 根据正常对照组与各组的PCA，PLS-DA得分图可以看出，正常对照组与各组有一定的分离趋势。为了表征各组之间整体的差异情况，对三组整体进行PCA与PLS-DA分析，见图4。

[0058] 从三组的PCA，PLS-DA的得分图可以看出，正常对照组和高尿酸组，肾损伤组均有一定分离趋势。PLS-DA的拟合度和预测能力均良好。

[0059] 我们采用正常对照-高尿酸组，正常对照-肾损伤组PLS-DA模型下的VIP值。VIP值反映了变量在差异中的重要性，常用来筛选差异代谢物。本研究中VIP>1的代谢物，我们认为是差异代谢物。我们进一步通过方差分析，对三组的差异变量进行统计学分析，进而进行对照组-高尿酸组，对照组-肾损伤组统计学分析。有显著性差异的变量认为是差异代谢物(阈值为0.05)。

[0060] 接着将这些差异代谢物的精确分子量与网络数据库进行比，比如HMDB(http://www.hmdb.ca)，METLIN(http://metlin.scripps.edu)和KEGG(http://www.kegg.jp)，最后确定了的物质作为潜在生物标志物(见表1)。

[0061] 表1

[0062]