抗PDL1抗体配制剂转让专利
申请号 : CN201480064099.X
文献号 : CN105793288B
文献日 : 2020-03-03
发明人 : Y·杨 , S·艾拉瓦塔
申请人 : 豪夫迈·罗氏有限公司
摘要 :
本发明提供包含抗PDL1抗体的稳定的含水药物配制剂。本发明还提供用于制备此类配制剂的方法和使用此类配制剂的方法。
权利要求 :
1.一种稳定的含水药物配制剂，该配制剂包含浓度为40mg/ml至125mg/ml的抗PDL1单克隆抗体，浓度为15mM至25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，浓度为60mM至240mM的蔗糖，浓度为0.005％(w/v)至0.06％(w/v)的聚山梨酯，且pH为5.0至6.3，其中所述单克隆抗体包含如SEQ ID NO：7所列的轻链可变区和如SEQ ID NO：32所列的重链可变区，其中所述单克隆抗体为人源化IgG1抗体。
2.权利要求1的配制剂，其中该配制剂中的所述单克隆抗体为40mg/ml至80mg/ml。
3.权利要求1的配制剂，其中该配制剂中的所述单克隆抗体为54mg/ml至66mg/ml。
4.权利要求1的配制剂，其中该配制剂中的所述单克隆抗体为60mg/ml。
5.权利要求1的配制剂，其中该配制剂中的所述单克隆抗体为60mg/ml至125mg/ml。
6.权利要求1的配制剂，其中该配制剂中的所述单克隆抗体为125mg/ml。
7.权利要求1-6任一项的配制剂，其中所述组氨酸乙酸酯或乙酸钠的浓度为17mM至
22mM。
8.权利要求1-6任一项的配制剂，其中所述组氨酸乙酸酯或乙酸钠的浓度为20mM。
9.权利要求1-8任一项的配制剂，其中该配制剂中的所述蔗糖为60mM至180mM。
10.权利要求1-8任一项的配制剂，其中该配制剂中的所述蔗糖为120mM。
11.权利要求1-10任一项的配制剂，其中该配制剂具有5.5至6.1的pH。
12.权利要求1-10任一项的配制剂，其中该配制剂具有5.5或5.8的pH。
13.权利要求1-12任一项的配制剂，其中该配制剂中的所述聚山梨酯为聚山梨酯20。
14.权利要求1-13任一项的配制剂，其中该配制剂中的所述聚山梨酯为0.02％(w/v)至
0.04％(w/v)。
15.权利要求1的配制剂，其中该配制剂中的所述单克隆抗体为60mg/ml，该配制剂中的蔗糖为120mM，且pH为5.8。
16.权利要求1的配制剂，其中该配制剂中的所述单克隆抗体为125mg/ml，该配制剂中的蔗糖为240mM，且pH为5.5。
17.权利要求1-16任一项的配制剂，其中所述单克隆抗体未进行在先冻干。
18.权利要求1-17任一项的配制剂，其中所述单克隆抗体贮存在玻璃管形瓶或金属合金容器中。
19.权利要求18的配制剂，其中该金属合金为316L不锈钢或哈斯特镍合金。
20.权利要求1-19任一项的配制剂，其中该配制剂于2-8℃稳定至少6个月。
21.权利要求1-19任一项的配制剂，其中该配制剂于2-8℃稳定至少12个月。
22.权利要求1-19任一项的配制剂，其中该配制剂于2-8℃稳定至少18个月。
23.权利要求1-19任一项的配制剂，其中该配制剂于2-8℃稳定至少24个月。
24.权利要求20-23任一项的配制剂，其中该配制剂中的该抗体在贮存后保留它的生物学活性的至少80％。
25.权利要求24的配制剂，其中该生物学活性是通过抗体结合PD-L1而测量的。
26.权利要求1-25任一项的配制剂，其是无菌的。
27.权利要求1-26任一项的配制剂，其适合于施用于受试者。
28.权利要求1-27任一项的配制剂，其用于静脉内(IV)施用。
29.权利要求1的配制剂，其中所述单克隆抗体的量为60mg/mL，所述组氨酸乙酸酯的浓度为20mM，所述蔗糖的浓度为120mM，且所述聚山梨酯为聚山梨酯20，浓度为0.04％(w/v)，且所述配制剂具有5.8的pH。
30.权利要求1的配制剂，其中所述单克隆抗体的量为125mg/mL，所述组氨酸乙酸酯的浓度为20mM，所述蔗糖的浓度为240mM，且所述聚山梨酯为聚山梨酯20，浓度为0.02％(w/v)，且所述配制剂具有5.5的pH。
31.权利要求1-30任一项的配制剂，其中所述单克隆抗体包含如SEQ ID NO：9所列的轻链和如SEQ ID NO：10所列的重链。
32.权利要求1-30任一项的配制剂，其中该单克隆抗体为IgG1抗体且包含恒定区中的N297A替代，残基编号方式为Kabat中的EU索引的残基编号方式。
33.一种制品，其包含装有权利要求1-32任一项的稳定的含水药物配制剂的容器。
34.权利要求33的制品，其中该容器为玻璃管形瓶或金属合金容器。
35.权利要求34的制品，其中该金属合金为316L不锈钢或哈斯特镍合金。
36.有效量的权利要求1-32任一项的配制剂在制备用于治疗受试者中的疾病或病症的药物中的用途，其中该疾病或病症选自下组：感染，癌症，和炎性疾病。
说明书 :
抗PDL1抗体配制剂
[0001] 对相关申请的交叉援引
[0002] 本申请要求2013年9月27日提交的流水号61/883,953的美国临时申请的优先权，通过援引将其完整收入本文。
[0003] ASCII文本文件的序列表的提交
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24KB)。
发明领域
24KB)。
发明领域
[0005] 本发明涉及包含抗PDL1抗体的稳定的含水药物配制剂。
[0006] 发明背景
[0007] 对T细胞提供两种截然不同的信号是一种关于抗原呈递细胞(APC)对静息T淋巴细胞的淋巴细胞活化的广泛公认的模型。Lafferty等，Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci.53：27-42
(1975)。此模型进一步提供了自身与非自身的辨别和免疫耐受性。Bretscher等，Science
169：1042-1049(1970)；Bretscher，P.A.，P.N.A.S.USA 96：185-190(1999)；Jenkins等，J.Exp.Med.165：302-319(1987)。在主要组织相容性复合物(MHC)的背景中呈递的外来抗原
肽的识别后，第一信号或抗原特异性信号经由T细胞受体(TCR)转导。第二或共刺激信号通
过抗原呈递细胞(APC)上表达的共刺激分子投递至T细胞，并且诱导T细胞以促进克隆扩充，
细胞因子分泌和效应器功能。Lenschow等，Ann.Rev.Immunol.14：233(1996)。在共刺激缺失下，T细胞能变得对抗原刺激不应，不发起有效的免疫应答，并且进一步可以导致对外来抗
原的耐受性或耗竭。
(1975)。此模型进一步提供了自身与非自身的辨别和免疫耐受性。Bretscher等，Science
169：1042-1049(1970)；Bretscher，P.A.，P.N.A.S.USA 96：185-190(1999)；Jenkins等，J.Exp.Med.165：302-319(1987)。在主要组织相容性复合物(MHC)的背景中呈递的外来抗原
肽的识别后，第一信号或抗原特异性信号经由T细胞受体(TCR)转导。第二或共刺激信号通
过抗原呈递细胞(APC)上表达的共刺激分子投递至T细胞，并且诱导T细胞以促进克隆扩充，
细胞因子分泌和效应器功能。Lenschow等，Ann.Rev.Immunol.14：233(1996)。在共刺激缺失下，T细胞能变得对抗原刺激不应，不发起有效的免疫应答，并且进一步可以导致对外来抗
原的耐受性或耗竭。
[0008] 在两信号模型中，T细胞接受正和负第二共刺激信号两者。此类正和负信号的调节对于在维持免疫耐受性和防止自身免疫的同时使宿主的保护性免疫应答最大化是至关重
要的。负第二信号对于诱导T细胞耐受性似乎是必需的，而正信号促进T细胞活化。虽然简单
的两信号模型仍然为幼稚淋巴细胞提供有效解释，但是宿主的免疫应答是一个动态过程，
并且也可以对抗原暴露的T细胞提供共刺激信号。共刺激的机制是治疗学方面感兴趣的，因
为已经显示了共刺激信号的操作提供增强或终止基于细胞的免疫应答的手段。最近，已经
发现了T细胞功能障碍或无反应性与抑制性受体(编程性死亡1多肽(PD-1))的诱导且持续
的表达并行发生。因此，PD-1和经由与PD-1的相互作用发信号的其它分子，诸如编程性死亡
配体1(PD-L1)和编程性死亡配体2(PD-L2)的治疗性靶向是强烈感兴趣的领域。
要的。负第二信号对于诱导T细胞耐受性似乎是必需的，而正信号促进T细胞活化。虽然简单
的两信号模型仍然为幼稚淋巴细胞提供有效解释，但是宿主的免疫应答是一个动态过程，
并且也可以对抗原暴露的T细胞提供共刺激信号。共刺激的机制是治疗学方面感兴趣的，因
为已经显示了共刺激信号的操作提供增强或终止基于细胞的免疫应答的手段。最近，已经
发现了T细胞功能障碍或无反应性与抑制性受体(编程性死亡1多肽(PD-1))的诱导且持续
的表达并行发生。因此，PD-1和经由与PD-1的相互作用发信号的其它分子，诸如编程性死亡
配体1(PD-L1)和编程性死亡配体2(PD-L2)的治疗性靶向是强烈感兴趣的领域。
[0009] PD-L1在许多癌症中过表达，并且常常与较差的预后有关(Okazaki T等，Intern.Immun.2007，19(7)：813；Thompson RH等，Cancer Res 2006，66(7)：3381)。有趣的是，与正常组织中的T淋巴细胞和外周血T淋巴细胞形成对比，大多数肿瘤浸润性T淋巴细胞
主要表达PD-1，这指示肿瘤反应性T细胞上PD-1的上调能促成受损的抗肿瘤免疫应答
(Blood 2009 114(8)：1537)。这可能是由于利用由与表达PD-1的T细胞相互作用的表达PD-
L1的肿瘤细胞介导的PD-L1信号传导以导致T细胞活化的减弱及逃避免疫监视(Sharpe等，
Nat Rev 2002；Keir ME等，2008 Annu.Rev.Immunol.26：677)。因此，对PD-L1/PD-1相互作用的抑制可以增强CD8+T细胞介导的肿瘤杀伤。
主要表达PD-1，这指示肿瘤反应性T细胞上PD-1的上调能促成受损的抗肿瘤免疫应答
(Blood 2009 114(8)：1537)。这可能是由于利用由与表达PD-1的T细胞相互作用的表达PD-
L1的肿瘤细胞介导的PD-L1信号传导以导致T细胞活化的减弱及逃避免疫监视(Sharpe等，
Nat Rev 2002；Keir ME等，2008 Annu.Rev.Immunol.26：677)。因此，对PD-L1/PD-1相互作用的抑制可以增强CD8+T细胞介导的肿瘤杀伤。
[0010] 靶向PD-1和经由与PD-1的相互作用发信号的其它分子，诸如编程性死亡配体1(PD-L1)和编程性死亡配体2(PD-L2)的治疗剂是强烈感兴趣的领域。已经提出抑制PD-1信
号传导作为增强T细胞免疫以治疗癌症(例如肿瘤免疫)和感染(包括急性和慢性(例如持久
的)感染二者)的手段。然而，既然针对此途径中的靶物的最佳治疗剂仍然有待商品化，那么
存在重大的未满足的医疗需求。
号传导作为增强T细胞免疫以治疗癌症(例如肿瘤免疫)和感染(包括急性和慢性(例如持久
的)感染二者)的手段。然而，既然针对此途径中的靶物的最佳治疗剂仍然有待商品化，那么
存在重大的未满足的医疗需求。
[0011] 通过援引将本文中引用的所有参考文献(包括专利申请，专利公开文本，和UniProtKB/Swiss-Prot登录号)完整收入本文，就像具体和个别指出通过援引收录每一篇
单独的参考文献一样。
单独的参考文献一样。
[0012] 发明概述
[0013] 本文中提供的是包含抗体的稳定的含水药物配制剂。该配制剂包含抗体(例如抗PDL1抗体)，缓冲剂，蔗糖，和表面活性剂，其中该配制剂具有约5.0至约7.0的pH。
[0014] 一方面，本文中提供的是一种稳定的含水药物配制剂，该配制剂包含浓度为约40mg/ml至约125mg/ml的抗PDL1单克隆抗体，浓度为约15mM至约25mM的组氨酸乙酸酯或乙
酸钠，浓度为约60mM至约240mM的蔗糖，浓度为约0.005％(w/v)至约0.06％(w/v)的聚山梨
酯，且pH为约5.0至约6.3。
酸钠，浓度为约60mM至约240mM的蔗糖，浓度为约0.005％(w/v)至约0.06％(w/v)的聚山梨
酯，且pH为约5.0至约6.3。
[0015] 在一些实施方案中，该配制剂中的该单克隆抗体为约40mg/ml至约80mg/ml。在一些实施方案中，该配制剂中的该单克隆抗体为约54mg/ml至约66mg/ml。在一些实施方案中，
该配制剂中的该单克隆抗体为约60mg/ml。在一些实施方案中，该配制剂中的该单克隆抗体
为约60mg/ml至约125mg/ml。在一些实施方案中，该配制剂中的该单克隆抗体为约125mg/
ml。
该配制剂中的该单克隆抗体为约60mg/ml。在一些实施方案中，该配制剂中的该单克隆抗体
为约60mg/ml至约125mg/ml。在一些实施方案中，该配制剂中的该单克隆抗体为约125mg/
ml。
[0016] 在一些实施方案中，该配制剂中的所述组氨酸乙酸酯或乙酸钠的浓度为约17mM至约22mM。在一些实施方案中，该配制剂中的所述组氨酸乙酸酯或乙酸钠的浓度为约20mM。
[0017] 在一些实施方案中，该配制剂中的所述蔗糖为约60mM至约180mM。在一些实施方案中，该配制剂中的所述蔗糖为约120mM。在一些实施方案中，该配制剂中的所述蔗糖为约
240mM。
240mM。
[0018] 在一些实施方案中，该配制剂具有约5.5至约6.1的pH。在一些实施方案中，该配制剂具有约5.5或约5.8的pH。
[0019] 在一些实施方案中，该配制剂中的所述聚山梨酯为聚山梨酯20。在一些实施方案中，该配制剂中的所述聚山梨酯(例如聚山梨酯20)为约0.02％至约0.04％。
[0020] 在一些实施方案中，该配制剂中的所述单克隆抗体为约60mg/ml，该配制剂中的蔗糖为约120mM，且pH为约5.8。在一些实施方案中，该配制剂中的所述单克隆抗体为约125mg/
ml，该配制剂中的蔗糖为约240mM，且pH为约5.5。
ml，该配制剂中的蔗糖为约240mM，且pH为约5.5。
[0021] 在一些实施方案中，该配制剂包含量为约60mg/mL的单克隆抗体(例如本文所述抗PDL1抗体)，浓度为约20mM的组氨酸乙酸酯，浓度为约120mM的蔗糖，和为聚山梨酯20，浓度
为0.04％(w/v)的聚山梨酯，且该配制剂具有约5.8的pH。
为0.04％(w/v)的聚山梨酯，且该配制剂具有约5.8的pH。
[0022] 在一些实施方案中，该配制剂包含量为约125mg/mL的单克隆抗体，浓度为约20mM的组氨酸乙酸酯，浓度为约240mM的蔗糖，和为聚山梨酯20，浓度为0.02％的聚山梨酯，且该配制剂具有约5.5的pH。
[0023] 在一些实施方案中，该配制剂中的所述单克隆抗体未进行在先冻干。在一些实施方案中，该配制剂中的所述单克隆抗体为全长抗体。在一些实施方案中，该配制剂中的所述
单克隆抗体为IgG1抗体。在一些实施方案中，该配制剂中的所述单克隆抗体为人源化抗体。
在一些实施方案中，该配制剂中的所述单克隆抗体为包含抗原结合区的抗体片段。在一些
实施方案中，该抗体片段为Fab或F(ab′)2片段。
单克隆抗体为IgG1抗体。在一些实施方案中，该配制剂中的所述单克隆抗体为人源化抗体。
在一些实施方案中，该配制剂中的所述单克隆抗体为包含抗原结合区的抗体片段。在一些
实施方案中，该抗体片段为Fab或F(ab′)2片段。
[0024] 在一些实施方案中，该配制剂中的所述单克隆抗体包含
[0025] (a)包含下述各项的轻链可变区：
[0026] (1)包含氨基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：1)的HVR-L1；
[0027] (2)包含氨基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：2)的HVR-L2；
[0028] (3)包含氨基酸序列QQYLYHPAT(SEQ ID NO：3)的HVR-L3；
[0029] 和
[0030] (b)包含下述各项的重链可变区：
[0031] (1)包含氨基酸序列GFTFSDSWIH(SEQ ID NO：4)的HVR-H1；
[0032] (2)包含氨基酸序列AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：5)的HVR-H2；
[0033] (3)包含氨基酸序列RHWPGGFDY(SEQ ID NO：6)的HVR-H3。
[0034] 在一些实施方案中，该配制剂中的所述单克隆抗体包含包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的轻链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO：8的重链可变区。在一些实施方案中，该配制剂中的所述单克隆抗体包含与具有氨基酸序列SEQ ID NO：7的轻链可变区具有至少
85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性的轻链可变区和与具有氨基酸序列SEQ ID NO：8的重链可变区具有至少85％，
86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的重链可变区。在一些实施方案中，该配制剂中的所述单克隆抗体包含包含氨基酸序列SEQ
ID NO：7的轻链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO：32的重链可变区。在一些实施方案中，该配制剂中的所述单克隆抗体包含与具有氨基酸序列SEQ ID NO：7的轻链可变区具有至少
85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性的轻链可变区和与具有氨基酸序列SEQ ID NO：32的重链可变区具有至少85％，
86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的重链可变区。在一些实施方案中，该配制剂中的所述单克隆抗体包含包含氨基酸序列SEQ
ID NO：9的轻链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的重链。在一些实施方案中，该配制剂中的所述单克隆抗体包含与具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的轻链具有至少85％，86％，87％，
88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性的轻链和与具有氨基酸序列SEQ ID NO：10的重链具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，
91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的重链。
85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性的轻链可变区和与具有氨基酸序列SEQ ID NO：8的重链可变区具有至少85％，
86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的重链可变区。在一些实施方案中，该配制剂中的所述单克隆抗体包含包含氨基酸序列SEQ
ID NO：7的轻链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO：32的重链可变区。在一些实施方案中，该配制剂中的所述单克隆抗体包含与具有氨基酸序列SEQ ID NO：7的轻链可变区具有至少
85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性的轻链可变区和与具有氨基酸序列SEQ ID NO：32的重链可变区具有至少85％，
86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的重链可变区。在一些实施方案中，该配制剂中的所述单克隆抗体包含包含氨基酸序列SEQ
ID NO：9的轻链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的重链。在一些实施方案中，该配制剂中的所述单克隆抗体包含与具有氨基酸序列SEQ ID NO：9的轻链具有至少85％，86％，87％，
88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％序列同一性的轻链和与具有氨基酸序列SEQ ID NO：10的重链具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，
91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的重链。
[0035] 在一些实施方案中，包含抗体的配制剂贮存在玻璃管形瓶或金属合金容器中。在一些实施方案中，该金属合金为316L不锈钢或哈斯特镍合金。在一些实施方案中，该配制剂
于2-8℃稳定至少6个月，至少12个月，至少18个月或至少24个月。在一些实施方案中，该配
制剂中的该抗体在贮存后保留在贮存前的生物学活性的至少约75％，至少约80％，至少约
85％，至少约90％。在一些实施方案中，该生物学活性是通过抗体结合PD-L1而测量的。
于2-8℃稳定至少6个月，至少12个月，至少18个月或至少24个月。在一些实施方案中，该配
制剂中的该抗体在贮存后保留在贮存前的生物学活性的至少约75％，至少约80％，至少约
85％，至少约90％。在一些实施方案中，该生物学活性是通过抗体结合PD-L1而测量的。
[0036] 在一些实施方案中，本文所述配制剂是无菌的。在一些实施方案中，本文所述配制剂适合于施用于受试者。在一些实施方案中，本文所述配制剂用于静脉内(IV)施用。
[0037] 另一方面，本文中提供的是一种制品或试剂盒，其包含装有上文和本文所述任何稳定的含水药物配制剂的容器。在一些实施方案中，该容器为玻璃管形瓶或金属合金容器。
在一些实施方案中，该金属合金为316L不锈钢或哈斯特镍合金。
在一些实施方案中，该金属合金为316L不锈钢或哈斯特镍合金。
[0038] 另一方面，本文中提供的是一种治疗受试者中的疾病或病症的方法，其包括将有效量的本文所述配制剂施用于该受试者，其中该疾病或病症选自下组：感染，癌症，和炎性
疾病。
疾病。
[0039] 要理解，可以组合本文所述各个实施方案的一项，一些，或所有特性以形成本发明的其它实施方案。本发明的这些和其它方面对于本领域技术人员会变得显然。本发明的这
些和其它实施方案通过下面的详述进一步描述。
些和其它实施方案通过下面的详述进一步描述。
[0040] 附图简述
[0041] 图1为一系列图，显示使用JMP软件对通过ICIEF获得的α-PDL1配制剂在40℃的稳定性数据的统计学分析。A)来自部分(fractional)析因(factorial)实验设计(design of
experiments)(DOE)的平均主峰损失速率。B)来自部分析因DOE的主峰分析。主峰含有α-
PDL1带电荷种类，其具有与该分子的pI(等电点)相同的pH。
experiments)(DOE)的平均主峰损失速率。B)来自部分析因DOE的主峰分析。主峰含有α-
PDL1带电荷种类，其具有与该分子的pI(等电点)相同的pH。
[0042] 图2为一系列图，显示使用JMP软件对通过ICIEF获得的α-PDL1配制剂在25℃的稳定性数据的统计学分析。A)来自部分析因实验设计(DOE)的平均主峰损失速率。B)来自部分
析因DOE的主峰分析。主峰含有α-PDL1带电荷种类，其具有与该分子的pI(等电点)相同的
pH。
析因DOE的主峰分析。主峰含有α-PDL1带电荷种类，其具有与该分子的pI(等电点)相同的
pH。
[0043] 图3为一系列图，显示使用JMP软件对通过SE-HPLC获得的α-PDL1配制剂在40℃的稳定性数据的统计学分析。A)来自部分析因实验设计(DOE)的平均主峰损失速率。B)来自部
分析因DOE的主峰分析。主峰含有α-PDL1单体。
分析因DOE的主峰分析。主峰含有α-PDL1单体。
[0044] 图4为一系列图，显示使用JMP软件对通过SE-HPLC获得的α-PDL1配制剂在25℃的稳定性数据的统计学分析。A)来自部分析因实验设计(DOE)的平均主峰损失速率。B)来自部
分析因DOE的主峰分析。主峰含有α-PDL1单体。
分析因DOE的主峰分析。主峰含有α-PDL1单体。
[0045] 图5为一幅图，显示于多种温度贮存多种时间的多种α-PDL1配制剂没有显著的PS20降解。F1至F10配制剂中，配制剂中剩余的百分比(％)PS20的图，如通过蒸发光散射检
测仪(ELSD)检测的。a为时间零(T0)；b为40℃，1M；c为25℃，2M；d为5℃，2M；e为5℃，6M；f为5℃，6M，20cc玻璃管形瓶(GV)，高填充；而g为5℃，6M，20cc玻璃管形瓶(GV)，低填充。
测仪(ELSD)检测的。a为时间零(T0)；b为40℃，1M；c为25℃，2M；d为5℃，2M；e为5℃，6M；f为5℃，6M，20cc玻璃管形瓶(GV)，高填充；而g为5℃，6M，20cc玻璃管形瓶(GV)，低填充。
[0046] 图6为一系列图，显示在玻璃管形瓶(GV)中于-20℃或5℃贮存长达6个月的α-PDL1配制剂的稳定性。A)于-20℃贮存所示时间期间5个冷冻融化循环后配制剂中的百分比(％)
单体的图。B)于5℃贮存所示时间的配制剂中的百分比(％)单体的图。C)于-20℃贮存所示
时间期间5个冷冻融化循环后自配制剂获得的百分比(％)主峰的图。D)自于5℃贮存所示时
间的配制剂获得的百分比(％)主峰的图。
单体的图。B)于5℃贮存所示时间的配制剂中的百分比(％)单体的图。C)于-20℃贮存所示
时间期间5个冷冻融化循环后自配制剂获得的百分比(％)主峰的图。D)自于5℃贮存所示时
间的配制剂获得的百分比(％)主峰的图。
[0047] 图7为一系列图，显示α-PDL1配制剂在3个冷冻融化循环及在不锈钢或哈斯特镍合金迷你罐中贮存后的稳定性。A)在于所示温度贮存3个月后配制剂中的百分比(％)单体的
图。B)在于所示温度贮存3个月后配制剂中的百分比(％)主峰的图。
图。B)在于所示温度贮存3个月后配制剂中的百分比(％)主峰的图。
[0048] 图8为一系列图，显示在20cc管形瓶中贮存的α-PDL1配制剂的稳定性。A)在于所示温度贮存3个月后配制剂中的百分比(％)单体的图。B)在于所示温度贮存3个月后配制剂中
的百分比(％)主峰的图。
的百分比(％)主峰的图。
[0049] 图9为一系列图，显示在玻璃管形瓶中摇动时含有多种浓度的PS20的α-PDL1配制剂的稳定性。A)于室温摇动所示时间后配制剂中的百分比(％)单体的图。B)于室温摇动所
示时间后通过350nm吸光度测量的浊度的图。
示时间后通过350nm吸光度测量的浊度的图。
[0050] 图10为一幅图，显示在玻璃管形瓶中于所示温度贮存一段时间，然后进行摇动的α-PDL1配制剂的稳定性。通过SEC测量配制剂中的百分比单体变化。
[0051] 图11为一系列图，显示随着逐渐升高的pH，每周α-PDL1损失速率的可比性。A)在于40℃贮存后配制剂中的每周百分比(％)单体损失的图。B)在于40℃贮存后配制剂中的每周
百分比(％)主峰损失的图。
百分比(％)主峰损失的图。
[0052] 发明详述
[0053] I.定义
[0054] 在详细描述本发明之前，要理解，本发明不限于特定组合物或生物学系统，它们当然可以有所变化。还要理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并非意图
是限制性的。如本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”，“一种”和“该”包括复数所指物，除非上下文另有明确说明。如此，例如，提到“一个/种分子”任选包括两个/种或更多个/种此类分子的组合，诸如此类。
是限制性的。如本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”，“一种”和“该”包括复数所指物，除非上下文另有明确说明。如此，例如，提到“一个/种分子”任选包括两个/种或更多个/种此类分子的组合，诸如此类。
[0055] 如本文中使用的，术语“约”指此技术领域中的技术人员容易知道的相应数值的常规误差范围。本文中提到“约”数值或参数包括(且描述)指向该数值或参数本身的实施方
案。
案。
[0056] 理解的是，本文所述发明的各个方面和实施方案包括“包含”，“由......组成”，和“基本上由......组成”方面和实施方案。
[0057] 术语“药物配制剂”指如下形式的制备物，使得允许活性组分的生物学活性有效，且不含对会施用配制剂的受试者有不可接受的毒性的别的成分。此类配制剂是无菌的。“药
学可接受”赋形剂(媒介，添加剂)为那些可合理施用于受试哺乳动物以提供有效剂量的所
采用的活性组分的。
学可接受”赋形剂(媒介，添加剂)为那些可合理施用于受试哺乳动物以提供有效剂量的所
采用的活性组分的。
[0058] “无菌”配制剂没有活菌或者没有或基本上没有所有活的微生物及其孢子。
[0059] “冷冻”配制剂为处于0℃以下的温度的配制剂。一般地，冷冻配制剂不是冷冻干燥的，也未进行在先或后续冻干。在某些实施方案中，冷冻配制剂包含供贮藏的冷冻药物原料
(在不锈钢罐中)或冷冻药物产品(在最终管形瓶构造中)。
(在不锈钢罐中)或冷冻药物产品(在最终管形瓶构造中)。
[0060] “稳定”配制剂为其中的蛋白质在贮藏后基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的配制剂。优选地，配制剂在贮藏后基本上保留其物理和化学稳定性，
以及其生物学活性。贮藏期一般基于配制剂的预定保存期来选择。多种用于测量蛋白质稳
定性的分析技术是本领域可得的且综述于例如Peptide and Protein Drug Delivery，
247-301，Vincent Lee Ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Pubs.(1991)及Jones，A.Ad v.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)。可测量在选定温度贮藏选定时间段后的稳
定性。可以多种不同方式定性和/或定量评估稳定性，包括评估聚集体形成(例如使用大小
排阻层析，通过测量浊度，和/或通过目测检查)；使用阳离子交换层析，图像毛细管等电聚
焦(icIEF)或毛细管区带电泳评估电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；
SDS-PAGE分析以比较还原的和完整的抗体；肽图(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评估抗体的
生物学活性或抗原结合功能；等。不稳定性可涉及下述任一项或多项：聚集，脱酰胺(例如
Asn脱酰胺)，氧化(例如Met氧化)，异构化(例如Asp异构化)，修剪/水解/片段化(例如铰链
区片段化)，琥珀酰亚胺形成，不配对的半胱氨酸，N端延伸，C端加工，糖基化差异，等。
以及其生物学活性。贮藏期一般基于配制剂的预定保存期来选择。多种用于测量蛋白质稳
定性的分析技术是本领域可得的且综述于例如Peptide and Protein Drug Delivery，
247-301，Vincent Lee Ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Pubs.(1991)及Jones，A.Ad v.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)。可测量在选定温度贮藏选定时间段后的稳
定性。可以多种不同方式定性和/或定量评估稳定性，包括评估聚集体形成(例如使用大小
排阻层析，通过测量浊度，和/或通过目测检查)；使用阳离子交换层析，图像毛细管等电聚
焦(icIEF)或毛细管区带电泳评估电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；
SDS-PAGE分析以比较还原的和完整的抗体；肽图(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评估抗体的
生物学活性或抗原结合功能；等。不稳定性可涉及下述任一项或多项：聚集，脱酰胺(例如
Asn脱酰胺)，氧化(例如Met氧化)，异构化(例如Asp异构化)，修剪/水解/片段化(例如铰链
区片段化)，琥珀酰亚胺形成，不配对的半胱氨酸，N端延伸，C端加工，糖基化差异，等。
[0061] 若在目测检查颜色和/或澄清度时，或根据UV光散射或大小排阻层析的测量，蛋白质显示很少的聚集，沉淀和/或变性或没有上述迹象，则蛋白质在药物配制剂中“保留其物
理稳定性”。
理稳定性”。
[0062] 若在给定时间的化学稳定性使得蛋白质被认定为仍然保留其生物学活性，如下文定义的，则蛋白质在药物配制剂中“保留其化学稳定性”。化学稳定性可通过检测和定量蛋
白质的化学改变形式来评估。化学改变可涉及大小修饰(例如修剪)，这可使用例如大小排
阻层析，SDS-PAGE和/或基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱术(MALDI/TOF MS)来评估。
其它类型的化学改变包括电荷改变(例如因脱酰胺而发生的)，其可通过例如离子交换层析
或icIEF来评估。
白质的化学改变形式来评估。化学改变可涉及大小修饰(例如修剪)，这可使用例如大小排
阻层析，SDS-PAGE和/或基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱术(MALDI/TOF MS)来评估。
其它类型的化学改变包括电荷改变(例如因脱酰胺而发生的)，其可通过例如离子交换层析
或icIEF来评估。
[0063] 若根据在测定法(例如抗原结合测定法)中的测定，抗体在给定时间的生物学活性为制备药物配制剂时展现的生物学活性的至少约60％(在测定法的误差之内)，则抗体在药
物配制剂中“保留其生物学活性”。本文中下文详述了用于抗体的其它“生物学活性”测定
法。
物配制剂中“保留其生物学活性”。本文中下文详述了用于抗体的其它“生物学活性”测定
法。
[0064] 如本文中使用的，单克隆抗体的“生物学活性”包括抗体结合抗原并导致可测量的生物学应答(其可在体外或在体内测量)的能力。
[0065] “脱酰胺的”单克隆抗体在本文中为它的一个或多个天冬酰胺残基已被衍生成例如天冬氨酸或异天冬氨酸的单克隆抗体。
[0066] “氧化的”单克隆抗体在本文中为它的一个或多个色氨酸残基和/或一个或多个甲硫氨酸残基已被氧化的单克隆抗体。
[0067] “糖化的”单克隆抗体在本文中为它的一个或多个赖氨酸残基已被糖化的单克隆抗体。
[0068] “对脱酰胺易感的”抗体为包含一个或多个已发现倾向于脱酰胺的残基的抗体。
[0069] “对氧化易感的”抗体为包含一个或多个已发现倾向于氧化的残基的抗体。
[0070] “对聚集易感的”抗体为已发现与其它抗体分子聚集(尤其在冷冻和/或摇动后)的抗体。
[0071] “对片段化易感的”抗体为已发现被切割成两个或更多个片段(例如在其铰链区处)的抗体。
[0072] “降低脱酰胺，氧化，聚集，或片段化”意图相对于在不同配制剂中配制的单克隆抗体，阻止或降低脱酰胺，氧化，聚集，或片段化的量。
[0073] 配制的抗体优选基本上纯的且希望基本上同质的(例如没有污染性蛋白质等)。“基本上纯的”抗体表示基于组合物中蛋白质的总重量，组合物包含以重量计至少约90％，
优选以重量计至少约95％的抗体。“基本上同质的”抗体表示基于组合物中蛋白质的总重
量，组合物包含以重量计至少约99％的抗体。
优选以重量计至少约95％的抗体。“基本上同质的”抗体表示基于组合物中蛋白质的总重
量，组合物包含以重量计至少约99％的抗体。
[0074] “等张”表示感兴趣的配制剂与人血液具有基本上相同的渗透压。等张配制剂一般具有约250至350mOsm的渗透压。等张性可使用例如蒸气压或冰冻型渗透压计来测量。
[0075] 如本文中使用的，“缓冲液”指通过其酸-碱配合成分的作用来抵抗pH变化的缓冲溶液。本发明的缓冲液优选具有在约4.5至约7.0，优选约5.6至约7.0，例如约5.6至6.9，5.7至6.8，5.8至6.7，5.9至6.6，5.9至6.5，6.0至6.4，或6.1至6.3的范围中的pH。在一个实施方案中，缓冲液具有pH 5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，或
7.0。例如，会控制pH在此范围中的缓冲液的一个例子是磷酸钠。
7.0。例如，会控制pH在此范围中的缓冲液的一个例子是磷酸钠。
[0076] 如本文中使用的，“表面活性剂”指表面活性作用剂，优选非离子型表面活性剂。本文中的表面活性剂的例子包括聚山梨酯(例如聚山梨酯20和聚山梨酯80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基-，肉豆蔻基-，亚油基-，或硬脂酰基-磺基甜菜碱；月桂基-，肉豆蔻基-，亚油基-，或硬脂酰基-肌氨酸；亚油基-，肉豆蔻基，或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰氨基丙基-，椰油酰氨基丙基-，亚油酰氨基丙基-，肉豆蔻酰氨基丙基-，棕榈酰氨基丙基-，或异硬脂酰氨基丙基-甜菜碱(例如月桂
酰氨基丙基)；肉豆蔻酰氨基丙基-，棕榈酰氨基丙基-，或异硬脂酰氨基丙基-二甲胺；甲基
椰油基牛磺酸钠或甲基油基牛磺酸二钠；和MONAQUATTM系列(Mona Industries，Inc.，
Paterson，N.J.)；聚乙二醇，聚丙二醇，及乙二醇和丙二醇共聚物(例如Pluronics，PF68
等)；等。在一个实施方案中，本文中的表面活性剂为聚山梨酯20。
酰氨基丙基)；肉豆蔻酰氨基丙基-，棕榈酰氨基丙基-，或异硬脂酰氨基丙基-二甲胺；甲基
椰油基牛磺酸钠或甲基油基牛磺酸二钠；和MONAQUATTM系列(Mona Industries，Inc.，
Paterson，N.J.)；聚乙二醇，聚丙二醇，及乙二醇和丙二醇共聚物(例如Pluronics，PF68
等)；等。在一个实施方案中，本文中的表面活性剂为聚山梨酯20。
[0077] 在药理学意义上，在本发明的语境中，抗体的“治疗有效量”指有效预防或治疗如下病症的量，抗体对该病症的治疗是有效的。“病症”为会受益于抗体处理的任何状况。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物易患所讨论病症的病理状况。
[0078] “防腐剂”为如下的化合物，其可任选地包括在配制剂中以本质上降低其中的细菌作用，如此便于生产例如多次使用配制剂。潜在的防腐剂的例子包括十八烷基二甲基苯甲
基氯化铵，氯己双胺，苯扎氯铵(烃基苯甲基二甲基氯化铵的混合物，其中烃基是长链化合
物)，和苄索氯铵。其它类型的防腐剂包括芳香醇诸如酚，丁醇和苯甲醇，对羟基苯甲酸烃基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，邻苯二酚，间苯二酚，环己醇，3-戊醇，和间甲酚。在一个实施方案中，本文中的防腐剂为苯甲醇。
基氯化铵，氯己双胺，苯扎氯铵(烃基苯甲基二甲基氯化铵的混合物，其中烃基是长链化合
物)，和苄索氯铵。其它类型的防腐剂包括芳香醇诸如酚，丁醇和苯甲醇，对羟基苯甲酸烃基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，邻苯二酚，间苯二酚，环己醇，3-戊醇，和间甲酚。在一个实施方案中，本文中的防腐剂为苯甲醇。
[0079] 如本文中使用的，“治疗/处理”指设计用于改变临床病理学过程期间所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预。治疗的期望效果包括降低疾病进展速率，改善或减轻疾病
状态，和消退或改善的预后。例如，若一种或多种与癌症有关的症状减轻或消除，包括但不
限于降低癌性细胞的增殖(或破坏癌性细胞)，减轻源自疾病的症状，提高那些罹患疾病的
个体的生命质量，降低治疗疾病需要的其它药物的剂量，延迟疾病的进展，和/或延长个体
存活，则个体得到成功“治疗”。
状态，和消退或改善的预后。例如，若一种或多种与癌症有关的症状减轻或消除，包括但不
限于降低癌性细胞的增殖(或破坏癌性细胞)，减轻源自疾病的症状，提高那些罹患疾病的
个体的生命质量，降低治疗疾病需要的其它药物的剂量，延迟疾病的进展，和/或延长个体
存活，则个体得到成功“治疗”。
[0080] 如本文中使用的，“延迟疾病的进展”表示推迟，阻碍，减缓，延迟，稳定，和/或延缓疾病(诸如癌症)的形成。根据疾病史和/或所治疗的个体，此延迟可以是不同时间长度的。如对于本领域技术人员明显的是，充分或显著的延迟实质上可以涵盖预防，因为个体不形
成疾病。例如，可以延迟晚期阶段癌症，诸如转移的形成。
成疾病。例如，可以延迟晚期阶段癌症，诸如转移的形成。
[0081] “有效量”至少是实现特定病症的可测量改善或预防需要的最小量。本文中的有效量可以随诸如患者的疾病状态，年龄，性别，和重量，和抗体在个体中引发期望的应答的能
力等因素而变化。有效量也是治疗上有益的效果超过治疗的任何有毒或有害效果的量。对
于预防性使用，有益或期望的结果包括如下的结果，诸如消除或降低风险，减轻严重性，或
延迟疾病的发作，包括疾病的生物化学，组织学和/或行为症状，其并发症和疾病形成期间
呈现的中间病理学表型。对于治疗性使用，有益或期望的结果包括临床结果，诸如减少源自
疾病的一种或多种症状，提高那些罹患疾病的对象的生命质量，降低治疗疾病需要的其它
药物的剂量，增强另一种药物的效果(诸如经由靶向)，延迟疾病的进展，和/或延长存活。在癌症或肿瘤的情况中，有效量的药物在减少癌细胞的数目；降低肿瘤大小；抑制(即在一定
程度上减缓或者期望地停止)癌细胞浸润入外周器官中；抑制(即在一定程度上减缓且期望
地停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或多种与病
症有关的症状中可以具有效果。可以在一次或多次施用中施用有效量。出于本发明的目的，
药物，化合物，或药物组合物的有效量是足以直接或间接实现预防性或治疗性处理的量。如
在临床背景中理解的，药物，化合物，或药物组合物的有效量可以与或不与另一种药物，化
合物，或药物组合物联合实现。如此，可以在施用一种或多种治疗剂的背景中考虑“有效
量”，并且若与一种或多种其它药剂联合，可以实现期望的结果或者期望的结果实现了，则
可以认为单一药剂是以有效量给予的。
力等因素而变化。有效量也是治疗上有益的效果超过治疗的任何有毒或有害效果的量。对
于预防性使用，有益或期望的结果包括如下的结果，诸如消除或降低风险，减轻严重性，或
延迟疾病的发作，包括疾病的生物化学，组织学和/或行为症状，其并发症和疾病形成期间
呈现的中间病理学表型。对于治疗性使用，有益或期望的结果包括临床结果，诸如减少源自
疾病的一种或多种症状，提高那些罹患疾病的对象的生命质量，降低治疗疾病需要的其它
药物的剂量，增强另一种药物的效果(诸如经由靶向)，延迟疾病的进展，和/或延长存活。在癌症或肿瘤的情况中，有效量的药物在减少癌细胞的数目；降低肿瘤大小；抑制(即在一定
程度上减缓或者期望地停止)癌细胞浸润入外周器官中；抑制(即在一定程度上减缓且期望
地停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或多种与病
症有关的症状中可以具有效果。可以在一次或多次施用中施用有效量。出于本发明的目的，
药物，化合物，或药物组合物的有效量是足以直接或间接实现预防性或治疗性处理的量。如
在临床背景中理解的，药物，化合物，或药物组合物的有效量可以与或不与另一种药物，化
合物，或药物组合物联合实现。如此，可以在施用一种或多种治疗剂的背景中考虑“有效
量”，并且若与一种或多种其它药剂联合，可以实现期望的结果或者期望的结果实现了，则
可以认为单一药剂是以有效量给予的。
[0082] 如本文中使用的，“与......联合/组合/一起”指在一种治疗形态外还施用另一种治疗形态。因而，“与......联合/组合/一起”指在对个体施用一种治疗形态之前，期间，或之后施用另一种治疗形态。
[0083] “病症”为会受益于处理的任何疾患，包括但不限于慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物趋向于所讨论病症的病理状况。
[0084] 术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症为癌症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症为肿
瘤。
瘤。
[0085] 如本文中使用的，“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”，“癌性”，“细胞增殖性病症”，“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
[0086] 术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌瘤，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。
此类癌症的更具体例子包括但不限于鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)，肺癌(包括小细
胞肺癌，非小细胞肺癌，肺的腺癌和肺的鳞癌)，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，尿道癌，肝瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，黑素瘤，浅表扩散性黑素瘤，恶性雀斑样痣黑素瘤，肢端黑素瘤，结节性黑素瘤，多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤
(NHL)，小淋巴细胞性(SL)NHL，中级/滤泡性NHL，中级弥漫性NHL，高级成免疫细胞性NHL，高级成淋巴细胞性NHL，高级小无核裂细胞性NHL，贮积病(bulky disease)NHL，套细胞淋巴
瘤，AIDS相关淋巴瘤，和瓦尔登斯特伦(Waldenstrom)氏巨球蛋白血症)，慢性淋巴细胞性白
血病(CLL)，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，毛细胞性白血病，慢性成髓细胞性白血病，和
移植后淋巴增殖性病症(PTLD)，以及与瘢痣病(phakomatoses)，水肿(诸如与脑瘤有关的)
和梅格斯(Meigs)氏综合征有关的异常血管增殖，脑，以及头和颈癌，及相关转移。在某些实施方案中，适合于通过本发明的抗体来治疗的癌症包括乳腺癌，结直肠癌，直肠癌，非小细
胞肺癌，成胶质细胞瘤，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，肾细胞癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌，软组织肉瘤，卡波西(Kaposi)氏肉瘤，类癌癌(carcinoid carcinoma)，头和颈癌，卵巢癌，间皮瘤，和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症选自：小细胞肺癌，成胶质细胞瘤，成神经细胞瘤，黑素瘤，乳腺癌，胃癌，结直肠癌(CRC)，和肝细胞癌。还有，在一些实施方案中，癌症选自：非小细胞肺癌，结直肠癌，成胶质细胞瘤和乳腺癌，包括那些癌症的转移性形式。
此类癌症的更具体例子包括但不限于鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)，肺癌(包括小细
胞肺癌，非小细胞肺癌，肺的腺癌和肺的鳞癌)，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，尿道癌，肝瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，黑素瘤，浅表扩散性黑素瘤，恶性雀斑样痣黑素瘤，肢端黑素瘤，结节性黑素瘤，多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤
(NHL)，小淋巴细胞性(SL)NHL，中级/滤泡性NHL，中级弥漫性NHL，高级成免疫细胞性NHL，高级成淋巴细胞性NHL，高级小无核裂细胞性NHL，贮积病(bulky disease)NHL，套细胞淋巴
瘤，AIDS相关淋巴瘤，和瓦尔登斯特伦(Waldenstrom)氏巨球蛋白血症)，慢性淋巴细胞性白
血病(CLL)，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，毛细胞性白血病，慢性成髓细胞性白血病，和
移植后淋巴增殖性病症(PTLD)，以及与瘢痣病(phakomatoses)，水肿(诸如与脑瘤有关的)
和梅格斯(Meigs)氏综合征有关的异常血管增殖，脑，以及头和颈癌，及相关转移。在某些实施方案中，适合于通过本发明的抗体来治疗的癌症包括乳腺癌，结直肠癌，直肠癌，非小细
胞肺癌，成胶质细胞瘤，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，肾细胞癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌，软组织肉瘤，卡波西(Kaposi)氏肉瘤，类癌癌(carcinoid carcinoma)，头和颈癌，卵巢癌，间皮瘤，和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症选自：小细胞肺癌，成胶质细胞瘤，成神经细胞瘤，黑素瘤，乳腺癌，胃癌，结直肠癌(CRC)，和肝细胞癌。还有，在一些实施方案中，癌症选自：非小细胞肺癌，结直肠癌，成胶质细胞瘤和乳腺癌，包括那些癌症的转移性形式。
[0087] “化疗剂”为可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)
磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)，英丙舒凡
(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派
(benzodepa)，卡波醌(carboquone)，美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚
胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)，
三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)，三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)，三乙撑
硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；番荔
枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；
δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)， )；β-拉
帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinic
acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)
CPT-11(伊立替康(irinotecan)， )，乙酰喜树碱，
东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065
(包括其阿多来新(adozelesin)，卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似
物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷
(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀
(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素
(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类
(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥(chlornaphazine)，胆磷
酰胺(cholophosphamide)，雌莫司汀(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，双氯乙基
甲胺(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)，美法仑
(melphalan)，新氮芥(novembichin)，苯芥胆甾醇(phenesterine)，泼尼莫司汀
(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类
(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀
(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；
抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加
利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Nicolaou et al.，Angew.Chem
Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))；CDP323，一种口服α-4整联蛋白抑制剂；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素
(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)，阿克拉霉素
(aclacinomysin)，放线菌素(actinomycin)，氨茴霉素(authramycin)，偶氮丝氨酸
(azaserine)，博来霉素(bleomycin)，放线菌素C(cactinomycin)，carabicin，洋红霉素
(caminomycin)，嗜癌霉素(carzinophilin)，色霉素(chromomycin)，放线菌素D
(dactinomycin)，柔红霉素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-二氮-5-氧-L-正
亮氨酸，多柔比星(doxorubicin)(包括 吗啉代多柔比星，氰基吗啉代
多柔比星，2-吡咯代多柔比星，盐酸多柔比星脂质体注射剂 脂质体多柔比星
TLC D-99 PEG化脂质体多柔比星 和脱氧多柔比星)，表柔比
星(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，麻西罗霉素
(marcellomycin)，丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C，霉酚酸(mycophenolic
acid)，诺拉霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，泊非霉
素(porfiromycin)，嘌呤霉素(puromycin)，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星
(rodorubicin)，链黑菌素(streptonigrin)，链佐星(streptozocin)，杀结核菌素
(tubercidin)，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤，吉西他滨(gemcitabine) 替加氟(tegafur)
卡培他滨(capecitabine) 埃坡霉素(epothilone)和
5-氟尿嘧啶(5-FU)；考布他汀(combretastatin)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸
(denopterin)，甲氨蝶呤，蝶酰三谷氨酸(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤(mercaptopurine)，硫咪嘌呤
(thiamiprine)，硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)，阿扎
胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷(cytarabine)，双脱氧尿苷
(dideoxyuridine)，去氧氟尿苷(doxifluridine)，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷
(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)，丙酸屈他雄酮(dromostanolone
propionate)，表硫雄醇(epitiostanol)，美雄烷(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；
抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦
(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧
啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙
(edatraxate)；地磷酰胺(defofamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；
elfomithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱
类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙
(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶
(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；
洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；
多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素
(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸
(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类
(trichothecenes)(尤其是T-2毒素，疣孢菌素(verracurin)A，杆孢菌素(roridin)A和蛇行
菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)(
)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇
(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞
苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞
(paclitaxel)( Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)，帕利他塞
的清蛋白改造的纳米颗粒剂型(ABRAXANETM)和多西他塞(doxetaxel)(
Rhome-Poulene Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫鸟嘌呤
(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂剂，诸如顺铂
(cisplatin)，奥沙利铂(oxaliplatin)(例如 )和卡铂(carboplatin)；长春
药类(vincas)，其阻止微管蛋白聚合形成微管，包括长春碱(vinblastine)
长春新碱(vincristine) 长春地辛(vindesine)(
)，和长春瑞滨(vinorelbine) 依托泊苷(etoposide)(VP-
16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；亚叶酸(leucovorin)；能灭瘤
(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；
伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄
酸(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)，包括贝沙罗汀(bexarotene)
二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如
或 )，依替膦酸钠(etidronate) NE-58095，唑
来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate) 阿伦膦酸盐
(alendronate) 帕米膦酸盐(pamidronate) 替鲁膦酸
盐(tiludronate) 或利塞膦酸盐(risedronate) 曲沙他滨
(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制牵涉
异常细胞增殖的信号传导途经中的基因表达的，诸如例如PKC-α，Raf，H-Ras和表皮生长因
子受体(EGF-R)(例如依洛替尼(erlotinib)(TarcevaTM))；和降低细胞增殖的VEGF-A；疫苗，诸如 疫 苗 和基因 疗 法疫 苗 ，例 如 疫 苗 ，
疫苗和 疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如 )；
rmRH(例如 )；BAY439006(sorafenib；Bayer)；SU-11248(sunitinib，
Pfizer)；哌立福辛(perifosine)，COX-2抑制剂(如塞来考昔(celecoxib)或艾
托考昔(etoricoxib))，蛋白体抑制剂(例如PS341)；bortezomib CCI-
779；tipifarnib(R11577)；orafenib，ABT510；Bcl-2抑制剂，诸如oblimersen sodium
pixantrone；EGFR抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂；丝氨酸-苏氨酸激酶抑
制剂，诸如雷帕霉素(rapamycin)(sirolimus， )；法尼基转移酶抑制剂，诸
TM
如lonafarnib(SCH 6636，SARASAR )；及任何上述各项的药学可接受盐，酸或衍生物；以及
两种或更多种上述各项的组合，诸如CHOP(环磷酰胺，多柔比星，长春新碱和泼尼松龙联合
疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)，及任
何上述各项的药学可接受盐，酸或衍生物；以及两种或多种上述各项的组合。
磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)，英丙舒凡
(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派
(benzodepa)，卡波醌(carboquone)，美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚
胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)，
三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)，三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)，三乙撑
硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；番荔
枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；
δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)， )；β-拉
帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinic
acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)
CPT-11(伊立替康(irinotecan)， )，乙酰喜树碱，
东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065
(包括其阿多来新(adozelesin)，卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似
物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷
(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀
(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素
(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类
(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥(chlornaphazine)，胆磷
酰胺(cholophosphamide)，雌莫司汀(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，双氯乙基
甲胺(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)，美法仑
(melphalan)，新氮芥(novembichin)，苯芥胆甾醇(phenesterine)，泼尼莫司汀
(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类
(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀
(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；
抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加
利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Nicolaou et al.，Angew.Chem
Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))；CDP323，一种口服α-4整联蛋白抑制剂；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素
(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)，阿克拉霉素
(aclacinomysin)，放线菌素(actinomycin)，氨茴霉素(authramycin)，偶氮丝氨酸
(azaserine)，博来霉素(bleomycin)，放线菌素C(cactinomycin)，carabicin，洋红霉素
(caminomycin)，嗜癌霉素(carzinophilin)，色霉素(chromomycin)，放线菌素D
(dactinomycin)，柔红霉素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-二氮-5-氧-L-正
亮氨酸，多柔比星(doxorubicin)(包括 吗啉代多柔比星，氰基吗啉代
多柔比星，2-吡咯代多柔比星，盐酸多柔比星脂质体注射剂 脂质体多柔比星
TLC D-99 PEG化脂质体多柔比星 和脱氧多柔比星)，表柔比
星(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，麻西罗霉素
(marcellomycin)，丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C，霉酚酸(mycophenolic
acid)，诺拉霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，泊非霉
素(porfiromycin)，嘌呤霉素(puromycin)，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星
(rodorubicin)，链黑菌素(streptonigrin)，链佐星(streptozocin)，杀结核菌素
(tubercidin)，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤，吉西他滨(gemcitabine) 替加氟(tegafur)
卡培他滨(capecitabine) 埃坡霉素(epothilone)和
5-氟尿嘧啶(5-FU)；考布他汀(combretastatin)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸
(denopterin)，甲氨蝶呤，蝶酰三谷氨酸(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤(mercaptopurine)，硫咪嘌呤
(thiamiprine)，硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)，阿扎
胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷(cytarabine)，双脱氧尿苷
(dideoxyuridine)，去氧氟尿苷(doxifluridine)，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷
(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)，丙酸屈他雄酮(dromostanolone
propionate)，表硫雄醇(epitiostanol)，美雄烷(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；
抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦
(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧
啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙
(edatraxate)；地磷酰胺(defofamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；
elfomithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱
类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙
(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶
(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；
洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；
多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素
(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸
(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类
(trichothecenes)(尤其是T-2毒素，疣孢菌素(verracurin)A，杆孢菌素(roridin)A和蛇行
菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)(
)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇
(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞
苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞
(paclitaxel)( Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)，帕利他塞
的清蛋白改造的纳米颗粒剂型(ABRAXANETM)和多西他塞(doxetaxel)(
Rhome-Poulene Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫鸟嘌呤
(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂剂，诸如顺铂
(cisplatin)，奥沙利铂(oxaliplatin)(例如 )和卡铂(carboplatin)；长春
药类(vincas)，其阻止微管蛋白聚合形成微管，包括长春碱(vinblastine)
长春新碱(vincristine) 长春地辛(vindesine)(
)，和长春瑞滨(vinorelbine) 依托泊苷(etoposide)(VP-
16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；亚叶酸(leucovorin)；能灭瘤
(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；
伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄
酸(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)，包括贝沙罗汀(bexarotene)
二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如
或 )，依替膦酸钠(etidronate) NE-58095，唑
来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate) 阿伦膦酸盐
(alendronate) 帕米膦酸盐(pamidronate) 替鲁膦酸
盐(tiludronate) 或利塞膦酸盐(risedronate) 曲沙他滨
(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制牵涉
异常细胞增殖的信号传导途经中的基因表达的，诸如例如PKC-α，Raf，H-Ras和表皮生长因
子受体(EGF-R)(例如依洛替尼(erlotinib)(TarcevaTM))；和降低细胞增殖的VEGF-A；疫苗，诸如 疫 苗 和基因 疗 法疫 苗 ，例 如 疫 苗 ，
疫苗和 疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如 )；
rmRH(例如 )；BAY439006(sorafenib；Bayer)；SU-11248(sunitinib，
Pfizer)；哌立福辛(perifosine)，COX-2抑制剂(如塞来考昔(celecoxib)或艾
托考昔(etoricoxib))，蛋白体抑制剂(例如PS341)；bortezomib CCI-
779；tipifarnib(R11577)；orafenib，ABT510；Bcl-2抑制剂，诸如oblimersen sodium
pixantrone；EGFR抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂；丝氨酸-苏氨酸激酶抑
制剂，诸如雷帕霉素(rapamycin)(sirolimus， )；法尼基转移酶抑制剂，诸
TM
如lonafarnib(SCH 6636，SARASAR )；及任何上述各项的药学可接受盐，酸或衍生物；以及
两种或更多种上述各项的组合，诸如CHOP(环磷酰胺，多柔比星，长春新碱和泼尼松龙联合
疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)，及任
何上述各项的药学可接受盐，酸或衍生物；以及两种或多种上述各项的组合。
[0088] 本文中定义的化疗剂包括“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”，其作用于调节，降低，阻断，或抑制能促进癌症生长的激素的效果。它们自身可以是激素，包括但不限于：抗雌激素类和选择性雌激素受体调控物类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括
他莫昔芬)，雷洛昔芬(raloxifene)，屈洛昔芬(droloxifene)，4-羟基他莫
昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，那洛昔芬(keoxifene)，LY117018，奥那司酮(onapristone)
和 托瑞米芬(toremifene)；抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳
香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑，氨鲁米特(aminoglutethimide)， 醋酸甲地
孕酮(megestrol acetate)， 依西美坦(exemestane)，福美坦
(formestanie)，法倔唑(fadrozole)， 伏罗唑(vorozole)， 来曲
唑(letrozole)和 阿那曲唑(anastrozole)；和抗雄激素类，诸如氟他米特
(flutamide)，尼鲁米特(nilutamide)，比卡米特(bicalutamide)，亮丙瑞林(leuprolide)，和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似
物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制牵涉异常(abherant)细胞增殖的信号传导途经中的基
因表达的，诸如例如PKC-α，Raf和H-Ras；核酶，诸如VEGF表达抑制剂(例如
核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如
疫苗， 疫苗和 疫苗； rIL-
2； 拓扑异构酶1抑制剂； rmRH；长春瑞滨(Vinorelbine)
和埃斯波霉素(Esperamicins)(参见美国专利No.4,675,187)；及任何上述各项的药学可接
受盐，酸或衍生物；以及两种或多种上述各项的组合。
他莫昔芬)，雷洛昔芬(raloxifene)，屈洛昔芬(droloxifene)，4-羟基他莫
昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，那洛昔芬(keoxifene)，LY117018，奥那司酮(onapristone)
和 托瑞米芬(toremifene)；抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳
香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑，氨鲁米特(aminoglutethimide)， 醋酸甲地
孕酮(megestrol acetate)， 依西美坦(exemestane)，福美坦
(formestanie)，法倔唑(fadrozole)， 伏罗唑(vorozole)， 来曲
唑(letrozole)和 阿那曲唑(anastrozole)；和抗雄激素类，诸如氟他米特
(flutamide)，尼鲁米特(nilutamide)，比卡米特(bicalutamide)，亮丙瑞林(leuprolide)，和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似
物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制牵涉异常(abherant)细胞增殖的信号传导途经中的基
因表达的，诸如例如PKC-α，Raf和H-Ras；核酶，诸如VEGF表达抑制剂(例如
核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如
疫苗， 疫苗和 疫苗； rIL-
2； 拓扑异构酶1抑制剂； rmRH；长春瑞滨(Vinorelbine)
和埃斯波霉素(Esperamicins)(参见美国专利No.4,675,187)；及任何上述各项的药学可接
受盐，酸或衍生物；以及两种或多种上述各项的组合。
[0089] “生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞生长的化合物或组合物。在一个实施方案中，生长抑制剂是阻止或降低表达抗体所结合的抗原的细胞增殖的生长抑
制性抗体。在另一个实施方案中，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞百分比的药
剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停
滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和
长春碱(vinblastine))，紫杉烷类(taxanes)，和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星
(doxorubicin)，表柔比星(epirubicin)，柔红霉素(daunorubicin)，依托泊苷(etoposide)
和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他
莫昔芬(tamoxifen)，泼尼松(prednisone)，达卡巴嗪(dacarbazine)，双氯乙基甲胺
(mechlorethamine)，顺铂(cisplatin)，甲氨蝶呤(methotrexate)，5-氟尿嘧啶(5-
fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见Mendelsohn和Israel编，《(The Molecular Basis of Cancer》，第1章，题为“Cell cycle regulation，oncogenes，and antineoplastic
drugs”，Murakami等人，W.B.Saunders，Philadelphia，1995，例如第13页。紫杉烷类(帕利他赛(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多
西他赛( Rhone-Poulenc Rorer)是帕利他赛( Bristol-Myers
Squibb)的半合成类似物。帕利他赛和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过
防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝分裂的抑制。
制性抗体。在另一个实施方案中，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞百分比的药
剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停
滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和
长春碱(vinblastine))，紫杉烷类(taxanes)，和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星
(doxorubicin)，表柔比星(epirubicin)，柔红霉素(daunorubicin)，依托泊苷(etoposide)
和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他
莫昔芬(tamoxifen)，泼尼松(prednisone)，达卡巴嗪(dacarbazine)，双氯乙基甲胺
(mechlorethamine)，顺铂(cisplatin)，甲氨蝶呤(methotrexate)，5-氟尿嘧啶(5-
fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见Mendelsohn和Israel编，《(The Molecular Basis of Cancer》，第1章，题为“Cell cycle regulation，oncogenes，and antineoplastic
drugs”，Murakami等人，W.B.Saunders，Philadelphia，1995，例如第13页。紫杉烷类(帕利他赛(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多
西他赛( Rhone-Poulenc Rorer)是帕利他赛( Bristol-Myers
Squibb)的半合成类似物。帕利他赛和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过
防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝分裂的抑制。
[0090] “放射疗法”或“放疗”表示使用定向伽马射线或贝塔射线来诱发对细胞的足够损伤，以限制细胞正常发挥功能的能力或全然破坏细胞。要领会，本领域知道许多方式来确定
治疗的剂量和持续时间。典型的治疗作为一次施用来给予，而典型的剂量范围为每天10-
200个单位(戈瑞(Gray))。
治疗的剂量和持续时间。典型的治疗作为一次施用来给予，而典型的剂量范围为每天10-
200个单位(戈瑞(Gray))。
[0091] 用于治疗目的的“受试者”或“个体”指归入哺乳类的任何动物，包括人，家畜和牲畜，及动物园动物，体育运动用动物，或宠物动物，诸如犬，马，猫，牛等。优选地，哺乳动物为人。
[0092] 本文中术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，及抗体片段，只要它们展现出期望的生物
学活性。
学活性。
[0093] “分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的研究，诊断或治疗用途的物质，可包括酶，激素，和
其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化至(1)根据例如
Lowry法的测定，抗体重量超过95％，而在一些实施方案中，重量超过99％，(2)足以通过使
用例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还
原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用例如考马斯蓝或银染剂，达到同质。既然抗体天
然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离
的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化至(1)根据例如
Lowry法的测定，抗体重量超过95％，而在一些实施方案中，重量超过99％，(2)足以通过使
用例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还
原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用例如考马斯蓝或银染剂，达到同质。既然抗体天
然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离
的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
[0094] “天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫化物连接的
数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二
硫桥。每条重链在一端具有一个可变域(VH)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个
可变域(VL)，而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻
链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变域之间
形成界面。
数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二
硫桥。每条重链在一端具有一个可变域(VH)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个
可变域(VL)，而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻
链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变域之间
形成界面。
[0095] 术语“恒定域”指免疫球蛋白分子中的如下部分，其相对于免疫球蛋白的其它部分(即含有抗原结合位点的可变域)具有更加保守的氨基酸序列。恒定域含有重链的CH1，CH2和
CH3域(合称CH)及轻链的CHL(或CL)域。
CH3域(合称CH)及轻链的CHL(或CL)域。
[0096] 抗体的“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变域可以称为“VH”。轻链的可变域可以称为“VL”。这些结构域一般是抗体的最易变部分且包含抗原结合位点。
[0097] 术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。
它集中于轻链和重链可变域中称作高变区(HVR)的三个区段。可变域中更加高度保守的部
分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，它们大多采取β-片层构
象，通过形成连接β-片层结构的环且在有些情况中形成β-片层结构一部分的三个HVR连接。
每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原
结合位点的形成(参见Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological
Interest，第5版，National Institute of Health，Bethesda，Md.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞的毒性中
的参与。
它集中于轻链和重链可变域中称作高变区(HVR)的三个区段。可变域中更加高度保守的部
分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，它们大多采取β-片层构
象，通过形成连接β-片层结构的环且在有些情况中形成β-片层结构一部分的三个HVR连接。
每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原
结合位点的形成(参见Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological
Interest，第5版，National Institute of Health，Bethesda，Md.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞的毒性中
的参与。
[0098] 根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(“κ”)和拉姆达(“λ”)。
[0099] 如本文中使用的，术语IgG“同种型”或“亚类”表示由其恒定区的化学和抗原特征定义的任何免疫球蛋白亚类。
[0100] 根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α，δ，ε，γ和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是公知的，一般性描述于例如Abbas et al.，Cellular and Mol.Immunology，4th ed.(W.B.Saunders，Co.，2000)。抗体可以是抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价联合而形成的更大融合分子的一部分。
[0101] 术语“全长抗体”，“完整抗体”和“完全抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体，而非下文定义的抗体片段。该术语具体指重链包含Fc区的抗体。
[0102] 为本文中的目的，“裸抗体(裸露的抗体)”指未偶联细胞毒性模块或放射性标记物的抗体。
[0103] “抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。在一些实施方案中，本文所述抗体片段是抗原结合片段。抗体片段的例子包括Fab，Fab′，F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0104] 用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
[0105] “Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链FV种类由紧密，非共价联合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)
种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连接，使得轻链和
重链可以在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相联合。正是在这种构造中，每个可变域
的三个HVR相互作用而在VH-VL二聚体表面上定义了一个抗原结合位点。六个HVR一起赋予抗
体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个HVR的半
个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。
种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连接，使得轻链和
重链可以在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相联合。正是在这种构造中，每个可变域
的三个HVR相互作用而在VH-VL二聚体表面上定义了一个抗原结合位点。六个HVR一起赋予抗
体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个HVR的半
个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。
[0106] Fab片段包含重链和轻链可变域，而且还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包
括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基
携带游离硫醇基团的Fab′的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为在Fab′片段之间具有铰链
半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。
括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基
携带游离硫醇基团的Fab′的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为在Fab′片段之间具有铰链
半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。
[0107] “单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，scFv多肽在VH与VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见例如Pluckthün，于《The Pharmacology
of Monoclonal Antibodies》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New
York，1994，第269-315页。
of Monoclonal Antibodies》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New
York，1994，第269-315页。
[0108] 术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链
上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生
两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更完整的记载于例如EP
404,097；WO 1993/01161；Hudson et al.，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger et
al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三抗体(Triabody)和四抗体
(tetrabody)也记载于Hudson et al.，Nat.Med.9：129-134(2003)。
上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生
两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更完整的记载于例如EP
404,097；WO 1993/01161；Hudson et al.，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger et
al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三抗体(Triabody)和四抗体
(tetrabody)也记载于Hudson et al.，Nat.Med.9：129-134(2003)。
[0109] 如本文中使用时，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，例如构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的突变，例如天然存在的突变。
如此，修饰语“单克隆”表明抗体不是分立的抗体的混合物的特征。在某些实施方案中，此类单克隆抗体典型地包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包
括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以
是从众多克隆诸如杂交瘤克隆，噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理
解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力，将靶物结合序列
人源化，提高其在细胞培养物中的产量，降低其在体内的免疫原性，创建多特异性抗体等，
而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型地包含针对不同
决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体
针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势还在于它们通常
未受到其它免疫球蛋白的污染。
如此，修饰语“单克隆”表明抗体不是分立的抗体的混合物的特征。在某些实施方案中，此类单克隆抗体典型地包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包
括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以
是从众多克隆诸如杂交瘤克隆，噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理
解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力，将靶物结合序列
人源化，提高其在细胞培养物中的产量，降低其在体内的免疫原性，创建多特异性抗体等，
而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型地包含针对不同
决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体
针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势还在于它们通常
未受到其它免疫球蛋白的污染。
[0110] 修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，要依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生
成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler and Milstein，Nature，256：495-97(1975)；Hongo et al.，Hybridoma，14(3)：253-260(1995)；Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory
Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1988)；Hammerling et al.，In：
Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981))，重组
DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)，噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.，
Nature 352：624-628(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Sidhu et al.，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee et al.，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093
(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；Lee et al.，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004))，及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白
基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO
1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO1991/10741；Jakobovits et al.，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature 362：255-258
(1993)；Bruggemann et al.，Year in Immuno.7：33(1993)；美国专利No.5,545,807；No.5,
545,806；No.5,569,825；No.5,625,126；No.5,633,425；和No.5,661,016；Marks et al.，Bio/Technology10：779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature 368：856-859(1994)；
Morrison，Nature368：812-813(1994)；Fishwild et al.，Nature Biotechnol.14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnol.14：826(1996)；及Lonberg and Huszar，
Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。
成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler and Milstein，Nature，256：495-97(1975)；Hongo et al.，Hybridoma，14(3)：253-260(1995)；Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory
Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1988)；Hammerling et al.，In：
Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981))，重组
DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)，噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.，
Nature 352：624-628(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Sidhu et al.，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee et al.，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093
(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；Lee et al.，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004))，及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白
基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO
1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO1991/10741；Jakobovits et al.，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature 362：255-258
(1993)；Bruggemann et al.，Year in Immuno.7：33(1993)；美国专利No.5,545,807；No.5,
545,806；No.5,569,825；No.5,625,126；No.5,633,425；和No.5,661,016；Marks et al.，Bio/Technology10：779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature 368：856-859(1994)；
Morrison，Nature368：812-813(1994)；Fishwild et al.，Nature Biotechnol.14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnol.14：826(1996)；及Lonberg and Huszar，
Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。
[0111] 单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与
衍生自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体
的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(参见例如美国专利No.4,816,567；及Morrison
et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。嵌合抗体包括
抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过例如用感兴趣抗原免疫猕猴
而生成的抗体。
衍生自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体
的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(参见例如美国专利No.4,816,567；及Morrison
et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。嵌合抗体包括
抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过例如用感兴趣抗原免疫猕猴
而生成的抗体。
[0112] 非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体为人免疫球蛋白(受体抗体)中的HVR残基用
具有期望特异性，亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠，大鼠，家兔，或非人灵长类动物的HVR残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的FR残基用相应的
非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。可以进
行这些修饰来进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基
本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且
所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还会包含至少部分免疫球
蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见例如Jones et al.，Nature
321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；及Presta，
Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。还可参见例如Vaswani and Hamilton，
Ann.Allergy，Asthma&Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions
23：1035-1038(1995)；Hurle and Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)；及美国专利No.6,982,321和No.7,087,409。
具有期望特异性，亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠，大鼠，家兔，或非人灵长类动物的HVR残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的FR残基用相应的
非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。可以进
行这些修饰来进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基
本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且
所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还会包含至少部分免疫球
蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见例如Jones et al.，Nature
321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；及Presta，
Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。还可参见例如Vaswani and Hamilton，
Ann.Allergy，Asthma&Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions
23：1035-1038(1995)；Hurle and Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)；及美国专利No.6,982,321和No.7,087,409。
[0113] “人抗体”为拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文中公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人
抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展
示文库(Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)；Marks et al.，
J.Mol.Biol.222：581(1991))。还可得的用于制备人单克隆抗体的是以下文献中记载的方
法：Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77
(1985)；Boerner et al.，J.Immunol.147(1)：86-95(1991)。还可参见van Dijk and van
de Winkel，Curr.Opn.Pharmacol.，5：368-74(2001)。可通过给已经修饰以应答抗原性攻击而生成人抗体但其内源基因座已经失能的转基因动物(例如经过免疫的异种小鼠
(xenomice))施用抗原来制备人抗体(参见例如美国专利No.6,075,181和No.6,150,584，关
于XENOMOUSETM技术)。还可参见例如Li et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)，关于经人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体。
抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展
示文库(Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)；Marks et al.，
J.Mol.Biol.222：581(1991))。还可得的用于制备人单克隆抗体的是以下文献中记载的方
法：Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77
(1985)；Boerner et al.，J.Immunol.147(1)：86-95(1991)。还可参见van Dijk and van
de Winkel，Curr.Opn.Pharmacol.，5：368-74(2001)。可通过给已经修饰以应答抗原性攻击而生成人抗体但其内源基因座已经失能的转基因动物(例如经过免疫的异种小鼠
(xenomice))施用抗原来制备人抗体(参见例如美国专利No.6,075,181和No.6,150,584，关
于XENOMOUSETM技术)。还可参见例如Li et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)，关于经人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体。
[0114] “物种依赖性抗体”指对来自第一哺乳动物物种的抗原的结合亲和力强于对来自第二哺乳动物物种的该抗原同源物的亲和力的抗体。通常，物种依赖性抗体“特异性结合”
人抗原(例如结合亲和力(Kd)数值不超过约1x10-7M，优选不超过约1x10-8M，且优选不超过
约1x10-9M)，但是对来自第二非人哺乳动物物种的该抗原同源物的结合亲和力比对人抗原
的结合亲和力弱至少约50倍，或至少约500倍，或至少约1000倍。物种依赖性抗体可以是上
文定义的各种类型抗体中的任一种，但是优选人源化抗体或人抗体。
人抗原(例如结合亲和力(Kd)数值不超过约1x10-7M，优选不超过约1x10-8M，且优选不超过
约1x10-9M)，但是对来自第二非人哺乳动物物种的该抗原同源物的结合亲和力比对人抗原
的结合亲和力弱至少约50倍，或至少约500倍，或至少约1000倍。物种依赖性抗体可以是上
文定义的各种类型抗体中的任一种，但是优选人源化抗体或人抗体。
[0115] 在用于本文时，术语“高变区”，“HVR”或“HV”指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1，H2，H3)，三个在VL中(L1，L2，L3)。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu et al.，Immunity 13：37-45(2000)；Johnson and Wu，In：Methods in Molecular Biology 248：1-25(Lo，ed.，Human Press，Totowa，NJ，2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在骆驼(camelid)抗体在轻链缺失下是
有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman et al.，Nature 363：446-448(1993)；
Sheriff et al.，Nature Struct.Biol.3：733-736(1996)。
有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman et al.，Nature 363：446-448(1993)；
Sheriff et al.，Nature Struct.Biol.3：733-736(1996)。
[0116] 本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological
Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196：901-917
(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford
Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”HVR是以对可得的复合物晶体结构的分析为
基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。
Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196：901-917
(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford
Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”HVR是以对可得的复合物晶体结构的分析为
基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。
[0117]
[0118] HVR可包括如下“延伸的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)，46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35(H1)，50-65或49-65(H2)和93-102，94-102或95-102(H3)。对
于这些定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等，见上文编号的。
于这些定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等，见上文编号的。
[0119] “框架”或“FR”残基指除本文中定义的HVR残基以外的那些可变域残基。
[0120] 术语“依照Kabat的可变域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式”及其变化形式指Kabat et al.，见上文中的用于抗体重链可变域或轻链可变域编辑的编号
系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含或多或少的氨基酸，对应于可变域FR
或HVR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat为
残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat为残基82a，82b和82c等)。给定抗
体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列比对同源区来确定。
系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含或多或少的氨基酸，对应于可变域FR
或HVR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat为
残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat为残基82a，82b和82c等)。给定抗
体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列比对同源区来确定。
[0121] Kabat编号系统一般在提及可变域中的残基(大约是轻链残基1-107和重链残基1-113)时使用(例如Kabat et al.，Sequences of Immunological Interest.5th Ed.Public
Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。“EU编号系统”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabat et al.，见上
文中报告的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗体的残基编号方式。
Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。“EU编号系统”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabat et al.，见上
文中报告的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗体的残基编号方式。
[0122] 表述“线性抗体”指Zapata et al.(1995)Protein Eng，8(10)：1057-1062中描述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，该区段与互补的轻链
多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
[0123] 如本文中使用的，术语“特异性结合”或“对......特异性的”指可测量且可再现的相互作用，诸如靶物和抗体之间的结合，其确定在分子(包括生物学分子)的异质群体存在下靶物的存在。例如，特异性结合靶物(其可以是表位)的抗体是以比其结合其它靶物更大
的亲和力，亲合力，更容易，和/或以更长的持续时间结合此靶物的抗体。在一个实施方案
中，抗体结合无关靶物的程度小于抗体结合靶物的约10％，如例如通过放射性免疫测定法
(RIA)测量的。在某些实施方案中，特异性结合靶物的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤
1nM，或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗体特异性结合蛋白质上在来自不同
物种的蛋白质间保守的表位。在另一个实施方案中，特异性结合可以包括但不需要排他结
合。
的亲和力，亲合力，更容易，和/或以更长的持续时间结合此靶物的抗体。在一个实施方案
中，抗体结合无关靶物的程度小于抗体结合靶物的约10％，如例如通过放射性免疫测定法
(RIA)测量的。在某些实施方案中，特异性结合靶物的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤
1nM，或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗体特异性结合蛋白质上在来自不同
物种的蛋白质间保守的表位。在另一个实施方案中，特异性结合可以包括但不需要排他结
合。
[0124] II.抗体配制剂和制备
[0125] 本文中的发明涉及包含抗体(诸如抗PDL1抗体)的稳定的含水配制剂。在一些实施方案中，该配制剂包含抗体(例如单克隆抗体)，蔗糖，缓冲剂，和表面活性剂，其中该配制剂具有约5.0至约7.0的pH。在一些实施方案中，该配制剂中的抗体(例如本文所述抗PDL1抗
体)的量为约40mg/ml至约125mg/ml。在一些实施方案中，该缓冲剂为组氨酸(例如组氨酸乙
酸酯)或乙酸钠。在一些实施方案中，该配制剂中的缓冲剂的浓度为约15mM至约25mM。在一
些实施方案中，该配制剂中的蔗糖为约60mM至约240mM。在一些实施方案中，该配制剂中的
表面活性剂为聚山梨酯(例如聚山梨酯20)。在一些实施方案中，该配制剂中的聚山梨酯的
浓度为约0.005％(w/v)至约0.06％(w/v)。在一些实施方案中，该配制剂具有约5.0至约6.3
的pH。在一些实施方案中，本文中提供的是稳定的含水药物配制剂，该配制剂包含浓度为约
40mg/ml至约125mg/ml的抗PDL1单克隆抗体，浓度为约15mM至约25mM的组氨酸乙酸酯或乙
酸钠，浓度为约60mM至约240mM的蔗糖，浓度为约0.005％(w/v)至约0.06％(w/v)的聚山梨
酯，且pH为约5.0至约6.3。在一些实施方案中，该配制剂包含量为约125mg/ml的抗PDL1单克
隆抗体，浓度为约240mM的蔗糖，且pH为约5.5。在一些实施方案中，该配制剂包含量为约
60mg/ml的抗PDL1单克隆抗体，浓度为约120mM的蔗糖，且pH为约5.8。
体)的量为约40mg/ml至约125mg/ml。在一些实施方案中，该缓冲剂为组氨酸(例如组氨酸乙
酸酯)或乙酸钠。在一些实施方案中，该配制剂中的缓冲剂的浓度为约15mM至约25mM。在一
些实施方案中，该配制剂中的蔗糖为约60mM至约240mM。在一些实施方案中，该配制剂中的
表面活性剂为聚山梨酯(例如聚山梨酯20)。在一些实施方案中，该配制剂中的聚山梨酯的
浓度为约0.005％(w/v)至约0.06％(w/v)。在一些实施方案中，该配制剂具有约5.0至约6.3
的pH。在一些实施方案中，本文中提供的是稳定的含水药物配制剂，该配制剂包含浓度为约
40mg/ml至约125mg/ml的抗PDL1单克隆抗体，浓度为约15mM至约25mM的组氨酸乙酸酯或乙
酸钠，浓度为约60mM至约240mM的蔗糖，浓度为约0.005％(w/v)至约0.06％(w/v)的聚山梨
酯，且pH为约5.0至约6.3。在一些实施方案中，该配制剂包含量为约125mg/ml的抗PDL1单克
隆抗体，浓度为约240mM的蔗糖，且pH为约5.5。在一些实施方案中，该配制剂包含量为约
60mg/ml的抗PDL1单克隆抗体，浓度为约120mM的蔗糖，且pH为约5.8。
[0126] 在一些实施方案中，配制剂中的抗体于-20℃稳定至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月，至少2年，至少3年，或至少4年。在一些实施方案中，配制剂中的抗体于2-8℃稳定至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月，至少2年，或至少3年。在一些实施方案中，在贮存后，抗体保留它在贮存前(即在制备该药物配制剂的时候)展现的生物学活性(例如对
靶物的结合，或治疗效力)的至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约
80％，至少约85％，至少约90％，或至少约95％。
靶物的结合，或治疗效力)的至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约
80％，至少约85％，至少约90％，或至少约95％。
[0127] 在某些实施方案中，配制剂于约40℃稳定至少约1，2，3，4，5，6，7，14，21，28，或更多天。在某些实施方案中，配制剂于约40℃稳定至少约1，2，3，4，5，6，7，8，或更多周。在某些实施方案中，配制剂于约25℃稳定至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，或更多个月。在某些实施方案中，配制剂于约5℃稳定至少1，2，3，
4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，或更多个月。在某些实施方案中，配制剂于约-20℃稳定至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，
19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，
44，45，46，47，48，或更多个月。在某些实施方案中，配制剂于5℃或-20℃稳定至少1，2，3，4，
5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，
32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，或更多个月。另外，配制剂优选在冷冻(至例如-20℃，-40℃或-70℃)和融化配制剂后(例如在1，2，3，4或5个循环的冷冻和融化后)是稳定的。
4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，或更多个月。在某些实施方案中，配制剂于约-20℃稳定至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，
19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，
44，45，46，47，48，或更多个月。在某些实施方案中，配制剂于5℃或-20℃稳定至少1，2，3，4，
5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，
32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，或更多个月。另外，配制剂优选在冷冻(至例如-20℃，-40℃或-70℃)和融化配制剂后(例如在1，2，3，4或5个循环的冷冻和融化后)是稳定的。
[0128] A.抗体(诸如抗PDL1抗体)
[0129] 在一些实施方案中，配制剂中的抗体在重和/或轻链序列中包含至少一个色氨酸(例如至少2个，至少3个，或至少4个)。在一些实施方案中，氨基酸色氨酸在抗体的CDR区，框架区和/或恒定区中。在一些实施方案中，抗体在CDR区中包含2个或3个色氨酸残基。在一些
实施方案中，配制剂中的抗体是抗PDL1抗体。PD-L1(编程性细胞死亡1配体1)，也称作PDL1，B7-H1，B7-4，CD274，和B7-H，是一种跨膜蛋白，而且它与PD-1的相互作用抑制T细胞活化和细胞因子生成。在一些实施方案中，本文所述抗PDL1抗体结合人PD-L1。能使用本文所述配
制剂配制的抗PDL1抗体的例子记载于PCT专利申请WO 2010/077634 A1和US 8,217,149，通
过援引将其收入本文。
实施方案中，配制剂中的抗体是抗PDL1抗体。PD-L1(编程性细胞死亡1配体1)，也称作PDL1，B7-H1，B7-4，CD274，和B7-H，是一种跨膜蛋白，而且它与PD-1的相互作用抑制T细胞活化和细胞因子生成。在一些实施方案中，本文所述抗PDL1抗体结合人PD-L1。能使用本文所述配
制剂配制的抗PDL1抗体的例子记载于PCT专利申请WO 2010/077634 A1和US 8,217,149，通
过援引将其收入本文。
[0130] 在一些实施方案中，抗PDL1抗体能够抑制PD-L1和PD-1之间和/或PD-L1和B7-1之间的结合。在一些实施方案中，抗PDL1抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，抗PDL1抗体
为选自下组的抗体片段：Fab，Fab’-SH，Fv，scFv，和(Fab’)2片段。在一些实施方案中，抗PDL1抗体为人源化抗体。在一些实施方案中，抗PDL1抗体为人抗体。
为选自下组的抗体片段：Fab，Fab’-SH，Fv，scFv，和(Fab’)2片段。在一些实施方案中，抗PDL1抗体为人源化抗体。在一些实施方案中，抗PDL1抗体为人抗体。
[0131] 可以在本文所述配制剂中配制WO 2010/077634 A1和US 8,217,149中记载的抗PDL1抗体。在一些实施方案中，抗PDL1抗体包含包含氨基酸序列SEQ ID NO：30的重链可变
区和包含氨基酸序列SEQ ID NO：31的轻链可变区。
区和包含氨基酸序列SEQ ID NO：31的轻链可变区。
[0132] 在一个实施方案中，抗PDL1抗体包含重链可变区多肽，其包含HVR-H1，HVR-H2和HVR-H3序列，其中：
[0133] (a)HVR-H1序列是GFTFSX1SWIH(SEQ ID NO：11)；
[0134] (b)HVR-H2序列是AWIX2PYGGSX3YYADSVKG(SEQ ID NO：12)；
[0135] (c)HVR-H3序列是RHWPGGFDY(SEQ ID NO：13)；
[0136] 进一步其中：X1是D或G；X2是S或L；X3是T或S。
[0137] 在一个具体的方面，X1是D；X2是S且X3是T。在另一个方面，多肽进一步包含依照下式的HVR间并置的可变区重链框架序列：(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-
FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)。在还有另一个方面，框架序列自人共有框架序列衍生。在又一个
方面，框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面，至少一个框架序列如下：
FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)。在还有另一个方面，框架序列自人共有框架序列衍生。在又一个
方面，框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面，至少一个框架序列如下：
[0138] HC-FR1是EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：14)
[0139] HC-FR2是WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：15)
[0140] HC-FR3是RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：16)
[0141] HC-FR4是WGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：17)。
[0142] 在仍有又一个方面，重链多肽与可变区轻链进一步组合，所述可变区轻链包含HVR-L1，HVR-L2和HVR-L3，其中：
[0143] (a)HVR-L1序列是RASQX4X5X6TX7X8A(SEQ ID NO：18)；
[0144] (b)HVR-L2序列是SASX9LX10S(SEQ ID NO：19)；
[0145] (c)HVR-L3序列是QQX11X12X13X14PX15T(SEQ ID NO：20)；
[0146] 进一步其中：X4是D或V；X5是V或I；X6是S或N；X7是A或F；X8是V或L；X9是F或T；X10是Y或A；X11是Y，G，F，或S；X12是L，Y，F或W；X13是Y，N，A，T，G，F或I；X14是H，V，P，T或I；X15是A，W，R，P或T。
[0147] 在仍有又一个方面，X4是D；X5是V；X6是S；X7是A；X8是V；X9是F；X10是Y；X11是Y；X12是L；X13是Y；X14是H；X15是A。在仍有又一个方面，轻链进一步包含依照下式的HVR间并置的可变区轻链框架序列：(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在仍有又一个方面，框架序列自人共有框架序列衍生。在仍有又一个方面，框架序列
是VLκI共有框架。在仍有又一个方面，至少一个框架序列如下：
是VLκI共有框架。在仍有又一个方面，至少一个框架序列如下：
[0148] LC-FR1是DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：21)
[0149] LC-FR2是WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：22)
[0150] LC-FR3是GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：23)
[0151] LC-FR4是FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：24)。
[0152] 在另一个实施方案中，提供了分离的抗PDL1抗体或抗原结合片段，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0153] (a)重链包含HVR-H1，HVR-H2和HVR-H3，其中进一步：
[0154] (i)HVR-H1序列是GFTFSX1SWIH(SEQ ID NO：11)，
[0155] (ii)HVR-H2序列是AWIX2PYGGSX3YYADSVKG(SEQ ID NO：12)
[0156] (iii)HVR-H3序列是RHWPGGFDY(SEQ ID NO：13)，且
[0157] (b)轻链包含HVR-L1，HVR-L2和HVR-L3，其中进一步：
[0158] (i)HVR-L1序列是RASQX4X5X6TX7X8A(SEQ ID NO：18)，
[0159] (ii)HVR-L2序列是SASX9LX10S(SEQ ID NO：19)，和
[0160] (iii)HVR-L3序列是QQX11X12X13X14PX15T(SEQ ID NO：20)，进一步其中：X1是D或G；X2是S或L；X3是T或S；X4是D或V；X5是V或I；X6是S或N；X7是A或F；X8是V或L；X9是F或T；X10是Y或A；X11是Y，G，F，或S；X12是L，Y，F或W；X13是Y，N，A，T，G，F或I；X14是H，V，P，T或I；X15是A，W，R，P或T。
[0161] 在一个具体的方面，X1是D；X2是S且X3是T。在另一个方面，X4是D；X5是V；X6是S；X7是A；X8是V；X9是F；X10是Y；X11是Y；X12是L；X13是Y；X14是H；X15是A。在还有另一个方面，X1是D；X2是S且X3是T，X4是D；X5是V；X6是S；X7是A；X8是V；X9是F；X10是Y；X11是Y；X12是L；X13是Y；X14是H且X15是A。
[0162] 在又一个方面，重链可变区包含如下的HVR间并置的一个或多个框架序列：(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)，且轻链可变区包含如
下的HVR间并置的一个或多个框架序列：(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-
FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在仍有又一个方面，框架序列自人共有框架序列衍生。在仍有又
一个方面，重链框架序列自Kabat亚组I，II，或III序列衍生。在仍有又一个方面，重链框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个重链框架序列如下：
下的HVR间并置的一个或多个框架序列：(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-
FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在仍有又一个方面，框架序列自人共有框架序列衍生。在仍有又
一个方面，重链框架序列自Kabat亚组I，II，或III序列衍生。在仍有又一个方面，重链框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个重链框架序列如下：
[0163] HC-FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：14)
[0164] HC-FR2 WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：15)
[0165] HC-FR3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：16)
[0166] HC-FR4 WGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：17)。
[0167] 在仍有又一个方面，轻链框架序列自KabatκI，II，III或IV亚组序列衍生。在仍有又一个方面，轻链框架序列是VL κI共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个轻链框架序
列如下：
列如下：
[0168] LC-FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：21)
[0169] LC-FR2 WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：22)
[0170] LC-FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：23)
[0171] LC-FR4 FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：24)。
[0172] 在仍有又一个具体的方面，抗体进一步包含人或鼠恒定区。在仍有又一个方面，人恒定区选自下组：IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3，IgG4。在仍有又一个具体的方面，人恒定区是IgG1。在仍有又一个方面，鼠恒定区选自下组：IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3。在仍有又一个方面，鼠恒定区是IgG2A。在仍有又一个具体的方面，抗体具有降低的或最小的效应器功能。在仍有又一个具体的方面，最小效应器功能源自“效应器较小(effector-less)的Fc突变”或
无糖基化(aglycosylation)。在仍有又一个实施方案中，效应器较小的Fc突变是恒定区中
的N297A或D265A/N297A替代。
无糖基化(aglycosylation)。在仍有又一个实施方案中，效应器较小的Fc突变是恒定区中
的N297A或D265A/N297A替代。
[0173] 在还有另一个实施方案中，提供了抗PDL1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0174] (a)重链进一步包含与GFTFSDSWIH(SEQ ID NO：25)，AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：26)和RHWPGGFDY(SEQ ID NO：13)分别具有至少85％序列同一性的HVR-H1，HVR-H2和
HVR-H3序列，或
HVR-H3序列，或
[0175] (b)轻链进一步包含与RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：27)，SASFLYS(SEQ ID NO：28)和QQYLYHPAT(SEQ ID NO：29)分别具有至少85％序列同一性的HVR-L1，HVR-L2和HVR-L3序列。
[0176] 在一个具体的方面，序列同一性是86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。在另一个方面，重链可变区包含如下的HVR间并置的一个或多个框架序列：(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-
(HC-FR4)，且轻链可变区包含如下的HVR间并置的一个或多个框架序列：(LC-FR1)-(HVR-
L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在还有另一个方面，框架序列自
人共有框架序列衍生。在仍有又一个方面，重链框架序列自Kabat亚组I，II，或III序列衍
生。在仍有又一个方面，重链框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个重链框架序列如下：
(HC-FR4)，且轻链可变区包含如下的HVR间并置的一个或多个框架序列：(LC-FR1)-(HVR-
L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在还有另一个方面，框架序列自
人共有框架序列衍生。在仍有又一个方面，重链框架序列自Kabat亚组I，II，或III序列衍
生。在仍有又一个方面，重链框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个重链框架序列如下：
[0177] HC-FR1EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：14)
[0178] HC-FR2WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：15)
[0179] HC-FR3RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：16)
[0180] HC-FR4WGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：17)。
[0181] 在仍有又一个方面，轻链框架序列自KabatκI，II，III或IV亚组序列衍生。在仍有又一个方面，轻链框架序列是VL κI共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个轻链框架序
列如下：
列如下：
[0182] LC-FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：21)
[0183] LC-FR2 WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：22)
[0184] LC-FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：23)
[0185] LC-FR4 FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：24)。
[0186] 在仍有又一个具体的方面，抗体进一步包含人或鼠恒定区。在仍有又一个方面，人恒定区选自下组：IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3，IgG4。在仍有又一个具体的方面，人恒定区是IgG1。在仍有又一个方面，鼠恒定区选自下组：IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3。在仍有又一个方面，鼠恒定区是IgG2A。在仍有又一个具体的方面，抗体具有降低的或最小的效应器功能。在仍有又一个具体的方面，最小效应器功能源自“效应器较小的Fc突变”或无糖基化。在仍有
又一个实施方案中，效应器较小的Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A替代。
又一个实施方案中，效应器较小的Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A替代。
[0187] 在仍有又一个实施方案中，提供了分离的抗PDL1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0188] (a)重链序列与下述重链序列具有至少85％序列同一性：
[0189] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：30)；
[0190] 或
[0191] (b)轻链序列与下述轻链序列具有至少85％序列同一性：
[0192] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：31)。
[0193] 在一个具体的方面，序列同一性是86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。在另一个方面，重链可变区包含如下的HVR间并置的一个或多个框架序列：(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-
(HC-FR4)，且轻链可变区包含如下的HVR间并置的一个或多个框架序列：(LC-FR1)-(HVR-
L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在还有另一个方面，框架序列自
人共有框架序列衍生。在又一个方面，重链框架序列自Kabat亚组I，II，或III序列衍生。在仍有又一个方面，重链框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个重
链框架序列如下：
(HC-FR4)，且轻链可变区包含如下的HVR间并置的一个或多个框架序列：(LC-FR1)-(HVR-
L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在还有另一个方面，框架序列自
人共有框架序列衍生。在又一个方面，重链框架序列自Kabat亚组I，II，或III序列衍生。在仍有又一个方面，重链框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个重
链框架序列如下：
[0194] HC-FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：14)
[0195] HC-FR2 WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：15)
[0196] HC-FR3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：16)
[0197] HC-FR4 WGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：17)。
[0198] 在仍有又一个方面，轻链框架序列自KabatκI，II，III或IV亚组序列衍生。在仍有又一个方面，轻链框架序列是VL κI共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个轻链框架序
列如下：
列如下：
[0199] LC-FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：21)
[0200] LC-FR2 WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：22)
[0201] LC-FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：23)
[0202] LC-FR4 FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：24)。
[0203] 在仍有又一个具体的方面，抗体进一步包含人或鼠恒定区。在仍有又一个方面，人恒定区选自下组：IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3，IgG4。在仍有又一个具体的方面，人恒定区是IgG1。在仍有又一个方面，鼠恒定区选自下组：IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3。在仍有又一个方面，鼠恒定区是IgG2A。在仍有又一个具体的方面，抗体具有降低的或最小的效应器功能。在仍有又一个具体的方面，最小的效应器功能源自原核细胞中的生成。在仍有又一个具体的
方面，最小的效应器功能源自“效应器较小的Fc突变”或无糖基化。在仍有又一个实施方案
中，效应器较小的Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A替代。
方面，最小的效应器功能源自“效应器较小的Fc突变”或无糖基化。在仍有又一个实施方案
中，效应器较小的Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A替代。
[0204] 在另一个又一个实施方案中，提供了分离的抗PDL1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0205] (a)重链序列与下述重链序列具有至少85％序列同一性：
[0206] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：32)；
[0207] 或
[0208] (b)轻链序列与下述轻链序列具有至少85％序列同一性：
[0209] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：31)。
[0210] 在一个具体的方面，序列同一性是86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。在另一个方面，重链可变区包含如下的HVR间并置的一个或多个框架序列：(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-
(HC-FR4)，且轻链可变区包含如下的HVR间并置的一个或多个框架序列：(LC-FR1)-(HVR-
L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在还有另一个方面，框架序列自
人共有框架序列衍生。在又一个方面，重链框架序列自Kabat亚组I，II，或III序列衍生。在仍有又一个方面，重链框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个重
链框架序列如下：
(HC-FR4)，且轻链可变区包含如下的HVR间并置的一个或多个框架序列：(LC-FR1)-(HVR-
L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在还有另一个方面，框架序列自
人共有框架序列衍生。在又一个方面，重链框架序列自Kabat亚组I，II，或III序列衍生。在仍有又一个方面，重链框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个重
链框架序列如下：
[0211] HC-FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：14)
[0212] HC-FR2 WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：15)
[0213] HC-FR3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：16)
[0214] HC-FR4 WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：33)。
[0215] 在仍有又一个方面，轻链框架序列自KabatκI，II，III或IV亚组序列衍生。在仍有又一个方面，轻链框架序列是VLκI共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个轻链框架序列如下：
[0216] LC-FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：21)
[0217] LC-FR2 WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：22)
[0218] LC-FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：23)
[0219] LC-FR4 FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：24)。
[0220] 在仍有又一个具体的方面，抗体进一步包含人或鼠恒定区。在仍有又一个方面，人恒定区选自下组：IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3，IgG4。在仍有又一个具体的方面，人恒定区是IgG1。在仍有又一个方面，鼠恒定区选自下组：IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3。在仍有又一个方面，鼠恒定区是IgG2A。在仍有又一个具体的方面，抗体具有降低的或最小的效应器功能。在仍有又一个具体的方面，最小的效应器功能源自原核细胞中的生成。在仍有又一个具体的
方面，最小的效应器功能源自“效应器较小的Fc突变”或无糖基化。在仍有又一个实施方案
中，效应器较小的Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A替代。
方面，最小的效应器功能源自“效应器较小的Fc突变”或无糖基化。在仍有又一个实施方案
中，效应器较小的Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A替代。
[0221] 在又一个方面，重链可变区包含如下的HVR间并置的一个或多个框架序列：(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)，且轻链可变区包含如
下的HVR间并置的一个或多个框架序列：(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-
FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在仍有又一个方面，框架序列自人共有框架序列衍生。在仍有又
一个方面，重链框架序列自Kabat亚组I，II，或III序列衍生。在仍有又一个方面，重链框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个重链框架序列如下：
下的HVR间并置的一个或多个框架序列：(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-
FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在仍有又一个方面，框架序列自人共有框架序列衍生。在仍有又
一个方面，重链框架序列自Kabat亚组I，II，或III序列衍生。在仍有又一个方面，重链框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个重链框架序列如下：
[0222] HC-FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO：34)
[0223] HC-FR2 WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO：35)
[0224] HC-FR3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：16)
[0225] HC-FR4 WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：33)。
[0226] 在仍有又一个方面，轻链框架序列自KabatκI，II，III或IV亚组序列衍生。在仍有又一个方面，轻链框架序列是VL κI共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个轻链框架序
列如下：
列如下：
[0227] LC-FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：21)
[0228] LC-FR2 WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：22)
[0229] LC-FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：23)
[0230] LC-FR4 FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：36)。
[0231] 在仍有又一个具体的方面，抗体进一步包含人或鼠恒定区。在仍有又一个方面，人恒定区选自下组：IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3，IgG4。在仍有又一个具体的方面，人恒定区是IgG1。在仍有又一个方面，鼠恒定区选自下组：IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3。在仍有又一个方面，鼠恒定区是IgG2A。在仍有又一个具体的方面，抗体具有降低的或最小的效应器功能。在仍有又一个具体的方面，最小的效应器功能源自“效应器较小的Fc突变”或无糖基化。在仍
有又一个实施方案中，效应器较小的Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A替代。
有又一个实施方案中，效应器较小的Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A替代。
[0232] 在还有另一个实施方案中，提供了抗PDL1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0233] (c)重链进一步包含与GFTFSDSWIH(SEQ ID NO：4)，AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：5)和RHWPGGFDY(SEQ ID NO：6)分别具有至少85％序列同一性的HVR-H1，HVR-H2和HVR-
H3序列，或(d)轻链进一步包含分别与RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：1)，SASFLYS(SEQ ID NO：2)和QQYLYHPAT(SEQ ID NO：3)具有至少85％序列同一性的HVR-L1，HVR-L2和HVR-L3序列。
H3序列，或(d)轻链进一步包含分别与RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：1)，SASFLYS(SEQ ID NO：2)和QQYLYHPAT(SEQ ID NO：3)具有至少85％序列同一性的HVR-L1，HVR-L2和HVR-L3序列。
[0234] 在一个具体的方面，序列同一性是86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。在另一个方面，重链可变区包含如下的HVR间并置的一个或多个框架序列：(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-
(HC-FR4)，且轻链可变区包含如下的HVR间并置的一个或多个框架序列：(LC-FR1)-(HVR-
L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在还有另一个方面，框架序列自
人共有框架序列衍生。在仍有又一个方面，重链框架序列自Kabat亚组I，II，或III序列衍
生。在仍有又一个方面，重链框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个重链框架序列如下：
(HC-FR4)，且轻链可变区包含如下的HVR间并置的一个或多个框架序列：(LC-FR1)-(HVR-
L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在还有另一个方面，框架序列自
人共有框架序列衍生。在仍有又一个方面，重链框架序列自Kabat亚组I，II，或III序列衍
生。在仍有又一个方面，重链框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个重链框架序列如下：
[0235] HC-FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：34)
[0236] HC-FR2 WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：35)
[0237] HC-FR3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：16)
[0238] HC-FR4 WGQGTLVTVSSASTK(SEQ ID NO：33)。
[0239] 在仍有又一个方面，轻链框架序列自KabatκI，II，III或IV亚组序列衍生。在仍有又一个方面，轻链框架序列是VL κI共有框架。在仍有又一个方面，一个或多个轻链框架序
列如下：
列如下：
[0240] LC-FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：21)
[0241] LC-FR2 WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：22)
[0242] LC-FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：23)
[0243] LC-FR4 FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：24)。
[0244] 在仍有又一个具体的方面，抗体进一步包含人或鼠恒定区。在仍有又一个方面，人恒定区选自下组：IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3，IgG4。在仍有又一个具体的方面，人恒定区是IgG1。在仍有又一个方面，鼠恒定区选自下组：IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG3。在仍有又一个方面，鼠恒定区是IgG2A。在仍有又一个具体的方面，抗体具有降低的或最小的效应器功能。在仍有又一个具体的方面，最小效应器功能源自“效应器较小的Fc突变”或无糖基化。在仍有
又一个实施方案中，效应器较小的Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A替代。
又一个实施方案中，效应器较小的Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A替代。
[0245] 在仍有又一个实施方案中，提供了分离的抗PDL1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中：
[0246] (a)重链序列与下述重链序列具有至少85％序列同一性：
[0247] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTK(SEQ ID NO：8)，
[0248] 或
[0249] (b)轻链序列与下述轻链序列具有至少85％序列同一性：
[0250] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：7)。
[0251] 在一些实施方案中，提供了分离的抗PDL1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中轻链可变区序列与氨基酸序列SEQ ID NO：7具有至少85％，至少86％，至少87％，至少
88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，提供了分离的抗PDL1抗
体，其包含重链和轻链可变区序列，其中重链可变区序列与氨基酸序列SEQ ID NO：8具有至
少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少
93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，提供了分离的抗PDL1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中轻链可变区序
列与氨基酸序列SEQ ID NO：7具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少
98％，或至少99％序列同一性且重链可变区序列与氨基酸序列SEQ ID NO：8具有至少85％，
至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少
94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性。
88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，提供了分离的抗PDL1抗
体，其包含重链和轻链可变区序列，其中重链可变区序列与氨基酸序列SEQ ID NO：8具有至
少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少
93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，提供了分离的抗PDL1抗体，其包含重链和轻链可变区序列，其中轻链可变区序
列与氨基酸序列SEQ ID NO：7具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少
98％，或至少99％序列同一性且重链可变区序列与氨基酸序列SEQ ID NO：8具有至少85％，
至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少
94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性。
[0252] 在仍有又一个实施方案中，提供了分离的抗PDL1抗体，其包含重链和轻链序列，其中：
[0253] (a)重链序列与下述重链序列具有至少85％序列同一性：
[0254] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG
CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS
CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ
YASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG
FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
(SEQ ID NO：10)，
CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS
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FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
(SEQ ID NO：10)，
[0255] 或
[0256] (b)轻链序列与下述轻链序列具有至少85％序列同一性：
[0257] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA
KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID
NO：9)。
KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID
NO：9)。
[0258] 在一些实施方案中，提供了分离的抗PDL1抗体，其包含重链和轻链序列，其中轻链序列与氨基酸序列SEQ ID NO：9具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少
98％，或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，提供了分离的抗PDL1抗体，其包含重链
和轻链序列，其中重链序列与氨基酸序列SEQ ID NO：10具有至少85％，至少86％，至少
87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，提供了分离的抗PDL1抗体，其包含重链和轻链序列，其中轻链序列与氨基酸序列SEQ ID NO：9具有至少
85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性且重链序列与氨基酸序列SEQ ID NO：10具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少
90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性。
98％，或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，提供了分离的抗PDL1抗体，其包含重链
和轻链序列，其中重链序列与氨基酸序列SEQ ID NO：10具有至少85％，至少86％，至少
87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，提供了分离的抗PDL1抗体，其包含重链和轻链序列，其中轻链序列与氨基酸序列SEQ ID NO：9具有至少
85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性且重链序列与氨基酸序列SEQ ID NO：10具有至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少
90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性。
[0259] 在一些实施方案中，分离的抗PDL1抗体为氧化的单克隆抗体。在一些实施方案中，配制剂中的氧化的单克隆抗体包含包含氨基酸序列SEQ ID NO：9的轻链和包含氨基酸序列
SEQ ID NO：10的重链。在一些实施方案中，配制剂中的氧化的单克隆抗体包含包含氨基酸
序列SEQ ID NO：10的重链，其中W33，W50，或W101中一项或多项是氧化的。在一些实施方案中，配制剂中的氧化的单克隆抗体包含包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的重链，其中M253和
M429中一项或多项是氧化的。在一些实施方案中，氧化的单克隆抗体保留它在贮存前(即在
制备该药物配制剂的时候)展现的生物学活性(例如对靶物的结合，或治疗效力)的至少约
60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，或至少约95％。
SEQ ID NO：10的重链。在一些实施方案中，配制剂中的氧化的单克隆抗体包含包含氨基酸
序列SEQ ID NO：10的重链，其中W33，W50，或W101中一项或多项是氧化的。在一些实施方案中，配制剂中的氧化的单克隆抗体包含包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的重链，其中M253和
M429中一项或多项是氧化的。在一些实施方案中，氧化的单克隆抗体保留它在贮存前(即在
制备该药物配制剂的时候)展现的生物学活性(例如对靶物的结合，或治疗效力)的至少约
60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，或至少约95％。
[0260] 在一些实施方案中，分离的抗PDL1抗体为糖化的单克隆抗体。在一些实施方案中，配制剂中的糖化的单克隆抗体包含包含氨基酸序列SEQ ID NO：9的轻链和包含氨基酸序列
SEQ ID NO：10的重链。在一些实施方案中，配制剂中的糖化的单克隆抗体包含包含氨基酸
序列SEQ ID NO：10的重链，其中一个或多个赖氨酸是糖化的。在一些实施方案中，配制剂中的糖化的单克隆抗体包含包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的重链，其中K65是糖化的。
SEQ ID NO：10的重链。在一些实施方案中，配制剂中的糖化的单克隆抗体包含包含氨基酸
序列SEQ ID NO：10的重链，其中一个或多个赖氨酸是糖化的。在一些实施方案中，配制剂中的糖化的单克隆抗体包含包含氨基酸序列SEQ ID NO：10的重链，其中K65是糖化的。
[0261] 在一些实施方案中，分离的抗PDL1抗体是无糖基化的。
[0262] 在本文中的任何实施方案中，分离的抗PDL1抗体能结合人PD-L1，例如UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9NZQ7.1中所示人PD-L1，或其变体。
[0263] 在仍有又一个实施方案中，提供了分离的核酸，其编码本文所述任何抗体。在一些实施方案中，该核酸进一步包含适合于表达编码先前所述抗PDL1抗体的核酸的载体。在仍
有又一个具体的方面，该载体在适合于表达该核酸的宿主细胞中。在仍有又一个具体的方
面，该宿主细胞为真核细胞或原核细胞。在仍有又一个具体的方面，该真核细胞为哺乳动物
细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
有又一个具体的方面，该载体在适合于表达该核酸的宿主细胞中。在仍有又一个具体的方
面，该宿主细胞为真核细胞或原核细胞。在仍有又一个具体的方面，该真核细胞为哺乳动物
细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
[0264] 抗体或其抗原结合片段可以使用本领域已知方法来生成，例如包括下述步骤的方法，即在适合于生成此类抗体或片段的条件下培养含有以适合于表达的方式编码任何先前
所述抗PDL1抗体或抗原结合片段的核酸的宿主细胞，并回收该抗体或片段。
所述抗PDL1抗体或抗原结合片段的核酸的宿主细胞，并回收该抗体或片段。
[0265] B.抗体制备
[0266] 配制剂中的抗体使用本领域中用于生成抗体的可用技术来制备，下述各节更为详细地描述了其例示性方法。
[0267] 抗体针对感兴趣抗原(即PD-L1，诸如人PD-L1)。优选地，抗原是生物学重要多肽，而且对罹患病症的哺乳动物施用抗体能在该哺乳动物中导致治疗好处。
[0268] (i)抗原制备
[0269] 可溶性抗原或其片段(任选缀合有其它分子)可作为免疫原用于生成抗体。对于跨膜分子，诸如受体，它们的片段(例如受体的胞外结构域)可用作免疫原。或者，表达跨膜分
子的细胞可用作免疫原。此类细胞可衍生自天然来源(例如癌细胞系)，或者可以是经重组
技术转化而表达跨膜分子的细胞。对于制备抗体有用的其它抗原及其形式对于本领域技术
人员会是显而易见的。
子的细胞可用作免疫原。此类细胞可衍生自天然来源(例如癌细胞系)，或者可以是经重组
技术转化而表达跨膜分子的细胞。对于制备抗体有用的其它抗原及其形式对于本领域技术
人员会是显而易见的。
[0270] (ii)某些基于抗体的方法
[0271] 多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨
酸残基缀合)，N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)，戊二醛，琥珀酸酐，SOCl2或R1N＝C＝
NR，其中R和R1是不同的烃基，将相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋白质(例如匙
孔 血蓝蛋白，血清清蛋白，牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合可能是有用的。
酸残基缀合)，N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)，戊二醛，琥珀酸酐，SOCl2或R1N＝C＝
NR，其中R和R1是不同的烃基，将相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋白质(例如匙
孔 血蓝蛋白，血清清蛋白，牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合可能是有用的。
[0272] 通过将例如100μg或5μg蛋白质或缀合物(分别用于家兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位，将动物针对抗原，免疫原性缀合物或衍生
物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10的肽
或缀合物对动物进行加强免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动
物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateau)。优选的是，将动物用相同抗原但与不同蛋
白质和/或通过不同交联剂缀合得到的缀合物进行加强免疫。缀合物还可在重组细胞培养
中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。
物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10的肽
或缀合物对动物进行加强免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动
物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateau)。优选的是，将动物用相同抗原但与不同蛋
白质和/或通过不同交联剂缀合得到的缀合物进行加强免疫。缀合物还可在重组细胞培养
中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。
[0273] 本发明的单克隆抗体可使用杂交瘤方法来生成，其首先记载于Kohler et al.，Nature，256：495(1975)，并进一步记载于例如Hongo et al.，Hybridoma，14(3)：253-260(1995)；Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor
Laboratory Press，2nd ed.1988)；Hammerling et al.，in：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981)；和Ni，Xiandai Mianyixue，26(4)：
265-268(2006)，关于人-人杂交瘤。别的方法包括那些记载于例如美国专利No.7,189,826
的，其关于自杂交瘤细胞系生成单克隆人天然IgM抗体。人杂交瘤技术(三元杂交瘤
(Trioma)技术)记载于Vollmers and Brandlein，Histology and Histopathology，20(3)：
927-937(2005)和Vollmers and Brandlein，Methods and Findings in Experimental
and Clinical Pharmacology，27(3)：185-91(2005)。
Laboratory Press，2nd ed.1988)；Hammerling et al.，in：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981)；和Ni，Xiandai Mianyixue，26(4)：
265-268(2006)，关于人-人杂交瘤。别的方法包括那些记载于例如美国专利No.7,189,826
的，其关于自杂交瘤细胞系生成单克隆人天然IgM抗体。人杂交瘤技术(三元杂交瘤
(Trioma)技术)记载于Vollmers and Brandlein，Histology and Histopathology，20(3)：
927-937(2005)和Vollmers and Brandlein，Methods and Findings in Experimental
and Clinical Pharmacology，27(3)：185-91(2005)。
[0274] 关于各种其它杂交瘤技术，参见例如US 2006/258841；US 2006/183887(完全人的抗体)；US 2006/059575；US 2005/287149；US 2005/100546；US 2005/026229；和美国专利No.7,078,492和No.7,153,507。一种使用杂交瘤方法来生成单克隆抗体的例示性方案记载
如下。在一个实施方案中，免疫小鼠或其它适宜宿主动物(诸如仓鼠)以引发生成或能够生
成会特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注
射本发明的多肽或其片段和佐剂诸如单磷脂酰脂质A(MPL)/海藻糖二棒分枝菌酸酯(TDM)
(Ribi Immunochem.Research，Inc.，Hamilton，Mont.)，在动物中生成抗体。本发明的多肽(例如抗原)或其片段可使用本领域公知方法来制备，诸如重组方法，其中一些在本文中有
进一步描述。对来自经免疫动物的血清测定抗抗原抗体，并任选施用加强免疫。自生成抗抗
原抗体的动物分离淋巴细胞。或者，在体外免疫淋巴细胞。
如下。在一个实施方案中，免疫小鼠或其它适宜宿主动物(诸如仓鼠)以引发生成或能够生
成会特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注
射本发明的多肽或其片段和佐剂诸如单磷脂酰脂质A(MPL)/海藻糖二棒分枝菌酸酯(TDM)
(Ribi Immunochem.Research，Inc.，Hamilton，Mont.)，在动物中生成抗体。本发明的多肽(例如抗原)或其片段可使用本领域公知方法来制备，诸如重组方法，其中一些在本文中有
进一步描述。对来自经免疫动物的血清测定抗抗原抗体，并任选施用加强免疫。自生成抗抗
原抗体的动物分离淋巴细胞。或者，在体外免疫淋巴细胞。
[0275] 然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞。参见例如Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986)。可使用高效融合，支持选定的抗体生成细胞稳定地高水平生成抗
体，且对培养基诸如HAT培养基敏感的骨髓瘤细胞。例示性的骨髓瘤细胞包括但不限于鼠骨
髓瘤系，诸如那些衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤(可得自索尔克(Salk)研究所细胞分发
中心，San Diego，Calif.USA)的，及SP-2或X63-Ag8-653细胞(可得自美国典型培养物保藏
中心，Rockville，Md.USA)的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也记载用于生成人单
克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，
1987))。
体，且对培养基诸如HAT培养基敏感的骨髓瘤细胞。例示性的骨髓瘤细胞包括但不限于鼠骨
髓瘤系，诸如那些衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤(可得自索尔克(Salk)研究所细胞分发
中心，San Diego，Calif.USA)的，及SP-2或X63-Ag8-653细胞(可得自美国典型培养物保藏
中心，Rockville，Md.USA)的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也记载用于生成人单
克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，
1987))。
[0276] 将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，例如含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质的培养基。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏次
黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型地会含有次
黄嘌呤，氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。优选地，使用无
血清杂交瘤细胞培养方法来降低动物衍生血清(诸如胎牛血清)的使用，如记载于例如Even
et al.，Trends in Biotechnology，24(3)，105-108(2006)。
黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型地会含有次
黄嘌呤，氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。优选地，使用无
血清杂交瘤细胞培养方法来降低动物衍生血清(诸如胎牛血清)的使用，如记载于例如Even
et al.，Trends in Biotechnology，24(3)，105-108(2006)。
[0277] 作为提高杂交瘤细胞培养物生产力的工具的寡肽记载于Franek，Trends in Monoclonal Antibody Research，111-122(2005)。具体地，标准培养基富含某些氨基酸(丙
氨酸，丝氨酸，天冬酰胺，脯氨酸)或蛋白质水解产物级分，而且可通过由3-6个氨基酸残基
构成的合成寡肽来显著遏制凋亡。所述肽以毫摩尔或更高浓度存在。
氨酸，丝氨酸，天冬酰胺，脯氨酸)或蛋白质水解产物级分，而且可通过由3-6个氨基酸残基
构成的合成寡肽来显著遏制凋亡。所述肽以毫摩尔或更高浓度存在。
[0278] 可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养液测定结合本发明抗原的单克隆抗体的生成。可通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测
定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和
力可通过例如Scatchard分析来测定。参见例如Munson et al.，Anal.Biochem.107：220
(1980)。
定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和
力可通过例如Scatchard分析来测定。参见例如Munson et al.，Anal.Biochem.107：220
(1980)。
[0279] 在鉴定得到生成具有期望特异性，亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆并通过标准方法进行培养。参见例如Goding，见上文。适
于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在动物中
作为腹水瘤进行体内培养。可通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose，
羟磷灰石层析，凝胶电泳，透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养液，腹水或
血清适当分开。一种用于自杂交瘤细胞分离蛋白质的规程记载于US 2005/176122和美国专
利No.6,919,436。该方法包括在结合过程中最低限度地使用盐，诸如易溶盐，而且优选还在
洗脱过程中使用少量的有机溶剂。
于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在动物中
作为腹水瘤进行体内培养。可通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose，
羟磷灰石层析，凝胶电泳，透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养液，腹水或
血清适当分开。一种用于自杂交瘤细胞分离蛋白质的规程记载于US 2005/176122和美国专
利No.6,919,436。该方法包括在结合过程中最低限度地使用盐，诸如易溶盐，而且优选还在
洗脱过程中使用少量的有机溶剂。
[0280] (iii)某些文库筛选方法
[0281] 本发明的抗体可以通过使用组合库筛选具有一种或多种期望活性的抗体来生成。例如，本领域知道用于构建噬菌体展示库及对此类文库筛选具有期望的结合特征的抗体的
多种方法。此类方法一般记载于Hoogenboom et al.in Methods in Molecular Biology
178：1-37(O’Brien et al.，ed.，Human Press，Totowa，N.J.，2001)。例如，一种产生感兴趣抗体的方法是经由使用如Lee et al.，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-93中所描述的噬
菌体抗体文库。
多种方法。此类方法一般记载于Hoogenboom et al.in Methods in Molecular Biology
178：1-37(O’Brien et al.，ed.，Human Press，Totowa，N.J.，2001)。例如，一种产生感兴趣抗体的方法是经由使用如Lee et al.，J.Mol.Biol.(2004)，340(5)：1073-93中所描述的噬
菌体抗体文库。
[0282] 原则上，通过筛选噬菌体文库来选择合成的抗体克隆，所述噬菌体文库含有展示融合至噬菌体外壳蛋白的各种抗体可变区(Fv)片段的噬菌体。通过针对所需抗原的亲和层
析来淘选此类噬菌体文库。表达能够结合所需抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，从而与
文库中不结合的克隆分开。然后将结合的克隆从抗原上洗脱，而且可以通过额外的抗原吸
附/洗脱循环进一步富集。本发明的任何抗体可以如下获得，即设计合适的抗原筛选规程来
选择感兴趣的噬菌体克隆，接着使用来自感兴趣的噬菌体克隆的Fv序列和Kabat et al.，
Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publication91-3242，
Bethesda Md.(1991)，卷1-3中记载的合适的恒定区(Fc)序列来构建全长抗体克隆。
析来淘选此类噬菌体文库。表达能够结合所需抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，从而与
文库中不结合的克隆分开。然后将结合的克隆从抗原上洗脱，而且可以通过额外的抗原吸
附/洗脱循环进一步富集。本发明的任何抗体可以如下获得，即设计合适的抗原筛选规程来
选择感兴趣的噬菌体克隆，接着使用来自感兴趣的噬菌体克隆的Fv序列和Kabat et al.，
Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publication91-3242，
Bethesda Md.(1991)，卷1-3中记载的合适的恒定区(Fc)序列来构建全长抗体克隆。
[0283] 在某些实施方案中，抗体的抗原结合域由两个约110个氨基酸的可变(V)区形成，分别来自轻链(VL)和重链(VH)，都呈现三个高变环(HVR)或互补决定区(CDR)。可变域可以
功能性地展示在噬菌体上，或是作为单链Fv(scFv)片段(其中VH和VL通过短的，柔性的肽共
价相连)，或者作为Fab片段(其中它们各自与恒定域融合且非共价相互作用)，如Winter et
al.，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)所述。在用于本文时，编码scFv的噬菌体克隆和编码Fab的噬菌体克隆统称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。
功能性地展示在噬菌体上，或是作为单链Fv(scFv)片段(其中VH和VL通过短的，柔性的肽共
价相连)，或者作为Fab片段(其中它们各自与恒定域融合且非共价相互作用)，如Winter et
al.，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)所述。在用于本文时，编码scFv的噬菌体克隆和编码Fab的噬菌体克隆统称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。
[0284] VH和VL基因的全集可以通过聚合酶链式反应(PCR)分开克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以搜索抗原结合克隆，如Winter et al.，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)所述。来自经免疫来源的文库提供对免疫原有高亲和力的抗体，无需构建杂交瘤。或
者，可以克隆未免疫的全集，用于为广泛的非自身的及自身的抗原提供单一人抗体来源，无
需任何免疫，如Griffiths et al.，EMBO J，12：725-734(1993)所述。最后，未免疫的文库还可以以合成方式来构建，即从干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用包含随机序列的PCR
引物来编码高度可变的CDR3区及用来在体外实现重排，如Hoogenboom and Winter，
J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。
者，可以克隆未免疫的全集，用于为广泛的非自身的及自身的抗原提供单一人抗体来源，无
需任何免疫，如Griffiths et al.，EMBO J，12：725-734(1993)所述。最后，未免疫的文库还可以以合成方式来构建，即从干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用包含随机序列的PCR
引物来编码高度可变的CDR3区及用来在体外实现重排，如Hoogenboom and Winter，
J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。
[0285] 在某些实施方案中，通过与次要外壳蛋白pIII融合，使用丝状噬菌体来展示抗体片段。抗体片段可以展示为单链Fv片段，其中VH与VL结构域通过柔性多肽间隔物在同一多
肽链上相连，例如如Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述，或者展示为Fab片段，其中一条链与pIII融合，另一条链分泌入细菌宿主细胞周质，在此装配Fab-外壳蛋白
结构，其通过替换一些野生型外壳蛋白而展示在噬菌体表面上，例如如Hoogenboom et
al.，Nucl.Acids Res.，19：4133-4137(1991)所述。
肽链上相连，例如如Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述，或者展示为Fab片段，其中一条链与pIII融合，另一条链分泌入细菌宿主细胞周质，在此装配Fab-外壳蛋白
结构，其通过替换一些野生型外壳蛋白而展示在噬菌体表面上，例如如Hoogenboom et
al.，Nucl.Acids Res.，19：4133-4137(1991)所述。
[0286] 一般而言，从收获自人或动物的免疫细胞获得编码抗体基因片段的核酸。如果希望文库偏向抗抗原克隆，那么可以给受试者免疫接种抗原以产生抗体应答，并回收脾细胞
和/或循环B细胞或其它外周血淋巴细胞(PBL)用于文库构建。在一个实施方案中，如下得到
了偏向抗抗原克隆的人抗体基因片段文库，即在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列(且缺
乏功能性内源抗体生成系统)的转基因小鼠中产生抗抗原抗体应答，使得抗原免疫接种产
生生成针对抗原的人抗体的B细胞。生成人抗体的转基因小鼠的生成在下文中有描述。
和/或循环B细胞或其它外周血淋巴细胞(PBL)用于文库构建。在一个实施方案中，如下得到
了偏向抗抗原克隆的人抗体基因片段文库，即在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列(且缺
乏功能性内源抗体生成系统)的转基因小鼠中产生抗抗原抗体应答，使得抗原免疫接种产
生生成针对抗原的人抗体的B细胞。生成人抗体的转基因小鼠的生成在下文中有描述。
[0287] 可以如下获得抗抗原反应性细胞群的进一步富集，即使用合适的筛选规程来分离表达抗原特异性膜结合抗体的B细胞，例如通过使用抗原亲和层析进行的细胞分离或者细
胞对荧光染料标记的抗原的吸附及后续的荧光激活细胞分选(flow-activated cell
sorting，FACS)。
胞对荧光染料标记的抗原的吸附及后续的荧光激活细胞分选(flow-activated cell
sorting，FACS)。
[0288] 或者，来自未免疫供体的脾细胞和/或B细胞或其它PBL的使用提供了可能的抗体全集的更佳展现，而且还容许使用抗原在其中没有抗原性的任何动物(人或非人的)物种构
建抗体文库。对于构建体外掺入抗体基因的文库，从受试者收获干细胞以提供编码未重排
抗体基因区段的核酸。可以从多种动物物种(诸如人，小鼠，大鼠，兔类，狼(luprine)，犬，猫，猪，牛，马和鸟类物种等)获得感兴趣的免疫细胞。
建抗体文库。对于构建体外掺入抗体基因的文库，从受试者收获干细胞以提供编码未重排
抗体基因区段的核酸。可以从多种动物物种(诸如人，小鼠，大鼠，兔类，狼(luprine)，犬，猫，猪，牛，马和鸟类物种等)获得感兴趣的免疫细胞。
[0289] 从感兴趣的细胞回收编码抗体可变基因区段(包括VH和VL区段)的核酸并扩增。就重排的VH和VL基因文库而言，可以如下获得所需DNA，即从淋巴细胞分离基因组DNA或mRNA，
接着用与重排的VH和VL基因的5′和3′末端匹配的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，如
Orlandi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：3833-3837(1989)所述，由此构建多样性V基因全集供表达。可以从cDNA和基因组DNA扩增V基因，反向引物位于编码成熟V结构域的
外显子的5′末端，正向引物基于J区段内部，如Orlandi等(1989)和Ward et al.，Nature，
341：544-546(1989)所述。然而，为了从cDNA进行扩增，反向引物还可基于前导外显子内，如Jones et al.，Biotechnol.，9：88-89(1991)所述，正向引物基于恒定区内，如Sastry et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：5728-5732(1989)所述。为了使互补性最大化，引物中可以掺入简并性，如Orlandi等(1989)或Sastry等(1989)所述。在某些实施方案中，如下将
文库多样性最大化，即使用靶向每个V基因家族的PCR引物来扩增免疫细胞核酸样品中存在
的所有可得的VH和VL排列，例如如Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)的方法中所述或Orum et al.，Nucleic Acids Res.，21：4491-4498(1993)的方法中所述。为了将
所扩增的DNA克隆入表达载体，可以在PCR引物的一端引入罕见的限制性位点作为标签，如
Orlandi等(1989)所述，或者用带标签的引物进行进一步的PCR扩增，如Clackson et al.，
Nature，352：624-628(1991)所述。
接着用与重排的VH和VL基因的5′和3′末端匹配的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，如
Orlandi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：3833-3837(1989)所述，由此构建多样性V基因全集供表达。可以从cDNA和基因组DNA扩增V基因，反向引物位于编码成熟V结构域的
外显子的5′末端，正向引物基于J区段内部，如Orlandi等(1989)和Ward et al.，Nature，
341：544-546(1989)所述。然而，为了从cDNA进行扩增，反向引物还可基于前导外显子内，如Jones et al.，Biotechnol.，9：88-89(1991)所述，正向引物基于恒定区内，如Sastry et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：5728-5732(1989)所述。为了使互补性最大化，引物中可以掺入简并性，如Orlandi等(1989)或Sastry等(1989)所述。在某些实施方案中，如下将
文库多样性最大化，即使用靶向每个V基因家族的PCR引物来扩增免疫细胞核酸样品中存在
的所有可得的VH和VL排列，例如如Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)的方法中所述或Orum et al.，Nucleic Acids Res.，21：4491-4498(1993)的方法中所述。为了将
所扩增的DNA克隆入表达载体，可以在PCR引物的一端引入罕见的限制性位点作为标签，如
Orlandi等(1989)所述，或者用带标签的引物进行进一步的PCR扩增，如Clackson et al.，
Nature，352：624-628(1991)所述。
[0290] 合成重排的V基因全集可以在体外从V基因区段衍生。大多数人VH基因区段已经克隆和测序(Tomlinson et al.，J.Mol.Biol.，227：776-798(1992))，并定位(Matsuda et
al.，Nature Genet.，3：88-94(1993))；这些克隆的区段(包括H1和H2环的所有主要构造)可用于生成多样性VH基因全集，用到编码序列和长度多样性的H3环的PCR引物，如Hoogenboom
and Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。VH全集还可如下生成，所有序列多样性集中于单一长度的长H3环，如Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457-4461
(1992)所述。人Vκ和Vλ区段已经克隆和测序(Williams and Winter，Eur.J.Immunol.，23：
1456-1461(1993))，而且可用于生成合成轻链全集。基于一系列VH和VL折叠结构及L3和H3
长度的合成V基因全集会编码具有可观结构多样性的抗体。扩增编码V基因的DNA后，依照
Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)的方法，可以在体外重排种系V基因区段。
al.，Nature Genet.，3：88-94(1993))；这些克隆的区段(包括H1和H2环的所有主要构造)可用于生成多样性VH基因全集，用到编码序列和长度多样性的H3环的PCR引物，如Hoogenboom
and Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。VH全集还可如下生成，所有序列多样性集中于单一长度的长H3环，如Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457-4461
(1992)所述。人Vκ和Vλ区段已经克隆和测序(Williams and Winter，Eur.J.Immunol.，23：
1456-1461(1993))，而且可用于生成合成轻链全集。基于一系列VH和VL折叠结构及L3和H3
长度的合成V基因全集会编码具有可观结构多样性的抗体。扩增编码V基因的DNA后，依照
Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)的方法，可以在体外重排种系V基因区段。
[0291] 抗体片段全集可以如下构建，即以数种方式将VH与VL基因全集组合在一起。可以在不同载体中创建各个全集，并在体外重组载体，例如如Hogrefe et al.，Gene，128：119-
126(1993)所述，或者在体内通过组合感染来重组载体，例如Waterhouse et al.，
Nucl.Acids Res.，21：2265-2266(1993)中记载的loxP系统。体内重组方法利用Fab片段的
双链性质来克服因大肠杆菌转化效率施加的库容量限制。分开克隆未免疫的VH和VL全集，
一个克隆入噬菌粒，另一个克隆入噬菌体载体。然后通过用噬菌体感染含噬菌粒的细菌使
12
得每个细胞包含一种不同组合来组合两个文库，库容量只受细胞存在数的限制(约10 个克
隆)。两种载体都包含体内重组信号，使得VH与VL基因重组到单一复制子上，并共包装成噬
菌体病毒粒。这些巨型文库提供了大量的具有优良亲和力(Kd-1为约10-8M)的多样性抗体。
126(1993)所述，或者在体内通过组合感染来重组载体，例如Waterhouse et al.，
Nucl.Acids Res.，21：2265-2266(1993)中记载的loxP系统。体内重组方法利用Fab片段的
双链性质来克服因大肠杆菌转化效率施加的库容量限制。分开克隆未免疫的VH和VL全集，
一个克隆入噬菌粒，另一个克隆入噬菌体载体。然后通过用噬菌体感染含噬菌粒的细菌使
12
得每个细胞包含一种不同组合来组合两个文库，库容量只受细胞存在数的限制(约10 个克
隆)。两种载体都包含体内重组信号，使得VH与VL基因重组到单一复制子上，并共包装成噬
菌体病毒粒。这些巨型文库提供了大量的具有优良亲和力(Kd-1为约10-8M)的多样性抗体。
[0292] 或者，可以将全集序贯克隆入同一载体，例如如Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：7978-7982(1991)所述，或者通过PCR装配到一起，然后克隆，例如如Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)所述。PCR装配还可用于将VH和VL
DNA与编码柔性肽间隔物的DNA连接以形成单链Fv(scFv)全集。在还有另一种技术中，“细胞
内PCR装配”用于通过PCR在淋巴细胞内组合VH与VL基因，然后克隆所连接基因的全集，如
Embleton et al.，Nucl.Acids Res.，20：3831-3837(1992)所述。
DNA与编码柔性肽间隔物的DNA连接以形成单链Fv(scFv)全集。在还有另一种技术中，“细胞
内PCR装配”用于通过PCR在淋巴细胞内组合VH与VL基因，然后克隆所连接基因的全集，如
Embleton et al.，Nucl.Acids Res.，20：3831-3837(1992)所述。
[0293] 未免疫文库(天然的或合成的)生成的抗体可具有中等亲和力(Kd-1为约106-107M-1)，但还可以如下在体外模拟亲和力成熟，即构建次生文库并再次选择，如Winter等
(1994)，见上文所述。例如，在Hawkins et al.，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992)的方法或Gram et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA，89：3576-3580(1992)的方法中，使用易错聚合酶
在体外随机引入突变(Leung et al.，Technique，1：11-15(1989))。另外，可以通过随机突变一个或多个CDR来进行亲和力成熟，例如在选定的个别Fv克隆中使用携带跨越感兴趣CDR
的随机序列的引物进行PCR并筛选更高亲和力的克隆。WO 9607754(公布于1996年3月14日)
记载了用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导诱变以创建轻链基因文库的方法。另一
种高效方法是将通过噬菌体展示选出的VH或VL结构域与得自未免疫供体的天然存在V结构
域变体全集重组，并在数轮链改组中筛选更高亲和力，如Marks et al.，Biotechnol.，10：
779-783(1992)所述。此技术容许生成亲和力约10-9M或更小的抗体和抗体片段。
(1994)，见上文所述。例如，在Hawkins et al.，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992)的方法或Gram et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA，89：3576-3580(1992)的方法中，使用易错聚合酶
在体外随机引入突变(Leung et al.，Technique，1：11-15(1989))。另外，可以通过随机突变一个或多个CDR来进行亲和力成熟，例如在选定的个别Fv克隆中使用携带跨越感兴趣CDR
的随机序列的引物进行PCR并筛选更高亲和力的克隆。WO 9607754(公布于1996年3月14日)
记载了用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导诱变以创建轻链基因文库的方法。另一
种高效方法是将通过噬菌体展示选出的VH或VL结构域与得自未免疫供体的天然存在V结构
域变体全集重组，并在数轮链改组中筛选更高亲和力，如Marks et al.，Biotechnol.，10：
779-783(1992)所述。此技术容许生成亲和力约10-9M或更小的抗体和抗体片段。
[0294] 文库的筛选可通过本领域已知的多种技术来实现。例如，抗原可用于包被吸附板的孔，在附着至吸附板的宿主细胞上表达，或用于细胞分选，或者缀合至生物素以用链霉亲
合素包被的珠捕捉，或者用于淘选噬菌体展示库的任何其它方法。
合素包被的珠捕捉，或者用于淘选噬菌体展示库的任何其它方法。
[0295] 在适于至少部分噬菌体颗粒结合吸附剂的条件下，使噬菌体文库样品接触固定化的抗原。正常情况下，选择包括pH，离子强度，温度等等的条件来模拟生理学条件。结合至固相的噬菌体进行清洗，然后用酸洗脱，例如如Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA，
88：7978-7982(1991)所述，或者用碱洗脱，例如如Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-
597(1991)所述，或者通过抗原竞争洗脱，例如在与Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)的抗原竞争法类似的规程中。噬菌体在单轮选择中可以富集20-1,000倍。此外，富集
的噬菌体可以在细菌培养物中进行培养，并进行更多轮选择。
88：7978-7982(1991)所述，或者用碱洗脱，例如如Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-
597(1991)所述，或者通过抗原竞争洗脱，例如在与Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)的抗原竞争法类似的规程中。噬菌体在单轮选择中可以富集20-1,000倍。此外，富集
的噬菌体可以在细菌培养物中进行培养，并进行更多轮选择。
[0296] 选择的效率取决于许多因素，包括清洗过程中解离的动力学，及单个噬菌体上的多个抗体片段是否能同时结合抗原。具有较快解离动力学(和弱结合亲和力)的抗体可以通
过使用短时间的清洗，多价噬菌体展示，及固相中的高抗原包被密度来保留。高密度不仅通
过多价相互作用而稳定了噬菌体，而且有利于已解离的噬菌体的再结合。具有较慢解离动
力学(和强结合亲和力)的抗体的选择可以通过使用长时间的清洗和单价噬菌体展示(如
Bass et al.，Proteins，8：309-314(1990)和WO 92/09690所述)及低抗原包被密度(如
Marks et al.，Biotechnol.，10：779-783(1992)所述)来促进。
过使用短时间的清洗，多价噬菌体展示，及固相中的高抗原包被密度来保留。高密度不仅通
过多价相互作用而稳定了噬菌体，而且有利于已解离的噬菌体的再结合。具有较慢解离动
力学(和强结合亲和力)的抗体的选择可以通过使用长时间的清洗和单价噬菌体展示(如
Bass et al.，Proteins，8：309-314(1990)和WO 92/09690所述)及低抗原包被密度(如
Marks et al.，Biotechnol.，10：779-783(1992)所述)来促进。
[0297] 有可能在对抗原具有不同亲和力的噬菌体抗体之间进行选择，甚至是亲和力略有差异的。然而，选定抗体的随机突变(例如如有些亲和力成熟技术中所进行的)有可能产生
许多突变体，多数结合抗原，少数具有更高的亲和力。通过限制抗原，罕见的高亲和力噬菌
体能竞争胜出。为了保留所有较高亲和力的突变体，可以将噬菌体与过量的生物素化抗原
一起温育，但是生物素化抗原的浓度以摩尔计低于抗原的目标摩尔亲和常数。然后可以用
链霉亲合素包被的顺磁珠捕捉高亲和力的结合噬菌体。此类“平衡捕捉”容许依照结合亲和
力来选择抗体，其灵敏性容许从大大过量的低亲和力噬菌体中分离出亲和力只有原值2倍
的突变体克隆。还可以操作用于清洗结合至固相的噬菌体的条件来进行基于解离动力学的
区分。
许多突变体，多数结合抗原，少数具有更高的亲和力。通过限制抗原，罕见的高亲和力噬菌
体能竞争胜出。为了保留所有较高亲和力的突变体，可以将噬菌体与过量的生物素化抗原
一起温育，但是生物素化抗原的浓度以摩尔计低于抗原的目标摩尔亲和常数。然后可以用
链霉亲合素包被的顺磁珠捕捉高亲和力的结合噬菌体。此类“平衡捕捉”容许依照结合亲和
力来选择抗体，其灵敏性容许从大大过量的低亲和力噬菌体中分离出亲和力只有原值2倍
的突变体克隆。还可以操作用于清洗结合至固相的噬菌体的条件来进行基于解离动力学的
区分。
[0298] 抗抗原克隆可以基于活性进行选择。在某些实施方案中，本发明提供了结合天然表达抗原的活细胞或结合游离漂浮抗原或附着于其它细胞结构的抗原的抗抗原抗体。对应
于此类抗抗原抗体的Fv克隆可以如下选出：(1)如上所述从噬菌体文库分离抗抗原克隆，并
任选通过在合适的细菌宿主中培养所分离的噬菌体克隆群来扩增该群体；(2)选出分别想
要阻断和不阻断其活性的抗原和第二蛋白质；(3)使抗抗原噬菌体克隆吸附至固定化的抗
原；(4)使用过量的第二蛋白质来洗脱任何不想要的，识别抗原结合决定簇(其与第二蛋白
质的结合决定簇交叠或共享)的克隆；并(5)洗脱在步骤(4)后仍然吸附的克隆。任选的是，
具有期望的阻断/不阻断特性的克隆可以通过一次或多次重复本文所述选择规程来进一步
富集。
于此类抗抗原抗体的Fv克隆可以如下选出：(1)如上所述从噬菌体文库分离抗抗原克隆，并
任选通过在合适的细菌宿主中培养所分离的噬菌体克隆群来扩增该群体；(2)选出分别想
要阻断和不阻断其活性的抗原和第二蛋白质；(3)使抗抗原噬菌体克隆吸附至固定化的抗
原；(4)使用过量的第二蛋白质来洗脱任何不想要的，识别抗原结合决定簇(其与第二蛋白
质的结合决定簇交叠或共享)的克隆；并(5)洗脱在步骤(4)后仍然吸附的克隆。任选的是，
具有期望的阻断/不阻断特性的克隆可以通过一次或多次重复本文所述选择规程来进一步
富集。
[0299] 编码本发明杂交瘤衍生单克隆抗体或噬菌体展示Fv克隆的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用设计成自杂交瘤或噬菌体DNA模板特异性扩增感兴趣的重链和
轻链编码区的寡核苷酸引物)。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染
入原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞，猿COS细胞，中国仓鼠卵
巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得所需单克隆抗体的合成。关于编码抗
体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra et al.，Curr.Opinion in
Immunol.，5：256(1993)及Pluckthun，Immunol.Revs，130：151(1992)。
轻链编码区的寡核苷酸引物)。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染
入原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞，猿COS细胞，中国仓鼠卵
巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得所需单克隆抗体的合成。关于编码抗
体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra et al.，Curr.Opinion in
Immunol.，5：256(1993)及Pluckthun，Immunol.Revs，130：151(1992)。
[0300] 编码本发明Fv克隆的DNA可以组合编码重链和/或轻链恒定区的已知DNA序列(例如适宜的DNA序列可得自Kabat等，见上文)以形成编码全长或部分长度重链和/或轻链的克
隆。应当领会，任何同种型的恒定区都可用于此目的，包括IgG，IgM，IgA，IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以得自任何人或动物物种。衍生自一种动物(诸如人)物种的可变域DNA，
然后与另一动物物种的恒定区DNA融合以形成“杂合的”全长重链和/或轻链的编码序列的
Fv克隆包括在本文所用“嵌合”和“杂合”抗体的定义中。在某些实施方案中，衍生自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合以形成全长或部分长度人重链和/或轻链的编码序列。
隆。应当领会，任何同种型的恒定区都可用于此目的，包括IgG，IgM，IgA，IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以得自任何人或动物物种。衍生自一种动物(诸如人)物种的可变域DNA，
然后与另一动物物种的恒定区DNA融合以形成“杂合的”全长重链和/或轻链的编码序列的
Fv克隆包括在本文所用“嵌合”和“杂合”抗体的定义中。在某些实施方案中，衍生自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合以形成全长或部分长度人重链和/或轻链的编码序列。
[0301] 还可以修饰编码衍生自本发明杂交瘤的抗抗原抗体的DNA，例如通过替代，即用人重链和轻链恒定域的编码序列替换衍生自杂交瘤克隆的同源鼠序列(例如如Morrison et
al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)中的方法)。可以进一步修饰编码杂交瘤或Fv克隆衍生抗体或片段的DNA，通过共价连接免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多
肽的整个或部分编码序列。可以以该方式制备具有本发明的Fv克隆或杂交瘤克隆衍生抗体
的结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。
al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)中的方法)。可以进一步修饰编码杂交瘤或Fv克隆衍生抗体或片段的DNA，通过共价连接免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多
肽的整个或部分编码序列。可以以该方式制备具有本发明的Fv克隆或杂交瘤克隆衍生抗体
的结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。
[0302] (iv)人源化抗体和人抗体
[0303] 本领域知道用于人源化非人抗体的多种方法。例如，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们通常取自
“输入”可变域。基本上可遵循Winter及其同事的方法进行人源化(Jones et al.，Nature，
321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science，239：1534-1536(1988))，即用啮齿类CDR或CDR序列替代人抗体的对应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中显著少于完整的人可变域用
非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下人抗体，其中有些CDR残基和
可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代。
“输入”可变域。基本上可遵循Winter及其同事的方法进行人源化(Jones et al.，Nature，
321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science，239：1534-1536(1988))，即用啮齿类CDR或CDR序列替代人抗体的对应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中显著少于完整的人可变域用
非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下人抗体，其中有些CDR残基和
可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代。
[0304] 用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变域的选择对于降低抗原性是非常重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知人可变域序列
的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)
(Sims et al.，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.，196：901
(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚类(subgroup)的所有人抗体的共有序列衍
生的特定框架。相同框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter et al.，Proc.Natl.Acad
Sci.USA，89：4285(1992)；Presta et al.，J.Immnol.，151：2623(1993))。
的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)
(Sims et al.，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.，196：901
(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚类(subgroup)的所有人抗体的共有序列衍
生的特定框架。相同框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter et al.，Proc.Natl.Acad
Sci.USA，89：4285(1992)；Presta et al.，J.Immnol.，151：2623(1993))。
[0305] 更为重要的是抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了达到此目的，依照该方法的一个实施方案，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模
型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋
白三维模型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序
列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像能分析残基在候选免疫球蛋
白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这
样，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，诸如对靶
抗原的亲和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。
型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋
白三维模型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序
列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像能分析残基在候选免疫球蛋
白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这
样，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，诸如对靶
抗原的亲和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。
[0306] 本发明的人抗体可以通过如上所述组合选自人衍生噬菌体展示库的Fv克隆可变域序列与已知的人恒定域序列来构建。或者，可以通过杂交瘤方法来生成本发明的人单克
隆抗体。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有记载，例如
Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody
Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，
1987)；及Boerner et al.，J.Immunol.，147：86(1991).
隆抗体。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有记载，例如
Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody
Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，
1987)；及Boerner et al.，J.Immunol.，147：86(1991).
[0307] 例如，有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连
接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量
人种系免疫球蛋白基因会导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits et al.，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature，362：255-258
(1993)；Bruggermann et al.，Year in Immuno.，7：33(1993)；及Duchosal et al.，Nature
355：258(1992)。
接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量
人种系免疫球蛋白基因会导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits et al.，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature，362：255-258
(1993)；Bruggermann et al.，Year in Immuno.，7：33(1993)；及Duchosal et al.，Nature
355：258(1992)。
[0308] 基因改组也可用于自非人(例如啮齿类)抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始非人抗体相似的亲和力和特异性。依照此方法，它也称为“表位印记”(epitope
imprinting)，如本文所述通过噬菌体展示技术得到的非人抗体片段的重链或轻链可变区
用人V结构域基因全集替换，产生非人链/人链scFv或Fab嵌合物群。用抗原进行的选择导致
非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人链在一级噬菌体展示克隆中消除相应的非人链
后恢复了抗原结合位点，即表位决定(印记，imprint)人链配偶的选择。在重复该过程以替
换剩余非人链时，得到人抗体(参见PCT WO 93/06213，公开于1993年4月1日)。与传统的通
过CDR移植进行的非人抗体的人源化不同，此技术提供完全人的抗体，它们不含非人起源的
FR或CDR残基。
imprinting)，如本文所述通过噬菌体展示技术得到的非人抗体片段的重链或轻链可变区
用人V结构域基因全集替换，产生非人链/人链scFv或Fab嵌合物群。用抗原进行的选择导致
非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人链在一级噬菌体展示克隆中消除相应的非人链
后恢复了抗原结合位点，即表位决定(印记，imprint)人链配偶的选择。在重复该过程以替
换剩余非人链时，得到人抗体(参见PCT WO 93/06213，公开于1993年4月1日)。与传统的通
过CDR移植进行的非人抗体的人源化不同，此技术提供完全人的抗体，它们不含非人起源的
FR或CDR残基。
[0309] (v)抗体片段
[0310] 抗体片段可以通过传统手段来生成，诸如酶促消化，或者通过重组技术来生成。在某些情况中，使用抗体片段，而不是完整抗体有优势。片段的较小尺寸容许快速清除，而且
可导致更易于到达实体瘤。某些抗体片段的综述参见Hudson et al.(2003)Nat.Med.9：
129-134。
可导致更易于到达实体瘤。某些抗体片段的综述参见Hudson et al.(2003)Nat.Med.9：
129-134。
[0311] 已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto et al.，Journal of Biochemical and Biophysical
Methods 24：107-117(1992)；及Brennan et al.，Science 229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab，Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达和由大肠
杆菌分泌，如此容许容易地生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗
体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter et al.，Bio/Technology 10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。包含补救受体结合表位残基，具有延长的体内半衰期的Fab和F
(ab′)2片段记载于美国专利No.5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人
员会是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894；及No.5,587,458。Fv和scFv是具有完整结合位点，缺少恒定区的唯一类
型；如此，它们可能适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建scFv融合蛋白以生成效应
器蛋白质在scFv的氨基或羧基末端的融合。参见Antibody Engineering，Borrebaeck编，见
上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所记载的。此类线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。
Methods 24：107-117(1992)；及Brennan et al.，Science 229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab，Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达和由大肠
杆菌分泌，如此容许容易地生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗
体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter et al.，Bio/Technology 10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。包含补救受体结合表位残基，具有延长的体内半衰期的Fab和F
(ab′)2片段记载于美国专利No.5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人
员会是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894；及No.5,587,458。Fv和scFv是具有完整结合位点，缺少恒定区的唯一类
型；如此，它们可能适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建scFv融合蛋白以生成效应
器蛋白质在scFv的氨基或羧基末端的融合。参见Antibody Engineering，Borrebaeck编，见
上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所记载的。此类线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。
[0312] (vi)多特异性抗体
[0313] 多特异性抗体具有对至少两种不同表位的结合特异性，其中所述表位通常来自不同抗原。尽管此类分子通常只会结合两种不同表位(即双特异性抗体，BsAb)，但是此表述在
用于本文时涵盖具有额外特异性的抗体，诸如三特异性抗体。可将双特异性抗体制备成全
长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
用于本文时涵盖具有额外特异性的抗体，诸如三特异性抗体。可将双特异性抗体制备成全
长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
[0314] 用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein et
al.，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤
(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的
双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类
似的规程披露于WO93/08829及Traunecker et al.，EMBO J.，10：3655-3659(1991)。
al.，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤
(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的
双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类
似的规程披露于WO93/08829及Traunecker et al.，EMBO J.，10：3655-3659(1991)。
[0315] 依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是，与包含至少部分铰链，CH2和CH3区的免疫球蛋
白重链恒定域进行融合。通常在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一
重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA插入
分开的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等
时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。
然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可
能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。
白重链恒定域进行融合。通常在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一
重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA插入
分开的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等
时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。
然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可
能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。
[0316] 在该方法的一个实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)
构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，因此
发现这种不对称结构便于将期望的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该
方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh et al.，
Methods in Enzymology，121：210(1986)。
构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，因此
发现这种不对称结构便于将期望的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该
方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh et al.，
Methods in Enzymology，121：210(1986)。
[0317] 依照WO96/27011中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。一种界面包含抗体恒定域的至少部分CH3
结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪
氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，
在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其
它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪
氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，
在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其
它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
[0318] 双特异性抗体包括交联的或“异源缀合的”抗体。例如，可以将异源缀合物中的一种抗体与亲合素偶联，而将另一种抗体与生物素偶联。此类抗体已经建议用于例如将免疫
系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)和用于治疗HIV感染(WO 91/00360，
WO 92/200373，和EP 03089)。异源缀合抗体可以使用任何方便的交联方法来制备。合适的
交联剂连同许多交联技术是本领域众所周知的，而且披露于美国专利No.4,676,980。
系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)和用于治疗HIV感染(WO 91/00360，
WO 92/200373，和EP 03089)。异源缀合抗体可以使用任何方便的交联方法来制备。合适的
交联剂连同许多交联技术是本领域众所周知的，而且披露于美国专利No.4,676,980。
[0319] 文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan et al.，Science，229：81(1985)记载了通过蛋白水解切割完
整抗体以生成F(ab′)2片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还
原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫化物的形成。然后将产生的Fab′片段转变为硫
代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复
成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
整抗体以生成F(ab′)2片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还
原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫化物的形成。然后将产生的Fab′片段转变为硫
代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复
成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
[0320] 最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby et al.，J.Exp.Med.，175：217-225(1992)记载了完全人源化的双
特异性抗体F(ab′)2分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab′片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。
特异性抗体F(ab′)2分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab′片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。
[0321] 还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny et al.，J.Immunol.，148(5)：1547-
1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部
分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种
方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-
6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通
过接头相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)，所述接头太短使得同一条链上的两个结
构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结
构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异
性抗体片段的另一种策略。参见Gruber et al.，J.Immunol.，152：5368(1994)。
1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部
分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种
方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-
6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通
过接头相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)，所述接头太短使得同一条链上的两个结
构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结
构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异
性抗体片段的另一种策略。参见Gruber et al.，J.Immunol.，152：5368(1994)。
[0322] 涵盖具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tuft et al.，J.Immunol.，147：60(1991)。
[0323] (vii)单域抗体
[0324] 在有些实施方案中，本发明的抗体是单域抗体(single-domain antibody)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或者整个或部分轻链可变域的单一多肽链。在某
些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，Mass.；参见例如美国专利No.6,248,516 B1)。在一个实施方案中，单域抗体由抗体的整个或部分重链可变域组成。
些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，Mass.；参见例如美国专利No.6,248,516 B1)。在一个实施方案中，单域抗体由抗体的整个或部分重链可变域组成。
[0325] (viii)抗体变体
[0326] 在有些实施方案中，涵盖本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以是通过将适宜的变化
引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的
残基删除和/或插入和/或替代。可进行任何删除，插入和替代组合以获得最终的构建物，倘
若最终的构建物具有期望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入受试抗体的氨基酸序
列。
引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的
残基删除和/或插入和/或替代。可进行任何删除，插入和替代组合以获得最终的构建物，倘
若最终的构建物具有期望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入受试抗体的氨基酸序
列。
[0327] (ix)抗体衍生物
[0328] 可进一步修饰本发明的抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。在某些实施方案中，适于抗体衍生化的模块是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限
制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，右旋糖苷，
聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊环，聚-1，3，6-三 烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)，右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚
物，环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇，及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而
且可以是分支的或不分支的。附着于抗体的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一
个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生
化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能，抗体衍生物是
否将用于指定条件下的治疗等。
制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，右旋糖苷，
聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊环，聚-1，3，6-三 烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)，右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚
物，环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇，及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而
且可以是分支的或不分支的。附着于抗体的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一
个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生
化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能，抗体衍生物是
否将用于指定条件下的治疗等。
[0329] (x)载体，宿主细胞，和重组方法
[0330] 也可以使用重组方法来生成抗体。为了重组生产抗抗原抗体，分离编码抗体的核酸，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可使用常规规程容易的分
离编码抗体的DNA并测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的寡
核苷酸探针)。可利用许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列，复制起点，一种或多种标志基因，增强子元件，启动子，和转录终止序列。
离编码抗体的DNA并测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的寡
核苷酸探针)。可利用许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列，复制起点，一种或多种标志基因，增强子元件，启动子，和转录终止序列。
[0331] (a)信号序列构件
[0332] 本发明的抗体不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽重组生产，所述异源多肽优选是成熟蛋白质或多肽的N-末端处的信号序列或具有特异性切割位
点的其它多肽。所选择的异源信号序列优选是受到宿主细胞识别并加工(例如受到信号肽
酶切割)的。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列用例如选
自碱性磷酸酶，青霉素酶，1pp或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列替换。为了酵母
分泌，天然信号序列可以用例如酵母转化酶前导序列，α因子前导序列(包括糖酵母属和克
鲁维氏酵母属α因子前导序列)，酸性磷酸酶前导序列，白色假丝酵母葡萄糖淀粉酶前导序
列，或WO 90/13646中记载的信号替换。在哺乳动物细胞表达中，可以利用哺乳动物信号序
列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。
点的其它多肽。所选择的异源信号序列优选是受到宿主细胞识别并加工(例如受到信号肽
酶切割)的。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列用例如选
自碱性磷酸酶，青霉素酶，1pp或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列替换。为了酵母
分泌，天然信号序列可以用例如酵母转化酶前导序列，α因子前导序列(包括糖酵母属和克
鲁维氏酵母属α因子前导序列)，酸性磷酸酶前导序列，白色假丝酵母葡萄糖淀粉酶前导序
列，或WO 90/13646中记载的信号替换。在哺乳动物细胞表达中，可以利用哺乳动物信号序
列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。
[0333] (b)复制起点
[0334] 表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列是能够使载体不依赖于宿主染色体DNA而复制的序
列，包括复制起点或自主复制序列。众所周知多种细菌，酵母和病毒的此类序列。来自质粒
pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起
点(SV40，多瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件(SV40起点的使用通常可能只是因为它包含早期启动
子)。
列，包括复制起点或自主复制序列。众所周知多种细菌，酵母和病毒的此类序列。来自质粒
pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起
点(SV40，多瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件(SV40起点的使用通常可能只是因为它包含早期启动
子)。
[0335] (c)选择基因构件
[0336] 表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予抗生素或其它毒素抗性，例如氨苄青霉素，新霉素，甲氨蝶呤，或四环素；(b)补足营养缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的关键营养物，例如编码芽孢杆菌D-丙氨
酸消旋酶的基因。
酸消旋酶的基因。
[0337] 选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的实例使用药物
新霉素，霉酚酸和潮霉素。
新霉素，霉酚酸和潮霉素。
[0338] 适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是能够鉴定有能力摄取抗体编码核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR，谷氨酰胺合酶(GS)，胸苷激酶，金属硫蛋白-I和-II优选灵长类金属硫蛋白基因，腺苷脱氨酶，鸟氨酸脱羧酶等。
[0339] 例如，通过将转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR基因转化的细胞。在这些条件下，DHFR基因与任何其它共转化的
核酸一起扩增。可使用内源DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCC CRL-
9096)。
核酸一起扩增。可使用内源DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCC CRL-
9096)。
[0340] 或者，通过将转化子在含有L-甲硫氨酸亚砜亚胺(Msx)(L-methionine sulfoximine)(GS的一种抑制剂)的培养基中进行培养来鉴定经GS基因转化的细胞。在这些
条件下，GS基因与任何其它共转化的核酸一起扩增。可以与上文描述的DHFR选择/扩增系统
组合地使用GS选择/扩增系统。
条件下，GS基因与任何其它共转化的核酸一起扩增。可以与上文描述的DHFR选择/扩增系统
组合地使用GS选择/扩增系统。
[0341] 或者，可以通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素，新霉素，或G418的培养基中的细胞生长来选择经编码感兴趣抗体，野生型DHFR基因，和
另一种选择标志诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞
(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参阅美国专利No.4,965,199。
另一种选择标志诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞
(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参阅美国专利No.4,965,199。
[0342] 适用于酵母的选择基因为存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb et al.，Nature 282：39(1979))。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株(例如
ATCC No.44076或PEP4-1)提供了选择标志。Jones，Genetics 85：12(1977).酵母宿主细胞
基因组中存在trp1损害随之提供了用于通过在不存在色氨酸下生长来检测转化的有效环
境。类似的，用携带Leu2基因的已知质粒补足Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,
626)。
ATCC No.44076或PEP4-1)提供了选择标志。Jones，Genetics 85：12(1977).酵母宿主细胞
基因组中存在trp1损害随之提供了用于通过在不存在色氨酸下生长来检测转化的有效环
境。类似的，用携带Leu2基因的已知质粒补足Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,
626)。
[0343] 此外，衍生自1.6μm环状质粒pKD1的载体可用于转化克鲁维氏酵母属酵母。或者，报导了用于在乳酸克鲁维氏酵母中大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统。Van den
Berg，Bio/Technology 8：135(1990)。还披露了适用于通过克鲁维氏酵母属的工业菌株分
泌成熟重组人血清清蛋白的稳定多拷贝表达载体。Fleer et al.，Bio/Technology 9：968-
975(1991)。
Berg，Bio/Technology 8：135(1990)。还披露了适用于通过克鲁维氏酵母属的工业菌株分
泌成熟重组人血清清蛋白的稳定多拷贝表达载体。Fleer et al.，Bio/Technology 9：968-
975(1991)。
[0344] (d)启动子构件
[0345] 表达和克隆载体一般包含受到宿主生物体识别的启动子，而且它与编码抗体的核酸可操作连接。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子，β-内酰胺酶和乳糖启动子系统，碱性磷酸酶启动子，色氨酸(trp)启动子系统，和杂合启动子诸如tac启动子。然而，其它已
知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还会包含与编码抗体的DNA可操作连
接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还会包含与编码抗体的DNA可操作连
接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
[0346] 已知真核生物的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处找到的
另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端是AATAAA序
列，它可能是向编码序列的3′端添加聚腺苷酸尾的信号。所有这些序列合适地插入真核表
达载体。
另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端是AATAAA序
列，它可能是向编码序列的3′端添加聚腺苷酸尾的信号。所有这些序列合适地插入真核表
达载体。
[0347] 适用于酵母宿主的启动子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，诸如烯醇酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。
[0348] 作为具有通过生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2，异细胞色素C，酸性磷酸酶，与氮代谢有关的降解酶，金属硫蛋白，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动
子进一步记载于EP 73,657。酵母增强子也可以有利的与酵母启动子一起使用。
子进一步记载于EP 73,657。酵母增强子也可以有利的与酵母启动子一起使用。
[0349] 抗体在哺乳动物宿主细胞中自载体的转录可通过例如从病毒诸如多瘤病毒，禽痘病毒，腺病毒(诸如腺病毒2)，牛乳头瘤病毒，禽类肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录病毒，乙肝病毒，猿猴病毒40(SV40)基因组，或从异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球
蛋白启动子，及从热休克启动子获得的启动子来控制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相
容的话。
蛋白启动子，及从热休克启动子获得的启动子来控制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相
容的话。
[0350] 方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早
期启动子。美国专利No.4,419,446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中
表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中记载了该系统的一种改良。关于在小鼠细胞中在
来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参见Reyes et
al.，Nature 297：598-601(1982)。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动
子。
期启动子。美国专利No.4,419,446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中
表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中记载了该系统的一种改良。关于在小鼠细胞中在
来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参见Reyes et
al.，Nature 297：598-601(1982)。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动
子。
[0351] (e)增强子元件构件
[0352] 常常通过将增强子序列插入载体来提高高等真核细胞对编码本发明抗体的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(珠蛋白，弹性蛋白酶，清蛋白，甲胎蛋白和胰岛素)的许
多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一
侧的增强子(bp 100-270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，多瘤病毒复制起点晚期一侧的
增强子，和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv，Nature297：17-
18(1982)。可以将增强子剪接到载体中，位于抗体编码序列的5′或3′位置，但是优选位于启动子的5′位点。
多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一
侧的增强子(bp 100-270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，多瘤病毒复制起点晚期一侧的
增强子，和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv，Nature297：17-
18(1982)。可以将增强子剪接到载体中，位于抗体编码序列的5′或3′位置，但是优选位于启动子的5′位点。
[0353] (f)转录终止构件
[0354] 用于真核宿主细胞(酵母，真菌，昆虫，植物，动物，人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从
真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端和偶尔的3′端获得。这些区域包含在编码抗体的
mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛
生长激素聚腺苷酸化区。参见WO 94/11026及其中披露的表达载体。
真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端和偶尔的3′端获得。这些区域包含在编码抗体的
mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛
生长激素聚腺苷酸化区。参见WO 94/11026及其中披露的表达载体。
[0355] (g)宿主细胞的选择和转化
[0356] 适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是上文描述的原核生物，酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例
如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(E.coli)，肠杆
菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形菌属
(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，沙
雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，志贺氏菌属(Shigella)，
以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌
(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)，
假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，和链霉菌属
(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，尽管其它菌
株诸如大肠杆菌B，大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合
适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。
如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(E.coli)，肠杆
菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形菌属
(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，沙
雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，志贺氏菌属(Shigella)，
以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌
(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)，
假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，和链霉菌属
(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，尽管其它菌
株诸如大肠杆菌B，大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合
适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。
[0357] 可以在细菌中生产全长抗体，抗体融合蛋白，和抗体片段，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时，诸如在将治疗性抗体缀合至自身在肿瘤细胞破坏方面显示出效力的细
胞毒剂(例如毒素)时。全长抗体在循环中具有较长的半衰期。大肠杆菌中的生成是较快的
且较合算的。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如美国专利No.5,648,237(Carter
et.al.)，美国专利No.5,789,199(Joly et al.)，美国专利No.5,840,523(Simmons et
al.)，其描述了使表达和分泌优化的翻译起始区(TIR)和信号序列。还可参见Charlton，
Methods in Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，编，Humana Press，Totowa，N.J.，
2003)，pp.245-254，其描述了在大肠杆菌中表达抗体片段。表达后，可以在可溶性级分中自大肠杆菌细胞浆液分离抗体，并可以通过例如蛋白A或G柱(取决于同种型)来纯化抗体。可
以实施最终的纯化，其类似于用于纯化在例如CHO细胞中表达的抗体的工艺。
胞毒剂(例如毒素)时。全长抗体在循环中具有较长的半衰期。大肠杆菌中的生成是较快的
且较合算的。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如美国专利No.5,648,237(Carter
et.al.)，美国专利No.5,789,199(Joly et al.)，美国专利No.5,840,523(Simmons et
al.)，其描述了使表达和分泌优化的翻译起始区(TIR)和信号序列。还可参见Charlton，
Methods in Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，编，Humana Press，Totowa，N.J.，
2003)，pp.245-254，其描述了在大肠杆菌中表达抗体片段。表达后，可以在可溶性级分中自大肠杆菌细胞浆液分离抗体，并可以通过例如蛋白A或G柱(取决于同种型)来纯化抗体。可
以实施最终的纯化，其类似于用于纯化在例如CHO细胞中表达的抗体的工艺。
[0358] 在原核生物以外，真核微生物(诸如丝状真菌或酵母)也是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。啤酒糖酵母或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的面包酵母
在最常用的低等真核宿主微生物之中。然而，通常可获得许多其它属，种和菌株且可用于本
发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属
(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)，脆壁克鲁维酵母
(K.fragilis)(ATCC 12,424),保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)，威克
克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)，K.waltii(ATCC 56,500)，果蝇克鲁维酵母
(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)，耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维
酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia
pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP
244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如
Schwanniomyces occidentalis；和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(Neurospora)，青霉属
(Penicillium)，弯颈霉属(Tolypocladium)，和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉
(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。关于讨论酵母和丝状真菌用于生产治疗性蛋白质的用
途的综述参见例如Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)。
在最常用的低等真核宿主微生物之中。然而，通常可获得许多其它属，种和菌株且可用于本
发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属
(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)，脆壁克鲁维酵母
(K.fragilis)(ATCC 12,424),保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)，威克
克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)，K.waltii(ATCC 56,500)，果蝇克鲁维酵母
(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)，耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维
酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia
pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP
244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如
Schwanniomyces occidentalis；和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(Neurospora)，青霉属
(Penicillium)，弯颈霉属(Tolypocladium)，和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉
(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。关于讨论酵母和丝状真菌用于生产治疗性蛋白质的用
途的综述参见例如Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)。
[0359] 可选择如下的某些真菌和酵母株，其中糖基化途径已经“人源化”，导致具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的生成。参见例如Li et al.，Nat.Biotech.24：210-215
(2006)(记载了巴斯德毕赤氏酵母中糖基化途径的人源化)；及Gerngross et al.，见上文。
(2006)(记载了巴斯德毕赤氏酵母中糖基化途径的人源化)；及Gerngross et al.，见上文。
[0360] 适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相
应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)，埃及伊
蚊(Aedes aegypti)(蚊子)，白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)，黑腹果蝇(Drosophila
melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例
如苜蓿尺蠖Autographa californica NPV的L-1变体和家蚕Bombyx mori NPV的Bm-5株，而
且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。
应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)，埃及伊
蚊(Aedes aegypti)(蚊子)，白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)，黑腹果蝇(Drosophila
melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例
如苜蓿尺蠖Autographa californica NPV的L-1变体和家蚕Bombyx mori NPV的Bm-5株，而
且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。
[0361] 还可利用棉，玉米，马铃薯，大豆，矮牵牛，番茄，浮萍(Leninaceae)，苜蓿(M.truncatula)，和烟草的植物细胞培养物作为宿主。参见例如美国专利No.5,959,177；
No.6,040,498；No.6,420,548；No.7,125,978；和No.6,417,429(描述用于在转基因植物中
生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
No.6,040,498；No.6,420,548；No.7,125,978；和No.6,417,429(描述用于在转基因植物中
生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
[0362] 可使用脊椎动物细胞作为宿主，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规规程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC
CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham et al.，
J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠塞托利(sertoli)细
胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞
(Mather et al.，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO
细胞(Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，诸如
NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参阅例如Yazaki and
Wu，Methods in Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，编，Humana Press，Totowa，N.J.，
2003)，pp.255-268。
CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham et al.，
J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠塞托利(sertoli)细
胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞
(Mather et al.，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO
细胞(Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，诸如
NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参阅例如Yazaki and
Wu，Methods in Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，编，Humana Press，Totowa，N.J.，
2003)，pp.255-268。
[0363] 用上文所述用于生产抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子，选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。
[0364] (h)培养宿主细胞
[0365] 可以在多种培养基中培养用于生产本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)，极限必需培养基(MEM，Sigma)，RPMI-1640(Sigma)，和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培
养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes et al.，
Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利No.4,767,704；No.4,657,866；No.4,927,762；
No.4,560,655；或No.5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素，运铁蛋白或表皮生长
因子)，盐(诸如氯化钠，钙，镁和磷酸盐)，缓冲剂(诸如HEPES)，核苷酸(诸如腺苷和胸苷)，抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)，痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机
化合物)，和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必
需补充物。培养条件(诸如温度，pH等)就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通
技术人员而言是显而易见的。
养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes et al.，
Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利No.4,767,704；No.4,657,866；No.4,927,762；
No.4,560,655；或No.5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素，运铁蛋白或表皮生长
因子)，盐(诸如氯化钠，钙，镁和磷酸盐)，缓冲剂(诸如HEPES)，核苷酸(诸如腺苷和胸苷)，抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)，痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机
化合物)，和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必
需补充物。培养条件(诸如温度，pH等)就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通
技术人员而言是显而易见的。
[0366] (xi)抗体的纯化
[0367] 在使用重组技术时，可以在细胞内，在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤除去宿主细胞或裂解
片段的微粒碎片。Carter et al.，Bio/Technology10：163-167(1992)记载了用于分离分泌
到大肠杆菌周质空间的抗体的规程。简单的说，在存在乙酸钠(pH 3.5)，EDTA和苯甲基磺酰
氟(PMSF)时使细胞糊融化约30分钟。可通过离心除去细胞碎片。如果将抗体分泌到培养基
中，那么一般首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单
元浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF
来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。
片段的微粒碎片。Carter et al.，Bio/Technology10：163-167(1992)记载了用于分离分泌
到大肠杆菌周质空间的抗体的规程。简单的说，在存在乙酸钠(pH 3.5)，EDTA和苯甲基磺酰
氟(PMSF)时使细胞糊融化约30分钟。可通过离心除去细胞碎片。如果将抗体分泌到培养基
中，那么一般首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单
元浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF
来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。
[0368] 可以使用例如羟磷灰石层析，疏水相互作用层析，凝胶电泳，透析和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，其中亲和层析通常是优选的纯化步骤之一。蛋白A作为亲和配
体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc域的物种和同种型。蛋白A可用于纯化
基于人γ1，γ2或γ4重链的抗体(Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al.，EMBO J.5：1567-1575(1986))。亲和配
体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。机械稳定的基质诸如可控孔
径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖所能实现更快的流速和更短的加工时间。
若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级，乙
醇沉淀，反相HPLC，硅土上的层析，肝素SEPHAROSETM上的层析，阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析，层析聚焦，SDS-PAGE，和硫酸铵沉淀。
体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc域的物种和同种型。蛋白A可用于纯化
基于人γ1，γ2或γ4重链的抗体(Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al.，EMBO J.5：1567-1575(1986))。亲和配
体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。机械稳定的基质诸如可控孔
径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖所能实现更快的流速和更短的加工时间。
若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级，乙
醇沉淀，反相HPLC，硅土上的层析，肝素SEPHAROSETM上的层析，阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析，层析聚焦，SDS-PAGE，和硫酸铵沉淀。
[0369] 一般而言，用于制备供研究，测试，和临床中使用的抗体的各种方法学是本领域完善建立的，与上文所述方法学一致，和/或是本领域技术人员认为适合于特定的感兴趣抗体
的。
的。
[0370] C.选择生物学活性抗体
[0371] 可对如上所述生成的抗体进行一种或多种“生物学活性”测定法以选择从治疗观点看具有有益特性的抗体或选择保留抗体的生物学活性的配制剂和条件。可对抗体测试其
结合生成它时所针对的抗原的能力。例如，对于抗PDL1抗体，可在检测结合PDL1的能力的测
定法中评估抗体的抗原结合特性。在一些实施方案中，可通过例如饱和结合；ELISA；和/或
竞争测定法(例如RIA)来测定抗体的结合。还有，可对抗体进行其它生物学活性测定法，例
如为了评估它作为治疗剂的有效性。此类测定法是本领域已知的且依赖于靶抗原和抗体的
预定用途。例如，可以在CD8+T细胞，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)小鼠模型和/或同
基因肿瘤模型中评估抗体对PD-L1的阻断的生物学效应，例如如美国专利No.8,217,149中
记载的。
结合生成它时所针对的抗原的能力。例如，对于抗PDL1抗体，可在检测结合PDL1的能力的测
定法中评估抗体的抗原结合特性。在一些实施方案中，可通过例如饱和结合；ELISA；和/或
竞争测定法(例如RIA)来测定抗体的结合。还有，可对抗体进行其它生物学活性测定法，例
如为了评估它作为治疗剂的有效性。此类测定法是本领域已知的且依赖于靶抗原和抗体的
预定用途。例如，可以在CD8+T细胞，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)小鼠模型和/或同
基因肿瘤模型中评估抗体对PD-L1的阻断的生物学效应，例如如美国专利No.8,217,149中
记载的。
[0372] 为了筛选结合感兴趣抗原上的特定表位的抗体(例如那些阻断例如抗PDL1抗体结合PD-L1的)，可实施常规交叉阻断测定法，诸如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold
Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow and David Lane(1988)中记载的。或者，可以例如
如Champe et al.，J.Biol.Chem.270：1388-1394(1995)所述实施表位作图来测定抗体是否
结合感兴趣表位。
Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow and David Lane(1988)中记载的。或者，可以例如
如Champe et al.，J.Biol.Chem.270：1388-1394(1995)所述实施表位作图来测定抗体是否
结合感兴趣表位。
[0373] D.配制剂的制备
[0374] 在制备感兴趣抗体之后(例如，用于生产可如本文所述配制的抗体的技术会在下文中详述且是本领域已知的)，制备包含它的药物配制剂。在某些实施方案中，要配制的抗
体未进行在先冻干，而且本文中的感兴趣配制剂是含水配制剂。在某些实施方案中，抗体为
全长抗体。在一个实施方案中，配制剂中的抗体为抗体片段，诸如F(ab′)2，在该情况中可能需要解决全长抗体可能不会发生的问题(诸如将抗体修剪成Fab)。考虑例如期望剂量体积
和施用模式来决定配制剂中存在的抗体的治疗有效量。约25mg/mL至约150mg/mL，或约
30mg/mL至约140mg/mL，或约35mg/mL至约130mg/mL，或约40mg/mL至约120mg/mL，或约50mg/
mL至约130mg/mL，或约50mg/mL至约125mg/mL，或约50mg/mL至约120mg/mL，或约50mg/mL至
约110mg/mL，或约50mg/mL至约100mg/mL，或约50mg/mL至约90mg/mL，或约50mg/mL至约
80mg/mL，或约54mg/mL至约66mg/mL是配制剂中的例示性抗体浓度。
体未进行在先冻干，而且本文中的感兴趣配制剂是含水配制剂。在某些实施方案中，抗体为
全长抗体。在一个实施方案中，配制剂中的抗体为抗体片段，诸如F(ab′)2，在该情况中可能需要解决全长抗体可能不会发生的问题(诸如将抗体修剪成Fab)。考虑例如期望剂量体积
和施用模式来决定配制剂中存在的抗体的治疗有效量。约25mg/mL至约150mg/mL，或约
30mg/mL至约140mg/mL，或约35mg/mL至约130mg/mL，或约40mg/mL至约120mg/mL，或约50mg/
mL至约130mg/mL，或约50mg/mL至约125mg/mL，或约50mg/mL至约120mg/mL，或约50mg/mL至
约110mg/mL，或约50mg/mL至约100mg/mL，或约50mg/mL至约90mg/mL，或约50mg/mL至约
80mg/mL，或约54mg/mL至约66mg/mL是配制剂中的例示性抗体浓度。
[0375] 制备在pH缓冲溶液中包含抗体的含水配制剂。本发明的缓冲剂具有在约5.0至约7.0的范围中的pH。在某些实施方案中，pH在约5.0至约6.5的范围中，pH在约5.0至约6.4的
范围中，pH在约5.0至约6.3的范围中，pH在约5.0至约6.2的范围中，pH在约5.0至约6.1的范
围中，pH在约5.5至约6.1的范围中，pH在约5.0至约6.0的范围中，pH在约5.0至约5.9的范围
中，pH在约5.0至约5.8的范围中，pH在约5.1至约6.0的范围中，pH在约5.2至约6.0的范围
中，pH在约5.3至约6.0的范围中，pH在约5.4至约6.0的范围中，pH在约5.5至约6.0的范围
中，pH在约5.6至约6.0的范围中，pH在约5.7至约6.0的范围中，或pH在约5.8至约6.0的范围
中。在本发明的某些实施方案中，配制剂具有6.0或约6.0的pH。在本发明的某些实施方案
中，配制剂具有5.9或约5.9的pH。在本发明的某些实施方案中，配制剂具有5.8或约5.8的
pH。在本发明的某些实施方案中，配制剂具有5.7或约5.7的pH。在本发明的某些实施方案
中，配制剂具有5.6或约5.6的pH。在本发明的某些实施方案中，配制剂具有5.5或约5.5的
pH。在本发明的某些实施方案中，配制剂具有5.4或约5.4的pH。在本发明的某些实施方案
中，配制剂具有5.3或约5.3的pH。在本发明的某些实施方案中，配制剂具有5.2或约5.2的
pH。会控制pH在此范围内的缓冲剂的例子包括组氨酸(诸如L-组氨酸)或乙酸钠。在某些实
施方案中，缓冲剂含有浓度为约15mM至约25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠。在本发明的某些
实施方案中，缓冲剂含有浓度为约15mM至约25mM，约16mM至约25mM，约17mM至约25mM，约
18mM至约25mM，约19mM至约25mM，约20mM至约25mM，约21mM至约25mM，约22mM至约25mM，约
15mM，约16mM，约17mM，约18mM，约19mM，约20mM，约21mM，约22mM，约23mM，约24mM，或约25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约20mM的组氨酸乙酸酯或乙
酸钠，pH 5.0。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约20mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.1。
在一个实施方案中，缓冲剂为量为约20mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.2。在一个实施方
案中，缓冲剂为量为约20mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.3。在一个实施方案中，缓冲剂
为量为约20mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.4。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约20mM
的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.5。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约20mM的组氨酸乙酸
酯或乙酸钠，pH 5.6。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约20mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，
pH 5.7。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约20mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.8。在一
个实施方案中，缓冲剂为量为约20mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.9。在一个实施方案
中，缓冲剂为量为约20mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 6.0。在一个实施方案中，缓冲剂为
量为约20mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH6.1。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约20mM的
组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 6.2。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约20mM的组氨酸乙酸酯
或乙酸钠，pH 6.3。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH
5.2。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.3。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.4。在一个实施方案中，缓
冲剂为量为约25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.5。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约
25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.6。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约25mM的组氨酸
乙酸酯或乙酸钠，pH 5.7。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸
钠，pH 5.8。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.9。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 6.0。在一个实施方案
中，缓冲剂为量为约25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 6.1。在一个实施方案中，缓冲剂为
量为约25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 6.2。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约25mM的
组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 6.3。
范围中，pH在约5.0至约6.3的范围中，pH在约5.0至约6.2的范围中，pH在约5.0至约6.1的范
围中，pH在约5.5至约6.1的范围中，pH在约5.0至约6.0的范围中，pH在约5.0至约5.9的范围
中，pH在约5.0至约5.8的范围中，pH在约5.1至约6.0的范围中，pH在约5.2至约6.0的范围
中，pH在约5.3至约6.0的范围中，pH在约5.4至约6.0的范围中，pH在约5.5至约6.0的范围
中，pH在约5.6至约6.0的范围中，pH在约5.7至约6.0的范围中，或pH在约5.8至约6.0的范围
中。在本发明的某些实施方案中，配制剂具有6.0或约6.0的pH。在本发明的某些实施方案
中，配制剂具有5.9或约5.9的pH。在本发明的某些实施方案中，配制剂具有5.8或约5.8的
pH。在本发明的某些实施方案中，配制剂具有5.7或约5.7的pH。在本发明的某些实施方案
中，配制剂具有5.6或约5.6的pH。在本发明的某些实施方案中，配制剂具有5.5或约5.5的
pH。在本发明的某些实施方案中，配制剂具有5.4或约5.4的pH。在本发明的某些实施方案
中，配制剂具有5.3或约5.3的pH。在本发明的某些实施方案中，配制剂具有5.2或约5.2的
pH。会控制pH在此范围内的缓冲剂的例子包括组氨酸(诸如L-组氨酸)或乙酸钠。在某些实
施方案中，缓冲剂含有浓度为约15mM至约25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠。在本发明的某些
实施方案中，缓冲剂含有浓度为约15mM至约25mM，约16mM至约25mM，约17mM至约25mM，约
18mM至约25mM，约19mM至约25mM，约20mM至约25mM，约21mM至约25mM，约22mM至约25mM，约
15mM，约16mM，约17mM，约18mM，约19mM，约20mM，约21mM，约22mM，约23mM，约24mM，或约25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约20mM的组氨酸乙酸酯或乙
酸钠，pH 5.0。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约20mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.1。
在一个实施方案中，缓冲剂为量为约20mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.2。在一个实施方
案中，缓冲剂为量为约20mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.3。在一个实施方案中，缓冲剂
为量为约20mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.4。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约20mM
的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.5。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约20mM的组氨酸乙酸
酯或乙酸钠，pH 5.6。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约20mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，
pH 5.7。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约20mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.8。在一
个实施方案中，缓冲剂为量为约20mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.9。在一个实施方案
中，缓冲剂为量为约20mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 6.0。在一个实施方案中，缓冲剂为
量为约20mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH6.1。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约20mM的
组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 6.2。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约20mM的组氨酸乙酸酯
或乙酸钠，pH 6.3。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH
5.2。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.3。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.4。在一个实施方案中，缓
冲剂为量为约25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.5。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约
25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.6。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约25mM的组氨酸
乙酸酯或乙酸钠，pH 5.7。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸
钠，pH 5.8。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 5.9。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 6.0。在一个实施方案
中，缓冲剂为量为约25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 6.1。在一个实施方案中，缓冲剂为
量为约25mM的组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 6.2。在一个实施方案中，缓冲剂为量为约25mM的
组氨酸乙酸酯或乙酸钠，pH 6.3。
[0376] 配制剂进一步包含量为约60mM至约240mM的蔗糖。在一些实施方案中，配制剂中的蔗糖为约60mM至约230mM，约60mM至约220mM，约60mM至约210mM，约60mM至约200mM，约60mM
至约190mM，约60mM至约180mM，约60mM至约170mM，约60mM至约160mM，约60mM至约150mM，约
60mM至约140mM，约80mM至约240mM，约90mM至约240mM，约100mM至约240mM，约110mM至约
240mM，约120mM至约240mM，约130mM至约240mM，约140mM至约240mM，约150mM至约240mM，约
160mM至约240mM，约170mM至约240mM，约180mM至约240mM，约190mM至约240mM，约200mM至约
240mM，约80mM至约160mM，约100mM至约140mM，或约110mM至约130mM。在一些实施方案中，配制剂中的蔗糖为约60mM，约70mM，约80mM，约90mM，约100mM，约110mM，约120mM，约130mM，约
140mM，约150mM，约160mM，约170mM，约180mM，约190mM，约200mM，约210mM，约220mM，约
230mM，或约240mM。
至约190mM，约60mM至约180mM，约60mM至约170mM，约60mM至约160mM，约60mM至约150mM，约
60mM至约140mM，约80mM至约240mM，约90mM至约240mM，约100mM至约240mM，约110mM至约
240mM，约120mM至约240mM，约130mM至约240mM，约140mM至约240mM，约150mM至约240mM，约
160mM至约240mM，约170mM至约240mM，约180mM至约240mM，约190mM至约240mM，约200mM至约
240mM，约80mM至约160mM，约100mM至约140mM，或约110mM至约130mM。在一些实施方案中，配制剂中的蔗糖为约60mM，约70mM，约80mM，约90mM，约100mM，约110mM，约120mM，约130mM，约
140mM，约150mM，约160mM，约170mM，约180mM，约190mM，约200mM，约210mM，约220mM，约
230mM，或约240mM。
[0377] 在一些实施方案中，配制剂中的抗体浓度为约40mg/ml至约125mg/ml。在一些实施方案中，配制剂中的抗体浓度为约40mg/ml至约120mg/ml，约40mg/ml至约110mg/ml，约
40mg/ml至约100mg/ml，约40mg/ml至约90mg/ml，约40mg/ml至约80mg/ml，约40mg/ml至约
70mg/ml，约50mg/ml至约120mg/ml，约60mg/ml至约120mg/ml，约70mg/ml至约120mg/ml，约
80mg/ml至约120mg/ml，约90mg/ml至约120mg/ml，或约100mg/ml至约120mg/ml。在一些实施
方案中，配制剂中的抗体浓度为约60mg/ml。在一些实施方案中，配制剂中的抗体浓度为约
65mg/ml。在一些实施方案中，配制剂中的抗体浓度为约70mg/ml。在一些实施方案中，配制
剂中的抗体浓度为约75mg/ml。在一些实施方案中，配制剂中的抗体浓度为约80mg/ml。在一
些实施方案中，配制剂中的抗体浓度为约85mg/ml。在一些实施方案中，配制剂中的抗体浓
度为约90mg/ml。在一些实施方案中，配制剂中的抗体浓度为约95mg/ml。在一些实施方案
中，配制剂中的抗体浓度为约100mg/ml。在一些实施方案中，配制剂中的抗体浓度为约
110mg/ml。在一些实施方案中，配制剂中的抗体浓度为约125mg/ml。
40mg/ml至约100mg/ml，约40mg/ml至约90mg/ml，约40mg/ml至约80mg/ml，约40mg/ml至约
70mg/ml，约50mg/ml至约120mg/ml，约60mg/ml至约120mg/ml，约70mg/ml至约120mg/ml，约
80mg/ml至约120mg/ml，约90mg/ml至约120mg/ml，或约100mg/ml至约120mg/ml。在一些实施
方案中，配制剂中的抗体浓度为约60mg/ml。在一些实施方案中，配制剂中的抗体浓度为约
65mg/ml。在一些实施方案中，配制剂中的抗体浓度为约70mg/ml。在一些实施方案中，配制
剂中的抗体浓度为约75mg/ml。在一些实施方案中，配制剂中的抗体浓度为约80mg/ml。在一
些实施方案中，配制剂中的抗体浓度为约85mg/ml。在一些实施方案中，配制剂中的抗体浓
度为约90mg/ml。在一些实施方案中，配制剂中的抗体浓度为约95mg/ml。在一些实施方案
中，配制剂中的抗体浓度为约100mg/ml。在一些实施方案中，配制剂中的抗体浓度为约
110mg/ml。在一些实施方案中，配制剂中的抗体浓度为约125mg/ml。
[0378] 在一些实施方案中，将表面活性剂添加至抗体配制剂。例示性表面活性剂包括非离子型表面活性剂，诸如聚山梨酯(例如聚山梨酯20，80等)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188
等)。所添加的表面活性剂的量使得它降低所配制的抗体的聚集和/或使配制剂中的颗粒形
成降至最低和/或降低吸附。例如，配制剂中存在的表面活性剂的量可以为约0.001％至约
0.5％(w/v)。在一些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)为约0.005％至约0.2％，约
0.005％至约0.1％，约0.005％至约0.09％，约0.005％至约0.08％，约0.005％至约0.07％，约0.005％至约0.06％，约0.005％至约0.05％，约0.005％至约0.04％，约0.008％至约
0.06％，约0.01％至约0.06％，约0.02％至约0.06％，约0.01％至约0.05％，或约0.02％至
约0.04％。在某些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.005％或约
0.005％的量存在。在某些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以
0.006％或约0.006％的量存在。在某些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制
剂中以0.007％或约0.007％的量存在。在某些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)
在配制剂中以0.008％或约0.008％的量存在。在某些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨
酯20)在配制剂中以0.009％或约0.009％的量存在。在某些实施方案中，表面活性剂(例如
聚山梨酯20)在配制剂中以0.01％或约0.01％的量存在。在某些实施方案中，表面活性剂
(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.02％或约0.02％的量存在。在某些实施方案中，表面活
性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.03％或约0.03％的量存在。在某些实施方案中，表
面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.04％或约0.04％的量存在。在某些实施方案
中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.05％或约0.05％的量存在。在某些实施
方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.06％或约0.06％的量存在。在某些
实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.07％或约0.07％的量存在。在
某些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.08％或约0.08％的量存
在。在某些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.1％或约0.1％的量
存在。在某些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.2％或约0.2％的
量存在。在某些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.3％或约0.3％
的量存在。在某些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.4％或约
0.4％的量存在。在某些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.5％或
约0.5％的量存在。
等)。所添加的表面活性剂的量使得它降低所配制的抗体的聚集和/或使配制剂中的颗粒形
成降至最低和/或降低吸附。例如，配制剂中存在的表面活性剂的量可以为约0.001％至约
0.5％(w/v)。在一些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)为约0.005％至约0.2％，约
0.005％至约0.1％，约0.005％至约0.09％，约0.005％至约0.08％，约0.005％至约0.07％，约0.005％至约0.06％，约0.005％至约0.05％，约0.005％至约0.04％，约0.008％至约
0.06％，约0.01％至约0.06％，约0.02％至约0.06％，约0.01％至约0.05％，或约0.02％至
约0.04％。在某些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.005％或约
0.005％的量存在。在某些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以
0.006％或约0.006％的量存在。在某些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制
剂中以0.007％或约0.007％的量存在。在某些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)
在配制剂中以0.008％或约0.008％的量存在。在某些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨
酯20)在配制剂中以0.009％或约0.009％的量存在。在某些实施方案中，表面活性剂(例如
聚山梨酯20)在配制剂中以0.01％或约0.01％的量存在。在某些实施方案中，表面活性剂
(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.02％或约0.02％的量存在。在某些实施方案中，表面活
性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.03％或约0.03％的量存在。在某些实施方案中，表
面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.04％或约0.04％的量存在。在某些实施方案
中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.05％或约0.05％的量存在。在某些实施
方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.06％或约0.06％的量存在。在某些
实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.07％或约0.07％的量存在。在
某些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.08％或约0.08％的量存
在。在某些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.1％或约0.1％的量
存在。在某些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.2％或约0.2％的
量存在。在某些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.3％或约0.3％
的量存在。在某些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.4％或约
0.4％的量存在。在某些实施方案中，表面活性剂(例如聚山梨酯20)在配制剂中以0.5％或
约0.5％的量存在。
[0379] 在一个实施方案中，配制剂含有上文鉴定的药剂(例如抗体，缓冲剂，蔗糖，和/或表面活性剂)且基本上没有一种或多种防腐剂，诸如苯甲醇，酚，间甲酚，氯丁醇和苄索氯
铵。在另一个实施方案中，配制剂中可包括防腐剂，特别是配制剂为多剂配制剂的情况。防
腐剂的浓度可以在约0.1％至约2％，优选约0.5％至约1％的范围中。配制剂中可包括一种
或多种其它药学可接受载剂，赋形剂或稳定剂，诸如那些在Remington′s Pharmaceutical
Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)中记载的，只要它们对配制剂的期望特征没有
不利影响。可接受载剂，赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包
括别的缓冲剂；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂，诸如EDTA；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；生物可降解聚合物，诸如聚酯；和/或成盐反荷离子。本文中的
例示性药学可接受载剂进一步包括间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋
白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20( Baxter
International，Inc.)。某些例示性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)记载于美国专利公
开文本No.2005/0260186和No.2006/0104968。在一个方面，sHASEGP与一种或多种别的糖胺
聚糖酶诸如软骨素酶组合。
铵。在另一个实施方案中，配制剂中可包括防腐剂，特别是配制剂为多剂配制剂的情况。防
腐剂的浓度可以在约0.1％至约2％，优选约0.5％至约1％的范围中。配制剂中可包括一种
或多种其它药学可接受载剂，赋形剂或稳定剂，诸如那些在Remington′s Pharmaceutical
Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)中记载的，只要它们对配制剂的期望特征没有
不利影响。可接受载剂，赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包
括别的缓冲剂；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂，诸如EDTA；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；生物可降解聚合物，诸如聚酯；和/或成盐反荷离子。本文中的
例示性药学可接受载剂进一步包括间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋
白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20( Baxter
International，Inc.)。某些例示性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)记载于美国专利公
开文本No.2005/0260186和No.2006/0104968。在一个方面，sHASEGP与一种或多种别的糖胺
聚糖酶诸如软骨素酶组合。
[0380] 本文中的配制剂还可含有超过一种对所治疗的特定适应证必需的蛋白质，优选那些具有互补活性的，对其它蛋白质没有不利影响的。例如，在抗体是抗PDL1的情况中，可将
它与另一种药剂(例如化疗剂和抗肿瘤剂)组合。
它与另一种药剂(例如化疗剂和抗肿瘤剂)组合。
[0381] 在一些实施方案中，评估或测量配制剂中的抗体的物理稳定性，化学稳定性，或生物学活性。可使用本领域已知的和本文实施例中描述的任何方法来评估配制剂中的抗体的
稳定性和生物学活性。例如，配制剂中的抗体的稳定性可以通过但不限于大小排阻层析
(SEC或SE-HPLC)，成像毛细管等电聚焦(ICIEF)，作肽图，小体积掩光(HIAC)测定法，和毛细管电泳(CE)技术诸如CE-十二烷基硫酸钠(CE-SDS)和CE-聚糖分析来测量。在一些实施方案
中，配制剂中的抗体于-20℃稳定至少约6个月，至少约8个月，至少约10个月，至少约12个
月，至少约14个月，至少约16个月，至少约18个月，至少约20个月，至少约21个月，至少约22个月，至少约23个月，至少约24个月，至少约3年，或至少约4年。在一些实施方案中，配制剂中的抗体于2℃至8℃(例如5℃)稳定至少约6个月，至少约8个月，至少约10个月，至少约12
个月，至少约14个月，至少约16个月，至少约18个月，至少约20个月，至少约21个月，至少约
22个月，至少约23个月，或至少约24个月。在一些实施方案中，抗体(即抗体单体)的稳定性
是在贮存后在配制剂中通过大小排阻层析测量的。在一些实施方案中，抗体(即抗体单体)
的稳定性是在贮存后在配制剂中通过成像毛细管等电聚焦测量的。在一些实施方案中，在
于-20℃贮存至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月，或至少约24个月后，配制剂中抗
体单体与总蛋白质(例如包括抗体和聚集体)相比的百分比大于约60％，约65％，约70％，约
75％，约80％，约85％，约86％，约87％，约88％，约89％，约90％，约91％，约92％，约93％，约
94％或约95％。在一些实施方案中，在于2℃至8℃(例如5℃)贮存至少约6个月，至少约12个
月，至少约18个月，或至少约24个月后，配制剂中抗体单体与总蛋白质(例如包括抗体和聚
集体)相比的百分比大于约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约86％，约87％，约88％，约89％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％或约95％。在一些实施方案中，在于室温(例如约15℃至25℃)摇动至少约2小时，至少约4小时，至少约6小时，至少约8小时，
至少约10小时，至少约12小时，至少约14小时，至少约16小时，至少约18小时，至少约20小
时，或至少约24小时后，配制剂中抗体单体与总蛋白质(例如包括抗体和聚集体)相比的百
分比大于约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约86％，约87％，约88％，约
89％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％或约95％。在一些实施方案中，在于-20℃贮存至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月，或至少约24个月后，配制剂中总聚集体(例
如高分子量种类和低分子量种类)的百分比少于约0.1％，约0.2％，约0.3％，约0.4％，约
0.5％，约0.6％，约0.7％，约0.8％，约0.9％，约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约
7％，约8％，约9％，或约10％任一。在一些实施方案中，在于2℃至8℃(例如5℃)贮存至少约
6个月，至少约12个月，至少约18个月，或至少约24个月后，配制剂中总聚集体(例如高分子
量种类和低分子量种类)的百分比小于约0.1％，约0.2％，约0.3％，约0.4％，约0.5％，约
0.6％，约0.7％，约0.8％，约0.9％，约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约
8％，约9％，或约10％任一。在一些实施方案中，在于室温(例如约15℃至25℃)摇动至少约2小时，至少约4小时，至少约6小时，至少约8小时，至少约10小时，至少约12小时，至少约14小时，至少约16小时，至少约18小时，至少约20小时，或至少约24小时后，配制剂中总聚集体
(例如高分子量种类和低分子量种类)的百分比小于约0.1％，约0.2％，约0.3％，约0.4％，
约0.5％，约0.6％，约0.7％，约0.8％，约0.9％，约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，或约10％任一。在本文中的任何实施方案中，稳定的配制剂可以贮存在玻璃管形瓶，金属合金容器，或静脉内(IV)袋中。在一些实施方案中，金属合金为316L不
锈钢或哈斯特镍合金。
稳定性和生物学活性。例如，配制剂中的抗体的稳定性可以通过但不限于大小排阻层析
(SEC或SE-HPLC)，成像毛细管等电聚焦(ICIEF)，作肽图，小体积掩光(HIAC)测定法，和毛细管电泳(CE)技术诸如CE-十二烷基硫酸钠(CE-SDS)和CE-聚糖分析来测量。在一些实施方案
中，配制剂中的抗体于-20℃稳定至少约6个月，至少约8个月，至少约10个月，至少约12个
月，至少约14个月，至少约16个月，至少约18个月，至少约20个月，至少约21个月，至少约22个月，至少约23个月，至少约24个月，至少约3年，或至少约4年。在一些实施方案中，配制剂中的抗体于2℃至8℃(例如5℃)稳定至少约6个月，至少约8个月，至少约10个月，至少约12
个月，至少约14个月，至少约16个月，至少约18个月，至少约20个月，至少约21个月，至少约
22个月，至少约23个月，或至少约24个月。在一些实施方案中，抗体(即抗体单体)的稳定性
是在贮存后在配制剂中通过大小排阻层析测量的。在一些实施方案中，抗体(即抗体单体)
的稳定性是在贮存后在配制剂中通过成像毛细管等电聚焦测量的。在一些实施方案中，在
于-20℃贮存至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月，或至少约24个月后，配制剂中抗
体单体与总蛋白质(例如包括抗体和聚集体)相比的百分比大于约60％，约65％，约70％，约
75％，约80％，约85％，约86％，约87％，约88％，约89％，约90％，约91％，约92％，约93％，约
94％或约95％。在一些实施方案中，在于2℃至8℃(例如5℃)贮存至少约6个月，至少约12个
月，至少约18个月，或至少约24个月后，配制剂中抗体单体与总蛋白质(例如包括抗体和聚
集体)相比的百分比大于约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约86％，约87％，约88％，约89％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％或约95％。在一些实施方案中，在于室温(例如约15℃至25℃)摇动至少约2小时，至少约4小时，至少约6小时，至少约8小时，
至少约10小时，至少约12小时，至少约14小时，至少约16小时，至少约18小时，至少约20小
时，或至少约24小时后，配制剂中抗体单体与总蛋白质(例如包括抗体和聚集体)相比的百
分比大于约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约86％，约87％，约88％，约
89％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％或约95％。在一些实施方案中，在于-20℃贮存至少约6个月，至少约12个月，至少约18个月，或至少约24个月后，配制剂中总聚集体(例
如高分子量种类和低分子量种类)的百分比少于约0.1％，约0.2％，约0.3％，约0.4％，约
0.5％，约0.6％，约0.7％，约0.8％，约0.9％，约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约
7％，约8％，约9％，或约10％任一。在一些实施方案中，在于2℃至8℃(例如5℃)贮存至少约
6个月，至少约12个月，至少约18个月，或至少约24个月后，配制剂中总聚集体(例如高分子
量种类和低分子量种类)的百分比小于约0.1％，约0.2％，约0.3％，约0.4％，约0.5％，约
0.6％，约0.7％，约0.8％，约0.9％，约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约
8％，约9％，或约10％任一。在一些实施方案中，在于室温(例如约15℃至25℃)摇动至少约2小时，至少约4小时，至少约6小时，至少约8小时，至少约10小时，至少约12小时，至少约14小时，至少约16小时，至少约18小时，至少约20小时，或至少约24小时后，配制剂中总聚集体
(例如高分子量种类和低分子量种类)的百分比小于约0.1％，约0.2％，约0.3％，约0.4％，
约0.5％，约0.6％，约0.7％，约0.8％，约0.9％，约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，或约10％任一。在本文中的任何实施方案中，稳定的配制剂可以贮存在玻璃管形瓶，金属合金容器，或静脉内(IV)袋中。在一些实施方案中，金属合金为316L不
锈钢或哈斯特镍合金。
[0382] 要用于体内施用的配制剂应当是无菌的。这容易通过在制备配制剂之前或之后经由无菌滤膜过滤来实现。
[0383] III.治疗方法和抗体配制剂的施用
[0384] 依照已知方法将配制剂施用于需要用抗体治疗的哺乳动物，优选人，诸如静脉内施用(例如作为推注(bolus)或通过一段时间里的连续输注)，通过肌肉内，腹膜内，脑脊髓
内，皮下，关节内，滑膜内，鞘内，口服，表面，或吸入路径。在一个实施方案中，通过静脉内施用将配制剂施用于哺乳动物。为了此类目的，可例如使用注射器或经IV线注射配制剂。在一
个实施方案中，通过皮下施用将配制剂施用于哺乳动物。
内，皮下，关节内，滑膜内，鞘内，口服，表面，或吸入路径。在一个实施方案中，通过静脉内施用将配制剂施用于哺乳动物。为了此类目的，可例如使用注射器或经IV线注射配制剂。在一
个实施方案中，通过皮下施用将配制剂施用于哺乳动物。
[0385] 抗体的适宜剂量(“治疗有效量”)会取决于例如要治疗的状况，状况的严重程度和过程，施用抗体是为了预防还是治疗目的，先前的疗法，患者的临床史和对抗体的响应，所
使用的抗体的类型，和主治内科医师的斟酌。将抗体以一次或在一系列治疗中合适地施用
于患者，而且可在诊断后的任何时间施用于患者。可作为唯一治疗或与在治疗所讨论的状
况中有用的其它药物或疗法联合施用抗体。
使用的抗体的类型，和主治内科医师的斟酌。将抗体以一次或在一系列治疗中合适地施用
于患者，而且可在诊断后的任何时间施用于患者。可作为唯一治疗或与在治疗所讨论的状
况中有用的其它药物或疗法联合施用抗体。
[0386] 作为一般建议，施用于人的抗体的治疗有效量会在约0.01至约50mg/kg患者体重的范围中，无论是通过一次或多次施用。在一些实施方案中，所使用的抗体为例如每日施用
约0.01至约45mg/kg，约0.01至约40mg/kg，约0.01至约35mg/kg，约0.01至约30mg/kg，约
0.01至约25mg/kg，约0.01至约20mg/kg，约0.01至约15mg/kg，约0.01至约10mg/kg，约0.01
至约5mg/kg，或约0.01至约1mg/kg。在一些实施方案中，以15mg/kg施用抗体。然而，其它剂量方案也可能是有用的。在一个实施方案中，本文所述抗PDL1抗体在21天周期第1天以约
100mg，约200mg，约300mg，约400mg，约500mg，约600mg，约700mg，约800mg，约900mg，约
1000mg，约1100mg，约1200mg，约1300mg或约1400mg的剂量施用于人。剂量可以作为单剂或
作为多剂(例如2或3剂)施用，诸如输注。组合治疗中施用的抗体的剂量可以与单一治疗相
比降低。此疗法的进展容易通过常规技术来监测。
约0.01至约45mg/kg，约0.01至约40mg/kg，约0.01至约35mg/kg，约0.01至约30mg/kg，约
0.01至约25mg/kg，约0.01至约20mg/kg，约0.01至约15mg/kg，约0.01至约10mg/kg，约0.01
至约5mg/kg，或约0.01至约1mg/kg。在一些实施方案中，以15mg/kg施用抗体。然而，其它剂量方案也可能是有用的。在一个实施方案中，本文所述抗PDL1抗体在21天周期第1天以约
100mg，约200mg，约300mg，约400mg，约500mg，约600mg，约700mg，约800mg，约900mg，约
1000mg，约1100mg，约1200mg，约1300mg或约1400mg的剂量施用于人。剂量可以作为单剂或
作为多剂(例如2或3剂)施用，诸如输注。组合治疗中施用的抗体的剂量可以与单一治疗相
比降低。此疗法的进展容易通过常规技术来监测。
[0387] 本文所述含有抗PDL1抗体的配制剂可以在多种体外和体内诊断和治疗应用中使用。例如，可以将含有抗体的配制剂施用于受试者或个体来治疗疾病或病症(例如由PD-1和
PD-L1相互作用介导的疾病或病症)。
PD-L1相互作用介导的疾病或病症)。
[0388] 在一些实施方案中，该疾病或病症为癌症。在一些实施方案中，该癌症是局部晚期的或转移性的。在一些实施方案中，该癌症选自下组：实体瘤，造血癌症，膀胱癌，脑癌，乳腺癌，结肠癌，结直肠癌，胃癌，胶质瘤，头癌，白血病，肝癌，肺癌(例如非小细胞肺癌)，淋巴瘤，骨髓瘤，颈癌，卵巢癌，黑素瘤，胰腺癌，肾癌，唾液腺癌，胃癌，胸腺上皮癌，甲状腺癌，和头和颈的鳞状细胞癌。在一些实施方案中，所治疗的受试者或个体具有PD-L1阳性癌细胞
(例如通过IHC检测的)。
(例如通过IHC检测的)。
[0389] 在一些实施方案中，该疾病或病症为感染。在一些实施方案中，该感染为持久感染。在一些实施方案中，该感染为病毒感染，细菌感染，真菌感染，蠕虫感染，或原生动物感染。在一些实施方案中，该病毒感染选自下组：巨细胞病毒，爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒，乙肝病毒，丙肝病毒，疱疹病毒，麻疹病毒，流感病毒，人免疫缺陷病毒，人T淋巴向性病毒(human T lymphotropic virus)，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒，呼吸道合胞病毒，
和/或鼻病毒。在一些实施方案中，该细菌感染选自下组：螺杆菌(Helicobacter spp.)，分
枝杆菌(Mycobacterium spp.)，卟啉单胞菌(Porphyromonas spp.)，衣原体(Chlamydia
spp.)，沙门氏菌(Salmonella spp.)，李斯特氏菌(Listeria spp.)，链球菌
(Streptococcus spp.)，嗜血菌(Haemophilus spp.)，奈瑟氏菌(Neisseria spp.)，克雷伯
氏菌(Klebsiella spp.)，疏螺旋体(Borrelia spp.)，拟杆菌(Bacterioides spp.)，和密
螺旋体(Treponema spp.)。在一些实施方案中，该原生动物感染选自下组：利什曼原虫
(Leishmania spp.)，镰状疟原虫(Plasmodium falciparum)，血吸虫(Schistosoma spp.)，
弓形体(Toxoplasma spp.)，锥虫(Trypanosoma spp.)，和绦虫(Taenia spp.)。在一些实施
方案中，该真菌感染选自下组：芽生菌病(blastomycosis)，球孢子菌病
(coccidioiodmycosis)，组织胞浆菌病(histoplamsosis)，念珠菌病(candidiasis)，隐球
菌病(cryptococcosis)，曲霉病(aspergillosis)，毛霉病(mucomycosis)和肺孢子虫病
(pneumocystosis)。
和/或鼻病毒。在一些实施方案中，该细菌感染选自下组：螺杆菌(Helicobacter spp.)，分
枝杆菌(Mycobacterium spp.)，卟啉单胞菌(Porphyromonas spp.)，衣原体(Chlamydia
spp.)，沙门氏菌(Salmonella spp.)，李斯特氏菌(Listeria spp.)，链球菌
(Streptococcus spp.)，嗜血菌(Haemophilus spp.)，奈瑟氏菌(Neisseria spp.)，克雷伯
氏菌(Klebsiella spp.)，疏螺旋体(Borrelia spp.)，拟杆菌(Bacterioides spp.)，和密
螺旋体(Treponema spp.)。在一些实施方案中，该原生动物感染选自下组：利什曼原虫
(Leishmania spp.)，镰状疟原虫(Plasmodium falciparum)，血吸虫(Schistosoma spp.)，
弓形体(Toxoplasma spp.)，锥虫(Trypanosoma spp.)，和绦虫(Taenia spp.)。在一些实施
方案中，该真菌感染选自下组：芽生菌病(blastomycosis)，球孢子菌病
(coccidioiodmycosis)，组织胞浆菌病(histoplamsosis)，念珠菌病(candidiasis)，隐球
菌病(cryptococcosis)，曲霉病(aspergillosis)，毛霉病(mucomycosis)和肺孢子虫病
(pneumocystosis)。
[0390] 在一些实施方案中，该疾病或病症为炎性疾病。在一些实施方案中，该炎性疾病选自下组：急性播散性脑脊髓炎，阿狄森(Addison)氏病，阿耳茨海默(Alzheimer)氏病，强直
性脊柱炎，抗磷脂抗体综合征，动脉粥样硬化，自身免疫性溶血性贫血，自身免疫性肝炎，关节炎，贝切特(Behcet)氏病，贝格尔(Berger)氏病，大疱性类天疱疮，乳糜泻，恰加斯
(Chagas)氏病，胆管炎，克罗恩(Crohn)氏病，皮肌炎，1型糖尿病，肾小球肾炎，古德帕斯彻(Goodpasture)氏病，移植物抗宿主病，格雷夫斯(Graves)氏病，格-巴(Guillain-Barré)二
氏综合征，桥本(Hashimoto)氏病，荨麻疹，高IgE综合征，特发性血小板减少性紫癜，红斑狼疮，狼疮肾炎，多发性硬化，重症肌无力，器官移植排斥，帕金森(Parkinson)氏病，天疱疮，恶性贫血，多肌炎，原发性胆汁性肝硬变，银屑病，雷诺(Raynaud)氏综合征，类风湿性关节炎，硬皮病，斯耶格伦 氏综合征，颞动脉炎，甲状腺炎，溃疡性结肠炎，葡萄膜炎，
血管炎，和韦格纳(Wegener氏)肉芽肿病。
性脊柱炎，抗磷脂抗体综合征，动脉粥样硬化，自身免疫性溶血性贫血，自身免疫性肝炎，关节炎，贝切特(Behcet)氏病，贝格尔(Berger)氏病，大疱性类天疱疮，乳糜泻，恰加斯
(Chagas)氏病，胆管炎，克罗恩(Crohn)氏病，皮肌炎，1型糖尿病，肾小球肾炎，古德帕斯彻(Goodpasture)氏病，移植物抗宿主病，格雷夫斯(Graves)氏病，格-巴(Guillain-Barré)二
氏综合征，桥本(Hashimoto)氏病，荨麻疹，高IgE综合征，特发性血小板减少性紫癜，红斑狼疮，狼疮肾炎，多发性硬化，重症肌无力，器官移植排斥，帕金森(Parkinson)氏病，天疱疮，恶性贫血，多肌炎，原发性胆汁性肝硬变，银屑病，雷诺(Raynaud)氏综合征，类风湿性关节炎，硬皮病，斯耶格伦 氏综合征，颞动脉炎，甲状腺炎，溃疡性结肠炎，葡萄膜炎，
血管炎，和韦格纳(Wegener氏)肉芽肿病。
[0391] 在一些实施方案中，可以将含有抗体的配制剂与另一治疗剂联合施用于受试者或个体来治疗疾病或病症。例如，为了治疗癌症，可以将本文所述抗PDL1抗体配制剂与另一抗
癌治疗(例如化疗或不同的抗体治疗)联合施用。
癌治疗(例如化疗或不同的抗体治疗)联合施用。
[0392] IV.制品
[0393] 在本发明的另一个实施方案中，提供制品或试剂盒，其包含装有本发明含水药物配制剂的容器，而且任选提供使用它的说明书。合适的容器包括例如瓶，管形瓶，袋和注射
器。容器可以用各种材料制成，诸如玻璃，塑料(诸如聚氯乙烯或聚烯烃)，或金属合金(诸如不锈钢或哈斯特镍合金)。一种例示性的容器为300cc金属合金容器(例如用于于-20℃贮
存)。另一种例示性的容器可以为10-50cc玻璃管形瓶(例如用于于2-8℃贮存)。例如，该容
器可以是10cc，15cc，20cc，或50cc玻璃管形瓶。容器装有配制剂，而且该容器上或关联的标签可指示使用说明。制品可进一步包括从商业和用户立场看想要的其它材料，包括其它缓
冲剂，稀释剂，滤器，针头，注射器，和印有使用说明书的包装插页。在一些实施方案中，该制品进一步包括一种或多种另一药剂(例如化疗剂和抗肿瘤剂)。对于该一种或多种药剂合适
的容器包括例如瓶，管形瓶，袋和注射器。
器。容器可以用各种材料制成，诸如玻璃，塑料(诸如聚氯乙烯或聚烯烃)，或金属合金(诸如不锈钢或哈斯特镍合金)。一种例示性的容器为300cc金属合金容器(例如用于于-20℃贮
存)。另一种例示性的容器可以为10-50cc玻璃管形瓶(例如用于于2-8℃贮存)。例如，该容
器可以是10cc，15cc，20cc，或50cc玻璃管形瓶。容器装有配制剂，而且该容器上或关联的标签可指示使用说明。制品可进一步包括从商业和用户立场看想要的其它材料，包括其它缓
冲剂，稀释剂，滤器，针头，注射器，和印有使用说明书的包装插页。在一些实施方案中，该制品进一步包括一种或多种另一药剂(例如化疗剂和抗肿瘤剂)。对于该一种或多种药剂合适
的容器包括例如瓶，管形瓶，袋和注射器。
[0394] 认为本说明书足以使得本领域技术人员实施本发明。根据上述描述，在本文所示和所述之外对本发明的各种更改对本领域技术人员会变得显然，而且落在所附权利要求书
的范围之内。据此通过援引完整收录本文中引用的所有出版物，专利，和专利申请，用于所
有目的。
实施例
的范围之内。据此通过援引完整收录本文中引用的所有出版物，专利，和专利申请，用于所
有目的。
实施例
[0395] 通过参考下述实施例，会更加全面地理解本发明。然而，它们不应解释为限制本发明的范围。要理解，本文中描述的实施例和实施方案只是出于例示目的，而且根据它们，本
领域技术人员会想到各种变更或变化，而且它们包括在本申请的精神和范围及所附权利要
求书的范围内。
领域技术人员会想到各种变更或变化，而且它们包括在本申请的精神和范围及所附权利要
求书的范围内。
[0396] 实施例1：抗PDL1抗体的配制剂开发
[0397] 抗PDL1抗体(α-PDL1)是CHO衍生的无糖基化的IgG1抗体，旨在经由抑制PDL1/PD1相互作用来恢复T细胞功能。开发开始时的挑战包括CDR区之中或附近的潜在Trp氧化和糖
化及一些甲硫氨酸氧化。配制前稳健性研究指示比先前瞄准的pH(pH 5.5)要高的pH是最佳
的。目标剂量给药是固定剂量，但是也涵盖基于重量的剂量。进行了分析性研究来分析多种
配制剂的稳定性，并选择了一种配制剂(60mg/mL α-PDL1，20mM His AcO pH 5.8，120mM蔗
糖，0.04％PS20)。初始配制剂研究支持在药物原料(Drug Substance，DS)和药物产品(Drug Product，DS)方面长达3年的稳定性。
化及一些甲硫氨酸氧化。配制前稳健性研究指示比先前瞄准的pH(pH 5.5)要高的pH是最佳
的。目标剂量给药是固定剂量，但是也涵盖基于重量的剂量。进行了分析性研究来分析多种
配制剂的稳定性，并选择了一种配制剂(60mg/mL α-PDL1，20mM His AcO pH 5.8，120mM蔗
糖，0.04％PS20)。初始配制剂研究支持在药物原料(Drug Substance，DS)和药物产品(Drug Product，DS)方面长达3年的稳定性。
[0398] 方法和材料
[0399] α-PDL1配制剂的生成
[0400] 对经历了超滤/渗滤的α-PDL1材料进行配制剂开发研究。使用10000道尔顿透析盒将该材料透析入多种配制剂缓冲液中。透析后，调整蛋白质浓度以达到目标浓度，并掺入
10％PS20储存溶液以实现目标PS20浓度。以1mL填充体积将配制材料无菌填充入2cc Forma
Vitrum玻璃管形瓶中，并用13mm Daikyo 777-1塞子密封。将样品直立贮存于5℃，25℃或40
℃。
10％PS20储存溶液以实现目标PS20浓度。以1mL填充体积将配制材料无菌填充入2cc Forma
Vitrum玻璃管形瓶中，并用13mm Daikyo 777-1塞子密封。将样品直立贮存于5℃，25℃或40
℃。
[0401] 颜色，外观，和清澈度(CAC)
[0402] 如欧洲药典(EP)方法(Council of Europe.European Pharmacopoeia，2008，7th Ed.，EP 2.2.2和EP 2.2.1)中所述，于室温以黑色和白色背景在白色荧光灯下通过目测检
查确定样品颜色，外观，和清澈度。给3cc玻璃管形瓶填充1mL每种测试样品。使用具有对应
样品体积的阴性对照(经过纯化的水)进行比较。
查确定样品颜色，外观，和清澈度。给3cc玻璃管形瓶填充1mL每种测试样品。使用具有对应
样品体积的阴性对照(经过纯化的水)进行比较。
[0403] 蛋白质浓度测量
[0404] 经由用0.9％盐水将定容样品稀释至大约0.5mg/mL，在Agilent 8453分光光度计(Santa Clara，CA.)上通过测量UV吸光度来测定蛋白质浓度。以0.9％盐水作为样品的空
白，并于大约280nm的A最大和还有320nm测量吸光度。计算A最大和A320之间的差异以获得经过修正的A最大，用于以1.5mL cm-1mg-1的吸收率确定最终蛋白质浓度。
白，并于大约280nm的A最大和还有320nm测量吸光度。计算A最大和A320之间的差异以获得经过修正的A最大，用于以1.5mL cm-1mg-1的吸收率确定最终蛋白质浓度。
[0405] 浊度测量
[0406] 在Agilent 8453分光光度计上在路径长度1cm的石英比色杯中测量样品于350nm的平均光密度。使用经过纯化的水作为空白。
[0407] 针对亚可见颗粒的掩光法(HIAC测定法)
[0408] 使用通过9703型HIAC-Royco(HACH，Loveland，CO.)测量的掩光，对样品实施颗粒计数。使用PharmSpec v2.0对每份样品中≥2μm，≥5μm，≥10μm和≥25μm颗粒的每毫升平均累积数目制表。每项测试实施四次读数，每份样品消耗总共1.6mL，其中丢弃第一个读数，并对剩余3个读数取平均。
[0409] 大小排阻层析(SEC或SE-HPLC)
[0410] 在Agilent 1200 HPLC(Santa Clara，CA.，USA)上于30℃使用TosoHaas Bioscience柱G3000 SWXL(South San Francisco，CA.)通过大小排阻层析(SEC)确定大小
变体分布。将50μg未经稀释的所有样品注射到柱上，并在60分钟里洗脱，根据280nm处的UV
吸收。使用两种不同SEC方法测试样品。方法1使用0.20M磷酸钾，0.25M氯化钾，pH 6.2，而方法2使用0.20M磷酸钾，0.25M氯化钾，pH 6.2，以10％(v/v)异丙醇作为流动相。以曲线下总
面积的相对百分比峰面积报告结果。
变体分布。将50μg未经稀释的所有样品注射到柱上，并在60分钟里洗脱，根据280nm处的UV
吸收。使用两种不同SEC方法测试样品。方法1使用0.20M磷酸钾，0.25M氯化钾，pH 6.2，而方法2使用0.20M磷酸钾，0.25M氯化钾，pH 6.2，以10％(v/v)异丙醇作为流动相。以曲线下总
面积的相对百分比峰面积报告结果。
[0411] 成像毛细管等电聚焦(ICIEF)
[0412] 用碳氟化合物包被的毛细管筒(100μm x 5em)使用iCE280分析仪(ProteinSimple)通过iCIEF评估电荷变体的分布。两性电解质溶液由经过纯化的水中的
0.35％甲基纤维素(MC)，0.75％Pharmalyte 3-10载体两性电解质，4.2％Pharmalyte 8-
10.5载体两性电解质，和0.2％pI标志物7.40和0.15％pI标志物9.77的混合物组成。阳极电
解液是80mM磷酸，而阴极电解液是100mM氢氧化钠，二者均在0.10％甲基纤维素中。在经过
纯化的水中稀释样品，并以1：100的酶对底物比将CpB添加至每份经过稀释的样品，接着于
37℃温育20分钟。将经过CpB处理的样品与两性电解质溶液混合，然后通过引入1500V电压
来聚焦1分钟，接着是3000V电压10分钟。通过使280nm紫外光通过毛细管并进入电荷耦合器
件数码相机的透镜来获得聚焦的α-PDL1电荷变体的图像。然后分析此图像以确定各种电荷
变体的分布。
0.35％甲基纤维素(MC)，0.75％Pharmalyte 3-10载体两性电解质，4.2％Pharmalyte 8-
10.5载体两性电解质，和0.2％pI标志物7.40和0.15％pI标志物9.77的混合物组成。阳极电
解液是80mM磷酸，而阴极电解液是100mM氢氧化钠，二者均在0.10％甲基纤维素中。在经过
纯化的水中稀释样品，并以1：100的酶对底物比将CpB添加至每份经过稀释的样品，接着于
37℃温育20分钟。将经过CpB处理的样品与两性电解质溶液混合，然后通过引入1500V电压
来聚焦1分钟，接着是3000V电压10分钟。通过使280nm紫外光通过毛细管并进入电荷耦合器
件数码相机的透镜来获得聚焦的α-PDL1电荷变体的图像。然后分析此图像以确定各种电荷
变体的分布。
[0413] 作肽图
[0414] 使用作肽图技术来监测色氨酸(W)和甲硫氨酸(M)氧化。为了生成α-PDL1肽图，在还原二硫键和改变所得游离硫醇以生成羧甲基衍生物的过程中在将蛋白质暴露于二硫苏
糖醇(DTT)和碘乙酸(IAA)后，用胰蛋白酶消化蛋白质。通过反相高效液体层析(RP-HPLC)将
所得肽分开，并于214nm监测。使用ThermoFisher Scientific LTQ Orbitrap质谱仪通过分
开的消化物混合物的LC-MS分析测定胰蛋白酶消化肽的质量。
糖醇(DTT)和碘乙酸(IAA)后，用胰蛋白酶消化蛋白质。通过反相高效液体层析(RP-HPLC)将
所得肽分开，并于214nm监测。使用ThermoFisher Scientific LTQ Orbitrap质谱仪通过分
开的消化物混合物的LC-MS分析测定胰蛋白酶消化肽的质量。
[0415] 结果
[0416] 缓冲剂系统的选择
[0417] 在配制剂开发期间，评估了两种缓冲剂系统。一种是pH 5.5的含240mM蔗糖的20mM组氨酸乙酸酯，另一种是pH 5.5的200mM精氨酸琥珀酸酯。加速稳定性研究揭示了α-PDL1在
组氨酸乙酸酯缓冲剂中具有与精氨酸琥珀酸酯缓冲剂相比更好的稳定性(表1)。因此，选择
组氨酸乙酸酯进行进一步的配制剂开发。
组氨酸乙酸酯缓冲剂中具有与精氨酸琥珀酸酯缓冲剂相比更好的稳定性(表1)。因此，选择
组氨酸乙酸酯进行进一步的配制剂开发。
[0418] 表1：在30℃在组氨酸乙酸酯和精氨酸琥珀酸酯缓冲剂中ICIEF和SE-HPLC主峰的α-PDL1零级降解速率
[0419]
[0420] 注意：所有配制剂于30℃贮存长达1个月。使用ICIEF和SE-HPLC实施分析；*20mM L-组氨酸乙酸酯，240mM蔗糖，和0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH 5.5中的150mg/mL α-PDL1；**
200mM精氨酸琥珀酸酯，0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH 5.5中的150mg/mL α-PDL1。
200mM精氨酸琥珀酸酯，0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH 5.5中的150mg/mL α-PDL1。
[0421] 稳定剂的选择
[0422] 基于它保护蛋白质免于冷冻/融化诱导的聚集的能力以及在药物原料(DS)的长期冷冻贮存和后续的药物产品(DP)的2℃-8℃贮存期间作为防冻剂的功能，选择蔗糖(120mM)
作为α-PDL1液体配制剂的稳定剂。
作为α-PDL1液体配制剂的稳定剂。
[0423] 在配制剂开发期间，对20mM L-组氨酸乙酸酯，pH 5.5，0.02％(w/v)聚山梨酯20，和范围为0mM至120mM的多种浓度的蔗糖中的50mg/mL α-PDL1进行5个冷冻/融化循环。通过
SE-HPLC测量的产品质量指示60mM蔗糖足以防止冷冻/融化诱导的α-PDL1 HMWS增加(表2)。
还有，120mM蔗糖显示出于-20℃冷冻贮存至少6个月时维持药物原料的稳定性(表3)。因此，
基于来自冷冻/融化研究的结果以及药物原料于-20℃贮存的长期稳定性，选择浓度为
120mM的蔗糖作为α-PDL1液体配制剂的防冻剂。
SE-HPLC测量的产品质量指示60mM蔗糖足以防止冷冻/融化诱导的α-PDL1 HMWS增加(表2)。
还有，120mM蔗糖显示出于-20℃冷冻贮存至少6个月时维持药物原料的稳定性(表3)。因此，
基于来自冷冻/融化研究的结果以及药物原料于-20℃贮存的长期稳定性，选择浓度为
120mM的蔗糖作为α-PDL1液体配制剂的防冻剂。
[0424] 表2：冷冻和融化期间蔗糖浓度对α-PDL1 SE-HPLC百分比高分子量种类的稳定性的影响
[0425]
[0426] 注意：所有配制剂含有50mg/mL α-PDL1，20mM L-组氨酸乙酸酯，0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH 5.5。使用SE-HPLC实施分析；F/T＝冷冻/融化；HMWS＝高分子量种类；SY＝略微黄色；CL＝清澈；PFVP＝实际上没有可见颗粒。
[0427]
[0428] 配制前稳健性研究：蛋白质浓度，pH和聚山梨酯20浓度的选择
[0429] 使用部分析因实验设计(DOE)设计来进一步检查α-PDL1配制剂参数对蛋白质稳定性的影响。测试了总共12种不同α-PDL1配制剂(10种实验和2种中心点)。研究中变化的3项
因素是0.5个单位间隔的5.0-6.0的pH范围，40-120mg/mL的蛋白质浓度范围，和0.005％-
0.06％(w/v)的聚山梨酯20浓度范围(表4)。如表4中所示，除最后两种配制剂以外，所有配
制剂通过含120mM蔗糖的20mM组氨酸乙酸酯来缓冲。评估25mM组氨酸乙酸酯配制剂，因为认
为它是就氧化风险而言的最差案例设定。作为备用缓冲剂系统评估20mM乙酸钠缓冲剂，并
与组氨酸乙酸酯缓冲剂比较。将配制剂于25℃贮存2个月及于40℃贮存1个月。使用JMP软件
(JMP，Version 9，SAS Institute Inc.，Cary，NC)对来自上述研究的稳定性数据在统计学
上分析配制剂参数之间的相互作用。
因素是0.5个单位间隔的5.0-6.0的pH范围，40-120mg/mL的蛋白质浓度范围，和0.005％-
0.06％(w/v)的聚山梨酯20浓度范围(表4)。如表4中所示，除最后两种配制剂以外，所有配
制剂通过含120mM蔗糖的20mM组氨酸乙酸酯来缓冲。评估25mM组氨酸乙酸酯配制剂，因为认
为它是就氧化风险而言的最差案例设定。作为备用缓冲剂系统评估20mM乙酸钠缓冲剂，并
与组氨酸乙酸酯缓冲剂比较。将配制剂于25℃贮存2个月及于40℃贮存1个月。使用JMP软件
(JMP，Version 9，SAS Institute Inc.，Cary，NC)对来自上述研究的稳定性数据在统计学
上分析配制剂参数之间的相互作用。
[0430] 表4：DOE研究中评估的α-PDL1药物原料和药物产品配制剂
[0431]
[0432] 注意：a中心点；b最差案例设定：低蛋白质浓度，高PS20浓度，高组氨酸浓度；c测试20mM乙酸钠(Na-Ace)缓冲剂。
[0433] 在40℃和25℃(分别为图1A-B和图2A-B)，与pH 5.0和5.5相比，pH 6.0的配制剂具有略微更慢的主峰损失速率，如通过ICIEF测量的。通过ICIEF没有观察到浓度对主峰损失
的显著影响。配制剂F1的分析显示了酸性变体增多对ICIEF中的主峰损失做出了主要贡献，
而带碱性电荷的变体对峰损失的贡献不显著。在相同的贮存条件下，在40℃和25℃(分别为
图3A-B和图4A-B)，pH 6.0的配制剂也具有更慢的单体峰损失速率，如通过SE-HPLC测量的。
配制剂F1的分析显示了在升高的温度(即40℃和25℃)，HMWS和LMWS形成二者都对SEC中的
单体损失有贡献。SEC和ICIEF pH速率概况二者都揭示了pH 5.5-6.0是α-PDL1的最佳pH范
围。要在pH 5.5以上的最佳蛋白质稳定性内及在所配制的药物原料和药物产品中容许±
0.3pH单位范围，选择pH 5.8的目标。
的显著影响。配制剂F1的分析显示了酸性变体增多对ICIEF中的主峰损失做出了主要贡献，
而带碱性电荷的变体对峰损失的贡献不显著。在相同的贮存条件下，在40℃和25℃(分别为
图3A-B和图4A-B)，pH 6.0的配制剂也具有更慢的单体峰损失速率，如通过SE-HPLC测量的。
配制剂F1的分析显示了在升高的温度(即40℃和25℃)，HMWS和LMWS形成二者都对SEC中的
单体损失有贡献。SEC和ICIEF pH速率概况二者都揭示了pH 5.5-6.0是α-PDL1的最佳pH范
围。要在pH 5.5以上的最佳蛋白质稳定性内及在所配制的药物原料和药物产品中容许±
0.3pH单位范围，选择pH 5.8的目标。
[0434] 上述配制剂研究还揭示了由于与相同pH的40mg/mL配制剂相比更高的HMWS形成速率，pH在5.0-6.0范围中的120mg/mL α-PDL1配制剂具有略微更高但不显著的单体峰损失速
率，如通过SE-HPLC测定的(图3A-B和图4A-B)。基于这些数据及为了支持具有改良产品稳定
性的配制剂及为了便于患者服药，选择浓度为60mg/mL的α-PDL1。
率，如通过SE-HPLC测定的(图3A-B和图4A-B)。基于这些数据及为了支持具有改良产品稳定
性的配制剂及为了便于患者服药，选择浓度为60mg/mL的α-PDL1。
[0435] 如上文统计学分析所示(图1-4)，对于范围为0.005％-0.06％(w/v)的聚山梨酯20(PS20)浓度没有观察到对蛋白质稳定性的影响。
[0436] 已经知道聚山梨酯20原材料中含有的过氧化氢杂质能引起色氨酸(W)和甲硫氨酸(M)氧化。L-组氨酸也能提高上述氧化风险。通过作肽图分析了选定的含有较高浓度聚山梨
酯20和L-组氨酸的最差案例设定配制剂的样品。分析结果显示了即使是较高组氨酸浓度
(25mM组氨酸乙酸酯缓冲剂)和较大量PS20(0.06％PS20)的组合也没有展现显著氧化风险
(表5)，而且组氨酸缓冲剂对于用于配制α-PDL1是合适的。
酯20和L-组氨酸的最差案例设定配制剂的样品。分析结果显示了即使是较高组氨酸浓度
(25mM组氨酸乙酸酯缓冲剂)和较大量PS20(0.06％PS20)的组合也没有展现显著氧化风险
(表5)，而且组氨酸缓冲剂对于用于配制α-PDL1是合适的。
[0437] 表5：选定配制剂中Trp和M253氧化的百分比，通过肽图
[0438]
[0439] 注意：所有配制剂于40℃贮存长达1个月。使用肽图实施分析。
[0440] W＝色氨酸；M＝甲硫氨酸。
[0441] 为了评估贮存时配制剂中PS20的可能降解，将配制剂F1至F10(表4)于40℃贮存1个月，于25℃贮存2个月，于5℃贮存2个月或于5℃贮存6个月。于升高的(即40℃和25℃)和5
℃的贮存温度任一在所评估的配制剂中没有观察到PS20降解。改变选定配制剂(即F1，F2，
F3，和F6)的填充体积至7ml(高填充)或4ml(低填充)，然后于5℃贮存6个月对PS20降解速率
也没有显著影响(图5)。
℃的贮存温度任一在所评估的配制剂中没有观察到PS20降解。改变选定配制剂(即F1，F2，
F3，和F6)的填充体积至7ml(高填充)或4ml(低填充)，然后于5℃贮存6个月对PS20降解速率
也没有显著影响(图5)。
[0442] 通过HIAC测定法评估于5℃贮存6个月时不同配制剂中亚可见颗粒(SbVP)的形成，作为稳定性的一项度量(表6)。在所测试的配制剂中没有观察到SbVP的可测量变化。
[0443] 表6：SbVP配制剂于5℃贮存6个月后的HIAC数据
[0444]
[0445]
[0446] 注意：将两个1mL填充管形瓶组合到一起来实施小体积HIAC测定法。
[0447] 用冷冻融化实验进一步调查配制剂的稳定性。对配制剂F1至F10(表4)于-20℃贮存期间进行5个冷冻融化循环，或于升高的贮存温度5℃贮存0至6个月，并随后通过SEC和
ICIEF分析配制剂中α-PDL1单体的百分比(图6A和B)和主峰的百分比(图6C和D)。冷冻融化
循环和于所示时间点贮存后没有观察到百分比单体和百分比主峰的显著变化。
ICIEF分析配制剂中α-PDL1单体的百分比(图6A和B)和主峰的百分比(图6C和D)。冷冻融化
循环和于所示时间点贮存后没有观察到百分比单体和百分比主峰的显著变化。
[0448] 通过在不锈钢迷你罐中于-20℃贮存长达6个月期间进行5个冷冻融化循环，接着是通过CAC，SEC，和ICIEF测量稳定性，评估了F2配制剂(表4)中的药物原料稳定性(表7)。
于-20℃贮存6个月后没有观察到变化。
于-20℃贮存6个月后没有观察到变化。
[0449] 表7：在不锈钢迷你罐中于-20℃贮存的药物原料稳定性
[0450]
[0451] 注意：F/T＝冷冻/融化；SY＝略微黄色；CL＝清澈。
[0452] 通过进行3个冷冻融化循环，接着是在不锈钢迷你罐或哈斯特镍合金迷你罐中于-20℃，5℃，或25℃贮存长达3个月，接着是通过SEC测量稳定性，评估了含有100mg/mL α-
PDL1，20mM组氨酸乙酸酯，120mM蔗糖，0.04％PS20，pH 5.6的配制剂中的药物原料稳定性
(图7A和B)。在于pH 5.6在不锈钢和哈斯特镍合金迷你罐中的贮存之间没有观察到差异。在
3个冷冻融化循环后药物原料于-20℃稳定长达3个月。尽管不锈钢和哈斯特镍合金迷你罐
中有轻微差异，二者对于用于药物原料贮存都是适宜的。
PDL1，20mM组氨酸乙酸酯，120mM蔗糖，0.04％PS20，pH 5.6的配制剂中的药物原料稳定性
(图7A和B)。在于pH 5.6在不锈钢和哈斯特镍合金迷你罐中的贮存之间没有观察到差异。在
3个冷冻融化循环后药物原料于-20℃稳定长达3个月。尽管不锈钢和哈斯特镍合金迷你罐
中有轻微差异，二者对于用于药物原料贮存都是适宜的。
[0453] 作为16mL填充在20cc管形瓶中于-5℃，25℃，或40℃贮存长达3个月，接着是通过SEC和ICIEF测量稳定性，评估了含有50mg/mL α-PDL1，20mM组氨酸乙酸酯，120mM蔗糖，
0.04％PS20，pH 5.6的配制剂中的药物产品稳定性(图8A和B)。于5℃贮存3个月后没有观察
到变化。根据SEC和ICIEF分析，pH 5.6于40℃的每个月降解速率分别为0.66％和22％。
0.04％PS20，pH 5.6的配制剂中的药物产品稳定性(图8A和B)。于5℃贮存3个月后没有观察
到变化。根据SEC和ICIEF分析，pH 5.6于40℃的每个月降解速率分别为0.66％和22％。
[0454] 基于通过SE-HPLC和ICIEF测量的主峰降解速率，F12配制剂中的缓冲剂评估指示乙酸钠缓冲剂提供与组氨酸乙酸酯缓冲剂相似的蛋白质稳定性(表8)。测试的两种配制剂
是20mM L-组氨酸乙酸酯，120mM蔗糖，和0.04％(w/v)聚山梨酯20，pH 5.5中的50mg/mL α-
PDL1和20mM乙酸钠，120mM蔗糖，和0.04％(w/v)聚山梨酯20，pH 5.5中的0mg/mL α-PDL1。
是20mM L-组氨酸乙酸酯，120mM蔗糖，和0.04％(w/v)聚山梨酯20，pH 5.5中的50mg/mL α-
PDL1和20mM乙酸钠，120mM蔗糖，和0.04％(w/v)聚山梨酯20，pH 5.5中的0mg/mL α-PDL1。
[0455] 表8：在40℃在组氨酸乙酸酯和乙酸钠缓冲剂中ICIEF和SE-HPLC主峰的α-PDL1零级降解速率
[0456]
[0457] 注意：所有配制剂于40℃贮存长达1个月。
[0458] 总之，DoE设计稳定性研究揭示了通过ICIEF观察到于40℃浓度对主峰损失没有显著影响，而更低的pH具有略微更快的主峰损失速率(图1A-B)。通过SE-HPLC于40℃也没有观
察到显著相互作用，然而，更高浓度的配制剂显示更快的单体损失速率(图3A-B)。还发现更
低的pH具有更快的单体损失速率。于25℃观察到相似结果(图2A-B和图4A-B)。统计学分析
揭示了任何测试的配制剂参数之间没有实践中有意义的相互作用(联系)。
察到显著相互作用，然而，更高浓度的配制剂显示更快的单体损失速率(图3A-B)。还发现更
低的pH具有更快的单体损失速率。于25℃观察到相似结果(图2A-B和图4A-B)。统计学分析
揭示了任何测试的配制剂参数之间没有实践中有意义的相互作用(联系)。
[0459] 摇动和热应力研究
[0460] 调查了在玻璃管形瓶中经历摇动应力时在渐增浓度的PS20存在下药物产品的稳定性。以范围为0.005％至0.06％的多种浓度的PS20，在2cc玻璃管形瓶中以1mL填充评估了
在20mM组氨酸乙酸酯，120mM蔗糖，pH 5.5中含有57mg/mL的配制剂。将玻璃管形瓶于室温以
70rpm摇动3天，之后通过SEC测量稳定性(图9A)及测量浊度(图9B)。PS20水平介于0.005-
0.06％之间的配制剂在摇动期间稳定性没有变化。然而，由于HMWS增多，缺乏PS20的配制剂
显示单体损失增大。在这项实验中，0.005％PS20足以保护蛋白质免于玻璃管形瓶中的摇动
应力。
在20mM组氨酸乙酸酯，120mM蔗糖，pH 5.5中含有57mg/mL的配制剂。将玻璃管形瓶于室温以
70rpm摇动3天，之后通过SEC测量稳定性(图9A)及测量浊度(图9B)。PS20水平介于0.005-
0.06％之间的配制剂在摇动期间稳定性没有变化。然而，由于HMWS增多，缺乏PS20的配制剂
显示单体损失增大。在这项实验中，0.005％PS20足以保护蛋白质免于玻璃管形瓶中的摇动
应力。
[0461] 调查了于多种温度和时间贮存，然后在玻璃管形瓶中经历摇动应力时药物产品配制剂的稳定性(表4)。在2cc玻璃管形瓶中以1mL填充评估了配制剂F1-F10中每一种。将玻璃
管形瓶于室温以70rpm摇动1天，之后通过SEC测量稳定性(图10)。在这项实验中，于40℃，25℃或5℃贮存一定长度的时间时，摇动对药物产品的稳定性没有影响。
管形瓶于室温以70rpm摇动1天，之后通过SEC测量稳定性(图10)。在这项实验中，于40℃，25℃或5℃贮存一定长度的时间时，摇动对药物产品的稳定性没有影响。
[0462] 为了支持医院设置中常常发生的IV袋运输，用在含有0.005％-0.02％(w/v)聚山梨酯20的20mM组氨酸乙酸酯，240mM蔗糖，pH 5.5中配制的α-PDL1实施了IV袋摇动研究。通
过注入400-600mg α-PDL1溶液并于5℃使用定轨摇床以100rpm摇动长达6小时，评估了装有
等张氯化钠溶液(0.9％NaCl)的最普遍可得的250mL聚氯乙烯(PVC)或聚烯烃(PO)IV袋。研
究结果支持基于重量的剂量给药，而且证明为了防止运输期间形成可见颗粒(与蛋白质沉
淀有关)蛋白质溶液中需要最少0.015％(w/v)聚山梨酯20(表9)。另外，为了降低保存期里
聚山梨酯20降解的风险，将聚山梨酯20浓度自0.02％(w/v)提高至0.04％(w/v)。
过注入400-600mg α-PDL1溶液并于5℃使用定轨摇床以100rpm摇动长达6小时，评估了装有
等张氯化钠溶液(0.9％NaCl)的最普遍可得的250mL聚氯乙烯(PVC)或聚烯烃(PO)IV袋。研
究结果支持基于重量的剂量给药，而且证明为了防止运输期间形成可见颗粒(与蛋白质沉
淀有关)蛋白质溶液中需要最少0.015％(w/v)聚山梨酯20(表9)。另外，为了降低保存期里
聚山梨酯20降解的风险，将聚山梨酯20浓度自0.02％(w/v)提高至0.04％(w/v)。
[0463] 表9：α-PDL1药物产品中不同量的PS20的IV袋摇动研究
[0464]
[0465]
[0466] 注意：所有配制剂在20mM L-组氨酸乙酸酯，240mM蔗糖，pH 5.5中含有50mg/mL α-PDL1。使用SE-HPLC实施分析。NT＝未测试；CAC＝颜色，外观，和清澈度；CO＝无色；CL＝清澈；PFVP＝实际上没有可见颗粒。
[0467] α-PDL1配制剂的稳定性评估
[0468] 在含有20mM组氨酸乙酸酯，120mM蔗糖，和0.04％PS20的配制剂中在5.2至6.3的pH范围上对自主细胞库和工作细胞库生成的材料进行另一项pH筛选(表10)。通过SE-HPLC和
ICIEF进行的分析显示pH 5.7-6.3在化学上和在物理上相当稳定，而且容许的范围pH 5.5-
6.3在该配制剂中是适宜的(图11A和B)。更高的pH降低单体和主峰降解速率，速率在约pH
5.7和6.3之间变平。
ICIEF进行的分析显示pH 5.7-6.3在化学上和在物理上相当稳定，而且容许的范围pH 5.5-
6.3在该配制剂中是适宜的(图11A和B)。更高的pH降低单体和主峰降解速率，速率在约pH
5.7和6.3之间变平。
[0469] 表10：配制剂的pH筛选
[0470] 浓度(mg/mL) pH 容器 温度(℃) 时间点120 5.2，5.7，6.0，6.3 在2cc管形瓶中填充1mL 40 T0，1周，2周，1个月
40 5.2，5.7，6.0，6.3 在2cc管形瓶中填充1mL 40 T0，1周，2周，1个月
40 5.2，5.7，6.0，6.3 在2cc管形瓶中填充1mL 40 T0，1周，2周，1个月
[0471] 调查了配制剂赋形剂对α-PDL1配制剂中色氨酸(W)和甲硫氨酸(M)氧化的影响。作肽图显示氧化没有显著增加。对于药物产品或药物原料任一，当溶液pH为5.8，含有20mM组
氨酸乙酸酯，120mM蔗糖，0.04％PS20的配制剂于升高的温度贮存1个月后，该配制剂显示色
氨酸和甲硫氨酸氧化没有明显增加(表11)。
氨酸乙酸酯，120mM蔗糖，0.04％PS20的配制剂于升高的温度贮存1个月后，该配制剂显示色
氨酸和甲硫氨酸氧化没有明显增加(表11)。
[0472] 表11：选定配制剂中Trp，M253和M429氧化的百分比，通过肽图
[0473]
[0474] 注意：所有α-PDL1配制剂含有20mM L-组氨酸乙酸酯，120mM蔗糖，0.04％PS20，pH 5.8。
[0475] 基于来自这些配制剂研究和统计学分析的结果，选择由20mM组氨酸乙酸酯，120mM蔗糖，0.04％聚山梨酯20，目标pH 5.8中的60mg/mL α-PDL1组成的液体配制剂进行临床研
究。
究。
[0476] 用于临床试验的剂量会作为1200mg α-PDL1每位患者的平坦剂量进行。选择20cc玻璃管形瓶中标称20mL填充(1200mg α-PDL1)的管形瓶配置来达到目标产品概况。
[0477] 用在20mM L-组氨酸乙酸酯，120mM蔗糖，和0.02％(w/v)聚山梨酯20，pH 5.8中含有60mg/mL α-PDL1的预期配制剂进行了冷冻/融化研究。5个冷冻/融化循环后的测定结果
确认了120mM蔗糖保护α-PDL1免于冷冻/融化诱导的聚集(表12)。预期液体配制剂的相似长
期稳定性指示它于2-8℃在6个月里是稳定的(表13)。此配制剂正在进行36个月的连续监
测。α-PDL1药物原料和药物产品的目标配制剂和测试的研究范围显示于表14。
确认了120mM蔗糖保护α-PDL1免于冷冻/融化诱导的聚集(表12)。预期液体配制剂的相似长
期稳定性指示它于2-8℃在6个月里是稳定的(表13)。此配制剂正在进行36个月的连续监
测。α-PDL1药物原料和药物产品的目标配制剂和测试的研究范围显示于表14。
[0478]
[0479]
[0480] 表14：α-PDL1药物原料和药物产品的目标配制剂和测试的研究范围
[0481]参数 目标 测试的配制剂范围
α-PDL1浓度 60mg/mL 40-120mg/mL
L-组氨酸乙酸酯浓度 20mM 20mM
溶液pH 5.8 5.0-6.0
蔗糖浓度 120mM 0-240mM
聚山梨酯20浓度(w/v) 0.04％ 0.005％-0.06％a
α-PDL1浓度 60mg/mL 40-120mg/mL
L-组氨酸乙酸酯浓度 20mM 20mM
溶液pH 5.8 5.0-6.0
蔗糖浓度 120mM 0-240mM
聚山梨酯20浓度(w/v) 0.04％ 0.005％-0.06％a
[0482] 由于α-PDL1药物产品(60mg/mL)会在等张氯化钠溶液(0.9％NaCl)中稀释后通过输注来施用，因此在下述模拟制备和施用条件下测试活性组分的相容性和稳定性：1)在
2.4-9.6mg/ml(稀释后的标称浓度)的范围中在装有0.9％NaCl的输液袋中稀释α-PDL1药物
产品以覆盖临床研究中的剂量范围；2)短期暴露于装有等张氯化钠溶液的输液袋(由PVC或
聚烯烃组成的袋产品接触表面材料)；3)使用IV输液管(PVC或聚烯烃的产品接触表面)；和
4)使用0.2μm在线滤器(PES的滤膜)。
2.4-9.6mg/ml(稀释后的标称浓度)的范围中在装有0.9％NaCl的输液袋中稀释α-PDL1药物
产品以覆盖临床研究中的剂量范围；2)短期暴露于装有等张氯化钠溶液的输液袋(由PVC或
聚烯烃组成的袋产品接触表面材料)；3)使用IV输液管(PVC或聚烯烃的产品接触表面)；和
4)使用0.2μm在线滤器(PES的滤膜)。
[0483] 于2℃-8℃贮存24小时后或暴露于扩散光于30℃贮存24小时后测试样品。使用适宜的稳定性指示方法测试样品，包括：纯度(通过SE-HPLC和ICIEF)，蛋白质浓度(通过UV)，
亚可见颗粒(通过掩光)，颜色，清澈度/乳光，和pH(表15)。
亚可见颗粒(通过掩光)，颜色，清澈度/乳光，和pH(表15)。
[0484]
[0485]
[0486]
[0487]
[0488]
[0489] 在如上所述模拟施用研究中测试的产物在测试条件下在物理上和在化学上是稳定的。在资格审查(qualification)成功后添加由不同产品接触材料构成的输液袋，输液装
置，滤器，和/或IV施用辅助装置。
置，滤器，和/或IV施用辅助装置。
[0490] 在静态稳定性以外，用在20mM组氨酸乙酸酯，120mM蔗糖，pH 5.8及0.02％PS20(这可能是在保存期里在药物产品中能观察到的最低PS20水平)中配制的α-PDL1实施IV袋摇动
研究。于2-8℃用定轨摇床以100rpm的速度实施摇动。数据提示凭借药物产品中的0.02％
PS20，α-PDL1在IV袋中稀释后于5℃摇动后是稳定的(表16)。
研究。于2-8℃用定轨摇床以100rpm的速度实施摇动。数据提示凭借药物产品中的0.02％
PS20，α-PDL1在IV袋中稀释后于5℃摇动后是稳定的(表16)。
[0491] 实施例中使用的抗体的序列
[0492] αPDL1轻链可变区
[0493] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：7)
[0494] αPDL1重链可变区
[0495] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTK(SEQ ID NO：8)
[0496] αPDL1完整轻链
[0497] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA
KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID
NO：9)
KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID
NO：9)
[0498] αPDL1完整重链
[0499] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG
CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS
CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ
YASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG
FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
(SEQ ID NO：10)
CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS
CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ
YASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG
FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
(SEQ ID NO：10)