一种特异性抗原发性肝癌免疫树状突细胞疫苗及其体外制备方法

摘要

本发明公开一种特异性抗原发性肝癌免疫树状突细胞疫苗及其制备方法，是从分离培养肝肿瘤细胞提取细胞膜蛋白作为个体特异性抗原，而激活自体的树状突细胞制备特异性抗肝癌疫苗；其在体外制备后，可以单独应用，即以细胞悬液经静脉回输；也可以和在体外扩增的免疫效能细胞如CIK或NK联合应用，或和抗肿瘤的传统治疗方法如手术、化疗和放疗结合应用，在临床中显示了显著的抗肿瘤效果。

权利要求

1.一种特异性抗原发性肝癌免疫树状突细胞疫苗的制备方法，其特征在于：(1)制备肝癌特异性抗原：

①取肝癌组织，清洗后剪碎，用I型胶原酶进行消化，过滤后离心收集细胞沉淀；

②用添加了10％小牛血清和1％青链霉素的RPMI 1640培养液悬浮步骤①所得的细胞沉淀，培养传代细胞，收集细胞于TBS中；

③用反复冻融法破碎步骤②所得的细胞；经离心和超速离心的方法获得细胞膜蛋白，并用TBS充分悬浮；

(2)准备自体DC：

分离外周血单核细胞，即收集粘附于培养皿的细胞，更换无血清培养液，加入400U/ml IL-4和1000U/ml GM-CSF培养6天，即获得非成熟的DC。

(3)制备DC抗肝癌特异性疫苗：

对步骤(2)所得的非成熟的DC更换无血清培养液，加入步骤(1)所得的肝癌细胞膜抗原，培养24小时后，加入1000U/ml TNF-α、10ng/ml IL-1β、10ng/ml IL-6和1μM PGE2，培养

48小时。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤①的具体操作步骤为：在肝癌中心取5-10g肝癌组织，在4℃条件下经生理盐水冲洗3次，剪成2mm左右，用I型胶原酶于37℃孵育1小时，经不锈钢网过滤，800rpm离心5分钟。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤②所述的培养传代细胞具体为，

72小时传代一次；在144小时移去培养液，用TBS冲洗，刮除细胞层于TBS中，获得7～15×109肝癌细胞。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤③所述的离心和超速离心的条件为：经1500rpm离心10分钟后，100000rpm超速离心1小时取沉淀，并用TBS充分悬浮细胞膜蛋白。

5.如权利要求1所述方法制备的特异性抗原发性肝癌免疫树状突细胞疫苗。

说明书

一种特异性抗原发性肝癌免疫树状突细胞疫苗及其体外制备

方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及一种特异性抗原发性肝癌免疫树状突细胞疫苗及其制备方法。

背景技术

[0002] 恶性肿瘤的传统治疗方法包括手术、化疗和放疗，都有严重的副作用和局限性。肿瘤的免疫治疗是近年来发展起来的新的抗肿瘤方法，通过调节患者自身的免疫而达到排斥或者杀死肿瘤细胞的免疫治疗和预防方法。免疫治疗与手术、化疗或者放射等其他抗肿瘤疗法联合使用时，取得了内外联合的抗肿瘤效果。细胞因子诱导的自体杀伤细胞(CIK)、体外增值和激活的自体自然杀伤细胞(NK)和自体树突状细胞(DC)是肿瘤细胞免疫治疗主要的活性细胞，也是研究和改进肿瘤免疫治疗的关键。CIK和NK具有非特异性抗肿瘤活性，其优点是有广谱的抗肿瘤作用，缺点是效果短暂和疗效不稳定，还没有被广泛认可，还没有相关技术被美国FDA批准。

[0003] DC是已知机体内抗原呈递能力最强的细胞，肿瘤特异性抗原经DC处理加工、然后把信息传递给免疫效能细胞发挥特异性杀伤肿瘤细胞的作用。所以如何得到肿瘤特异性抗原和如何用肿瘤特异性抗原激活DC细胞使其把特异性肿瘤抗原呈递给免疫效能细胞如NK，CIK等，是肿瘤免疫细胞治疗的关键。美国FDA在2009年批准由Dendreon公司研发的抗前列腺癌的细胞免疫治疗技术(Provenge)，该技术的主要机制是利用PAP-GMCSF(前列腺酸性磷酸酶-粒巨细胞集落刺激因子)融合蛋白作为抗原在体外刺激自身DC细胞，把负载对于前列腺癌特异性抗原的DC细胞后再输入患者体内，诱发针对前列腺癌的特异性免疫反应。临床试验证明利用该项技术治疗晚期前列腺癌患者可平均延长生存期4.1月。利用该项技术治疗一个疗程的费用是97,000美金。

发明内容

[0004] 本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是，公开一种抗原发性肝癌免疫树状突细胞疫苗，用于治疗原发性肝癌及其癌转移。特异性抗肝癌DC疫苗的制备技术方案：

[0005] (1)制备肝癌特异性抗原：具体方法如下：

[0006] ①取肝癌组织，清洗后剪碎，用I型胶原酶进行消化，过滤后离心收集细胞沉淀；

[0007] ②用添加了10％小牛血清和1％青链霉素的RPMI 1640培养液悬浮步骤①所得的细胞沉淀，培养传代细胞，收集细胞于TBS中；

[0008] ③用反复冻融法破碎步骤②所得的细胞；经离心和超速离心的方法获得细胞膜蛋白，并用TBS充分悬浮，测定细胞膜蛋白浓度；

[0009] (2)准备自体DC：

[0010] 分离外周血单核细胞，即收集粘附于培养皿的细胞，更换无血清培养液，加入400U/ml IL-4和1000U/ml GM-CSF培养6天，即获得非成熟的DC。

[0011] (3)制备DC抗肝癌特异性疫苗：

[0012] 对步骤(2)所得的非成熟的DC更换无血清培养液，加入步骤(1)所得的肝癌细胞膜抗原，培养24小时后，加入1000U/ml TNF-α、10ng/ml IL-1β、10ng/ml IL-6和1μM PGE2，培养48小时。此时，DC被激活成为特异性抗肝癌DC疫苗。

[0013] 经过本发明验证，从肝肿瘤组织分离、纯化培养肝癌细胞，然后收集和提取细胞膜蛋白和细胞浆蛋白，用作激活自体DC特异性抗原。通过肝癌细胞膜抗原激活的DC抗癌效果显著优于肝癌细胞浆蛋白抗原激活的DC，也未发现明显的临床副反应。

[0014] 优选的技术方案中，上文所述步骤①的具体操作步骤为：在肝癌中心取5-10g肝癌组织，在4℃条件下经生理盐水冲洗3次，剪成2mm左右，用I型胶原酶于37℃孵育1小时，经不锈钢网过滤，800rpm离心5分钟。

[0015] 优选的技术方案中，上文所述步骤③所述的离心和超速离心的条件为：经1500rpm离心10分钟后，100000rpm超速离心1小时取沉淀，并用TBS充分悬浮细胞膜蛋白。

[0016] 优选的技术方案中，上文所述步骤②所述的培养传代细胞具体为，72小时传代一次；在144小时移去培养液，用TBS冲洗，刮除细胞层于TBS中，获得7～15×109肝癌细胞。

[0017] 本发明实施例中公开了所述疫苗其体外制备方法的最优方案，即所述肝癌组织和外周血源自同一个体。从分离培养肝肿瘤细胞提取细胞膜蛋白作为个体特异性抗原而激活自体的树状突细胞制备特异性抗肝癌疫苗；该疫苗是患者自体的树状突细胞(具有对抗原处理和呈递功能)在体外经特异性肝肿瘤抗原激活而具有抗各期肝癌的治疗作用；

[0018] 本发明的另外一方面是要保护上文所述方法制备的特异性抗原发性肝癌免疫树状突细胞疫苗。本发明所述的特异性抗原发性肝癌免疫树状突细胞疫苗在体外制备后，可以单独应用，以细胞悬液(5×106-9细胞在100ml生理盐水)经静脉回输；也可以和在体外扩增的免疫效能细胞如CIK或NK联合应用，或和抗肿瘤的传统治疗方法如手术、化疗和放疗结合应用，在临床中显示了显著的抗肿瘤效果。

[0019] 本发明的创新特征是：

[0020] 特异性抗原来源于自体纯化的肝肿瘤细胞的膜蛋白，抗肿瘤特异性强；来源于肝肿瘤膜蛋白的肿瘤抗原暴露，免疫效能细胞接收到DC呈递的信息后，可直接识别这些肿瘤膜抗原而杀伤肿瘤细胞。临床应用证明治疗后有效率达76.7％，显著优于对照组。长期生存改善仍然在观察之中。另外，用DC抗肝癌特异性疫苗治疗肝癌，没有发现明显的毒副作用，显著提高患者的生活质量。

具体实施方式

[0021] 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

[0022] 实施例1

[0023] 特异性抗肝癌DC疫苗的制备方法：

[0024] (1)制备肝癌特异性抗原：从肝穿刺获得或手术切下的肝肿瘤组织分离培养肝癌细胞，经一周培养和一次传代得到纯化的肝肿瘤细胞，然后收集和提取细胞膜蛋白和细胞浆蛋白，用作激活自体DC特异性抗原。经比较肝癌细胞浆蛋白和肝癌细胞膜蛋白的抗原，发现肝癌细胞膜蛋白抗原具有强的激活DC的抗原活性。

[0025] 具体方法如下：

[0026] ①在肝癌中心取5-10g肝癌组织经生理盐水(4℃)冲洗3次，剪成2mm左右，用I型胶原酶于37℃孵育1小时，经不锈钢网过滤，离心5分钟(800rpm)。

[0027] ②用添加了10％小牛血清和1％青链霉素的RPMI 1640培养液悬浮步骤①所得的细胞沉淀，培养于10cm培养皿中，在72小时传代一次。在144小时，移去培养液，用TBS(Tris-buffered saline)冲洗3次，刮除细胞层于5ml TBS中，可获得7-15×109肝癌细胞。

[0028] ③用反复冻融法破碎步骤②所得的细胞。经1500rpm离心10分钟去除未破碎的细胞以及细胞核等大的细胞器，然后100000rpm条件下超速离心1小时沉淀细胞膜。

[0029] ④再用TBS充分悬浮步骤③所得的细胞膜，测定细胞膜蛋白浓度。从7-15×109肝癌细胞可获得500-10000μg细胞膜蛋白，即肝癌细胞膜抗原。

[0030] (2)准备自体DC：在手术前抽取患者50ml-100ml周围血，按参考文献发表的标准方法(Bianca Obermaire,et al.Development of a new protocol for 2day generation of mature dendritic cells from human monocytes.Biol.Proced.Online 2003:5(1):197)分离外周血单核细胞，即收集粘附于培养皿的细胞，更换免疫细胞无血清培养液(购买于友康恒业生物科技(北京)有限公司)，加入400U/ml IL-4(从Promega，Madison，US购买)和1000U/ml GM-CSF(从Novartis，Basel，Switzerland购买)培养6天即获得非成熟的DC。

[0031] (3)制备DC抗肝癌特异性疫苗：对步骤(2)所得的非成熟的DC更换新鲜的免疫细胞无血清培养液，加入步骤(1)所得的肝癌细胞膜抗原培养24小时后加入1000U/ml TNF-α、10ng/ml IL-1β、10ng/ml IL-6和1μM PGE2(这些试剂购买于sigma-Aldrich，Steinheim德国),培养48小时。此时，DC被激活成为特异性抗肝癌DC疫苗。

[0032] (4)DC抗肝癌特异性疫苗成熟性检查

[0033] 用细胞流式仪结合荧光标记的单克隆抗体方法检查DC疫苗表面生物标记分子，结果显示：100％的DC疫苗表达CD83、CD86和MHCII，说明DC疫苗是激活和成熟的DC疫苗。

[0034] 实施例2

[0035] (一)DC抗肝癌特异性疫苗成熟性检查

[0036] 用细胞流式仪结合荧光标记的单克隆抗体方法检查DC疫苗表面生物标记分子：100％的DC疫苗表达CD83、CD86和MHCII，说明DC疫苗是激活和成熟的DC疫苗。

[0037] 1.临床试验I

[0038] 入组标准：入组60例不适合手术治疗的肝癌患者，随机分为俩组，试验组和对照组，各30例。符合以下病例入选标准：

[0039] 1)病理确诊的(IIb-IV期)中晚期肝癌患者；

[0040] 2)至少有一个最大径≥2cm的可测量(影像学或照片)的肿瘤病灶；

[0041] 3)入组前1周内未接受化疗、放疗和生物治疗等抗肿瘤治疗；

[0042] 4)年龄≥18岁；

[0043] 5)预计生存期12周；

[0044] 6)ECOG体力状态评分0-2；

[0045] 7)肝功能Child-Pugh分级A或B

[0046] 8)入组前1周内的实验室检查结果符合以下条件：

[0047] 中性粒细胞(ANC)≥1.5×109/L；

[0048] 血小板(PLT)≥80×109/L、血红蛋白(Hb)≥80g/L；

[0049] 总胆红素(TBI)≤1.5×正常值上限(2mg/dl)；

[0050] 谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)≤2×正常值上限；

[0051] 肌酐(Cr)≤1.5×正常值上限；凝血参数(INR和PTI在正常范围)；

[0052] 9)患者愿意参加，并且签署同意书。

[0053] 病例排除标准：

[0054] 1)病灶含有重要血管神经及所在部位不适宜局部注射者；

[0055] 2)严重凝血机制障碍、出血倾向；

[0056] 3)有严重未控制的内科疾病、近期心肌梗塞史(3个月内)；

[0057] 4)急性感染者；

[0058] 5)妊娠或哺乳期妇女；

[0059] 6)研究者认为不适合入组者，如严重的肝细胞性黄疸；大量腹水；肝硬化明显，肝功能严重受损；肿瘤病变已超整个肝脏的4/5；终末期患者。

[0060] 2.治疗方案

[0061] 试验组：肝动脉栓塞和介入化疗加上特异性抗肝癌DC疫苗；

[0062] 对照组：肝动脉栓塞和介入化疗；

[0063] 肝动脉栓塞和介入化疗是对于中晚期肝癌常用治疗方法。试验组在肝动脉栓塞和介入化疗前(氟尿嘧啶(5-FU)1000mg和阿霉素60mg)按上述方法准备特异性抗肝癌DC疫苗，在肝动脉栓塞和介入化疗治疗两周后经静脉输入特异性抗肝癌DC疫苗悬液。对照组给以单纯肝动脉栓塞和介入化疗治疗。治疗后观察有效性(治疗后3个月有效率，1年、2年和5年生存分析)，安全性指标(不良反应，化验、心电图检查结果，体检和生命体征)、和生活质量检查(ECOG评分)。

[0064] 3.结果和结论

[0065]治疗组 完全有效率(CR) 部分有效率(PR) 稳定(SD) 疾病进展(PD)
试验组 8(26.7％) 15(50.0％) 2(6.7％) 5(16.7％)
对照组 3(10.0％) 11(36.7％) 3(10.0％) 13(43.3％)

[0066] 试验组有效率达76.7％，而对照组有效率为46.7％，向比较具有显著的统计学和临床意义。安全性检查：输入DC疫苗后，只有3例患者有轻微一过性发热反应，未发现其它不良反应。

[0067] 生活质量：

[0068]

[0069]

[0070] 上表表明试验组体能状态明显优于对照组。

[0071] 临床试验II：和自体CIK细胞联合应用治疗晚期不能手术的肝癌

[0072] 入组标准：入组60例不适合其它治疗的晚期肝癌患者，入组标准同上。

[0073] 试验组：特异性抗肝癌DC疫苗加自体CIK

[0074] 对照组：单纯自体CIK

[0075] (1)按上述方法准备自体特异性抗肝癌DC疫苗

[0076] (2)制备CIK:在手术前抽取患者50ml-100ml周围血，按上述方法分离外周血单核细胞，粘附的部分用于制备自体特异性抗肝癌DC疫苗，未粘附的细胞用于准备CIK。参照发表文献方法(Clara E.Jakel,et al.Clinical Studies Applying Cytokine-Induced Killer Cells for the Treatment of Gastrointestinal Tumors.Journal of Immunology Research 2014:1)，经先后加入重组人干扰素γ(1000IU/ml)、抗CD3(50ng/ml)、IL-1β(100U/ml)和IL-2(300U/ml)诱导培养，以后每3天更换新鲜培养液并加入IL-2(300U/ml)，共培养7-14天。

[0077] 治疗

[0078] 试验组：特异性抗肝癌DC疫苗悬液(稀释在100ml生理盐水)经静脉一次输入。CIK细胞悬液以100ml每天一次、分3次经静脉输入。

[0079] 对照组：CIK细胞悬液以100ml每天一次、分3次经静脉输入。

[0080] 结果和结论

[0081]治疗组 完全有效率(CR) 部分有效率(PR) 稳定(SD) 疾病进展(PD)
试验组 6(20.0％) 13(43.3％) 4(13.3％) 7(23.3％)