一种枯草芽孢杆菌菌肥及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌菌肥及其制备方法和应用，枯草芽孢杆菌JQ?001保藏编号为CGMCC No.11632，从黑龙江建三江农场土壤中分离获得；由枯草芽孢杆菌JQ?001经种子活化、种子培养、发酵培养后制成发酵菌液，然后加入硅藻土、粘结助剂、腐植酸、牛粪等组份制成菌肥；因为该菌具有很高的生物活性，对马铃薯疮痂病的抑制性强，环境相容性好，能够调节植物微生物生态区系，对人畜无毒害，使用方便；由此制备的菌肥不但能够抑制马铃薯疮痂病的发生，还能提高马铃薯的产量和质量，使常年连作马铃薯产生的土壤问题得到解决，有助于现代农业的集约化生产发展。

权利要求

1.一种枯草芽孢杆菌菌肥，其特征在于：所述菌肥由枯草芽孢杆菌JQ-001经种子活化、种子培养、发酵培养后制成发酵菌液，然后加入腐植酸、牛粪制成，所述枯草芽孢杆菌JQ-

001保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏时间：2015年11月9日，保藏登记号为CGMCC No.11632。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌肥，其特征在于：所述菌肥还加入以下组分：硅藻土、粘结助剂。

3.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌菌肥，其特征在于：所述粘结助剂为二氧化硅。

4.一种权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌肥的制备方法，具体包括：a.菌种活化：将低温保存的枯草芽孢杆菌JQ-001菌株接种于固体培养基上，于35-38℃培养34-38h，挑取单菌落转接到斜面培养基上，于35-38℃培养16-24h，用无菌水洗下培养基表面菌体作为接种液；

b.一级种子液制备：按照5％-10％的接种量向种子培养基中接入步骤a制备的接种液，转速200-260rpm，温度35-38℃，摇床培养16-24h，作为一级种子液；

c.二级种子液制备：按照0.5％-3％的接种量向种子培养基中接入步骤b制备的一级种子液，通气量为0.4-1.5vvm，搅拌速度为180-260rpm，培养时间为18-24h，作为二级种子液；

d.发酵培养：按照5％-10％的接种量向发酵培养基中接入步骤c制备的二级种子液，通气量为0.4-1.5vvm，搅拌速度为180rpm-260rpm，培养时间为24h-30h，得到发酵液；

e.菌肥的制备：将所述发酵菌液经板框压滤并加入腐植酸、牛粪制成菌肥。

5.如权利要求4所述的枯草芽孢杆菌菌肥的制备方法，其特征在于：所述步骤e中菌肥的制备包括：①将所述发酵菌液先加入硅藻土和粘结助剂，混匀后板框过滤；

②根据滤饼含菌量加入总重量的55-75％腐殖酸和20-35％牛粪，混匀；

③将上述混合好物料用造粒机造粒，同时喷雾添加发酵菌液粘结造粒；

④将造好的颗粒低温烘干。

6.如权利要求5所述的枯草芽孢杆菌菌肥的制备方法，其特征在于：所述步骤①中加入总重量占比的3％硅藻土和1％粘结助剂。

7.如权利要求5所述的枯草芽孢杆菌菌肥的制备方法，其特征在于：所述步骤③加入总重量占比的10％发酵菌液。

8.如权利要求5所述的枯草芽孢杆菌菌肥的制备方法，其特征在于：所述步骤④低温烘干温度为70℃。

9.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌肥的应用，其特征在于：所述菌肥在制备防治马铃薯疮痂病药物中的应用。

说明书

一种枯草芽孢杆菌菌肥及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及农业微生物领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌菌肥及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 疮痂病被视为马铃薯生产中的世界性病害，在我国许多马铃薯主产区普遍存在，连作地、偏碱地及栽培管理不当的情况下发生程度更为严重。近年来，疮痂病在我国很多马铃薯生产地区相继发生，其中黑龙江、内蒙古、河北、山东、山西、陕西、贵州、甘肃、四川、湖南、湖北、云南等多个省区的马铃薯主产区均有关于该病的报道，基本覆盖了东北、华北、西北和西南。并且在气候干旱、土壤偏碱性、连作重茬严重的地区发病率较高。

[0003] 马铃薯疮痂病的发生原因：

[0004] ①种薯带菌。在种薯生产中微型薯的疮痂病尤为严重，带病种薯的运转是病害传播的重要途径之一。

[0005] ②土壤偏碱。东北、西北、华北的一些地区栽培马铃薯常常施用草木灰等碱性肥料，多年累积后土壤逐渐偏碱，造成马铃薯疮痂病逐年加重。

[0006] ③病原菌在土壤中积累。华南地区，由于多年连作也会造成病菌大量积累。

[0007] ④重视程度不够。疮痂病对马铃薯的产量和肉质影响并不大，虽然该病已经成为马铃薯生产的一大障碍，但还未引起人们的足够重视，很多地区对该病还都不甚了解，也成为了马铃薯疮痂病逐年加重的原因。

[0008] 马铃薯疮痂病病菌主要为害块茎，从皮孔侵入，发病初期在块茎表皮产生褐色斑点，以后逐渐扩大，侵染点周围的组织坏死，块茎表面变粗糙，质地木栓化。同时依据病原菌种类的不同，在成熟的薯块上常表现为凸起或凹陷的表面病斑，严重时病斑连片，薯块的品质降低。同时，由于表皮组织被破坏后，易被其他病原菌侵染，造成块茎腐烂，严重影响马铃薯的外观，降低其品质和贮藏周期。

[0009] 利用生物防治土传病害是一种行之有效的防治措施，是植物保护中必不可少的组成部分。特别是利用自然界中原本存在的植物根际有益微生物对靶标病原微生物的拮抗作用，来控制病原微生物的危害，具有较小的环境风险，是一种环境友好的防治技术。随着人们对食品安全、生态安全重视，生物防治是实现现代化农业可持续发展的重要策略之一。

发明内容

[0010] 本发明所要解决的问题是：提供一种能够拮抗马铃薯疮痂病病菌的枯草芽孢杆菌，由此制备的菌肥，从而达到安全、高效抑制马铃薯疮痂病发生的目的。

[0011] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

[0012] 本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JQ-001，简称JQ-001菌株，已于2015年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.11632。

[0013] 本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JQ-001从黑龙江建三江农场连作5年以上水稻根基土壤中分离、纯化以及筛选步骤获得的，采用形态特征、生理生化实验、分子生物学鉴定法以及16SrDNA同源序列比对分析最终确定上述保藏编号的菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

[0014] 一种枯草芽孢杆菌菌肥，由枯草芽孢杆菌JQ-001经种子活化、种子培养、发酵培养后制成发酵菌液，然后加入腐植酸、牛粪制成；其中发酵菌液在压滤前优选为添加以下成份：硅藻土、粘结助剂；所述的粘结助剂优选为二氧化硅。

[0015] 一种枯草芽孢杆菌菌肥的制备方法，具体包括：

[0016] a.菌种活化：将低温保存的枯草芽孢杆菌JQ-001菌株接种于固体培养基上，于35-38℃培养34-38h，挑取单菌落转接到斜面培养基上，于35-38℃培养16-24h，用无菌水洗下培养基表面菌体作为接种液；

[0017] b.一级种子液制备：按照5％-10％的接种量向种子培养基中接入步骤a制备的接种液，转速200-260rpm，温度35-38℃，摇床培养16-24h，作为一级种子液；

[0018] c.二级种子液制备：按照0.5％-3％的接种量向种子培养基中接入步骤b制备的一级种子液，通气量为0.4-1.5vvm，搅拌速度为180-260rpm，培养时间为18-24h，作为二级种子液；

[0019] d.发酵培养：按照5％-10％的接种量向发酵培养基中接入步骤c制备的二级种子液，通气量为0.4-1.5vvm，搅拌速度为180rpm-260rpm，培养时间为24h-30h，得到发酵液；

[0020] e.菌肥的制备：将所述发酵菌液经板框压滤并加入腐植酸、牛粪制成菌肥。

[0021] 优选的，步骤e菌肥制备的具体方法为：

[0022] ①将上述发酵培养中得到的发酵菌液先加入硅藻土和粘结助剂，混匀后板框过滤；

[0023] ②根据滤饼含菌量加入总重量的55-75％腐殖酸和20-35％牛粪，混匀；

[0024] ③将上述混合好物料用造粒机造粒，同时喷雾添加10％的发酵菌液粘结造粒；

[0025] ④将造好的颗粒低温烘干。

[0026] 优选的，上述步骤①中加入总重量的3％硅藻土和1％粘结助剂。

[0027] 优选的，上述步骤③加入总重量的10％发酵菌液。

[0028] 优选的，上述步骤④低温烘干温度为70℃。

[0029] 进一步的，本发明还提供了枯草芽孢杆菌菌肥在制备防治马铃薯疮痂病药物中的应用。

[0030] 由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：由本发明提供的枯草芽孢杆菌对马铃薯疮痂病病原菌具有显著抑制作用。由此制备的菌肥在喷施或者施入土壤后，枯草芽孢杆菌能够在作物根际快速繁殖并长期生存，形成优势菌群，从而有效防治马铃薯疮痂病，防治效果达到85％以上，且马铃薯生长健壮，无药害产生，提高产量和质量。同时具有安全高效，无残留，无毒副作用，能够减少化学农药的使用，使常年连作马铃薯产生的土壤问题得到解决，因而在生物防治马铃薯疮痂病中具有重要应用前景，有助于现代农业的集约化生产发展。

附图说明

[0031] 下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

[0032] 图1是本发明的枯草芽孢杆菌显微形态及菌落形态；

[0033] 图2是本发明的枯草芽孢杆菌的16SrDNA同源序列比对分析树状图；

[0034] 图3是本发明的枯草芽孢杆菌拮抗效果测定结果。

[0035] 图中，图1：A为枯草芽孢杆菌显微形态；

[0036] B为枯草芽孢杆菌菌落形态。

[0037] 图3：A为JQ-001菌株0.1、0.5、1.0亿/ml菌量对疮痂病抑制效果；

[0038] B为JQ-001菌株1.5、2.0、2.5亿/ml菌量对疮痂病抑制效果；

[0039] C为JQ-001菌株3.0、3.5、4.0亿/ml菌量对疮痂病抑制效果；

[0040] 图中CK为对照。

具体实施方式

[0041] 下面结合附图和实施例，进一步阐述本发明：

[0042] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用实验材料，如无特殊说明，均为商店购买的常规生化制剂。以下实施例中的定量试验，菌设置三次重复试验，结果取平均值。

[0043] 实施例1：枯草芽孢杆菌JQ-001菌株的获得、鉴定和保藏

[0044] 一、枯草芽孢杆菌JQ-001菌株的获得：

[0045] 本发明的枯草芽孢杆菌是从黑龙江农垦建三江水稻根际土壤中采用土壤稀释分离法分离获得，分离方法为：

[0046] 1、土样采集：在水稻正常生长期内，挖出水稻根，取根上连带土壤，一个地点采几个样本，混合粗筛后，取200g左右作分离用；

[0047] 2、培养基平板制备：将NA培养基和LB培养基融化，分别倒入灭菌培养皿，冷却凝固后制成NA和LB平板；

[0048] 3、称取1g土样于带玻璃珠，装有100ml灭菌水的250ml锥形瓶中，摇床振荡均匀，制成10—2倍土壤悬浮液，然后按10倍梯度稀释至10-7倍；

[0049] 4、分别取上述稀释至各个梯度浓度土壤悬浮液0.1ml，加入到培养基平板上，用玻璃涂布棒涂布均匀，每个梯度涂三个板，置于37℃恒温培养箱中培养1-2d；

[0050] 5、挑取培养获得的单菌落在NA培养基上划线再次得到单菌落，转移至NA试管鞋面培养基中，37℃恒温培养箱中培养12-24h；

[0051] 6、以马铃薯疮痂病病原菌为靶标菌，采用平板单菌落对峙培养法，筛选到一株对疮痂病病原菌具有较强抑制活性的菌株，编号为JQ—001；

[0052] 所述NA培养基为北京陆桥公司生产的营养琼脂成品培养基；LB培养基配方为蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl10g、琼脂粉16g、蒸馏水1000ml、pH7.0、121℃灭菌30min。

[0053] 二、枯草芽孢杆菌JQ-001菌株的鉴定

[0054] 1、枯草芽孢杆菌JQ-001菌株的菌落形态及显微形态见图1。

[0055] 2、微生物学特性：菌株在NA培养基，37℃环境下，培养12-18h后，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，扁平干燥无光泽，边缘不整齐，不产生色素。菌株杆状、具周生鞭毛，革兰氏染色呈阳性，好氧。

[0056] 3、分子生物学特性：16SrRNA基因序列测定结果(见序列表)，将JQ-001菌株的16SrDNA扩增序列在NCBI数据库中比对，与Bacillus subtilis同源性为99.38％，结合JQ-
001菌株的形态特征、生理生化特征，确定JQ-001菌株属于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，以16SrDNA序列为基础的JQ-001菌株系统发育树如图2(图中菌种1即为JQ-001菌株)所示。

[0057] 三、JQ-001菌株的保藏

[0058] 经过鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。枯草芽孢杆菌JQ-001，简称JQ-001菌株，已于2015年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.11632。

[0059] 实施例2：JQ—001菌株拮抗效果测定

[0060] 固体培养基：NA培养基、高氏一号培养基:可溶性淀粉20g、KNO3 1g、NaCl 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4 0.5g、FeSO4 0.01g琼脂粉16g、蒸馏水1000ml、pH7.4，配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其它成分，融化后，补足水分至1000ml，然后用100ml锥形瓶平均分装13瓶，121℃灭菌30min。

[0061] 液体培养基(枯草发酵培养基)：葡萄糖20g、玉米浆干粉5g、蛋白胨1g、酵母粉0.5g、MnSO420ml、MgSO410ml、自来水500ml、pH7.5，121℃灭菌30min。

[0062] 一、实验方法：采用平板对峙培养法

[0063] 1、马铃薯疮痂病病原菌分离纯化培养

[0064] 取样地点：河北省张北县大囫囵村大田内。

[0065] 用刀片取发病马铃薯块茎的病健交界处，先用升汞及酒精进行杀菌消毒处理后，接入高氏一号培养基中，每个培养皿内接入4块，在25℃恒温培养箱中培养6天后用打孔器取长病菌板进行纯化培养，备用。

[0066] 2、枯草芽孢杆菌JQ-001发酵液的制备

[0067] 将保存在斜面上的菌种用接种环接入营养琼脂平板上划线培养，37℃恒温培养24h活化。将活化的菌株接入装有50ml发酵培养基的500ml三角瓶中，在34℃、230r/min条件下，摇床振荡培养25h，制备菌种发酵液，待其完全产芽孢后，测定发酵液中活菌数量为100亿/ml。

[0068] 3、发酵液处理

[0069] 将测定好活菌数量的发酵液稀释成0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0亿/毫升菌量，用1ml移液枪分别取各个浓度菌液3ml与灭菌并冷却至45℃熔融态的高氏一号培养基(此培养基用100ml锥形瓶定量分装75ml)按1:25比例混匀，制成带菌平板，平均每板含有1ml菌液；以不接种枯草芽孢杆菌JQ-001的发酵液与培养基混匀倒成的平板为对照。在平板中接入预先培养的马铃薯疮痂病病菌，用直径5mm的打孔器打出菌块，接入凝固的培养皿内，每平板均匀接种两块，每处理重复3次。25℃恒温箱中倒扣培养6天。

[0070] 4、试验数据处理

[0071] 待对照菌丝长满板时，拍照记录，观察菌体长势情况并采用十字交叉法测量菌落直径，抑菌圈直径，计算平均值和相对抑菌率，记录菌落直径大小，比较不同菌量对马铃薯疮痂病的抑制效果，按照下列公式计算抑菌率。(见图3)

[0072] 抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％

[0073] 5、结果展示

[0074] 表1枯草芽孢杆菌JQ-001拮抗实验结果

[0075]

[0076] 实施例3：枯草芽孢杆菌JQ—001微生物菌肥的制备和应用

[0077] 一、菌肥的制备

[0078] 1、枯草芽孢杆菌菌种的活化

[0079] 将保存在-20℃冰箱中的菌种接种到NA培养基试管内，37℃恒温培养24h；

[0080] 2、一级种子的制备

[0081] 配制适量NA培养基，用两个茄形瓶分装，高压灭菌完成后，取出斜置，制成斜面培养基，接入活化后的枯草芽孢杆菌JQ-001，37℃恒温培养箱中培养2d；

[0082] 3、二级种子的制备

[0083] 经茄形瓶培养后的菌种再接入到含有发酵培养基的种子罐中培养，培养条件为温度37℃，通气量30m3/h、种子罐转速为175r/min，培养16h；种子罐培养基组合如下：酵母粉0.3％，蛋白胨1％,氯化钠0.5％，葡萄糖1％，其余为水。将摇床培养的种子培养基按5％比例接入500L种子罐，37℃,180r/min，通气比1:1.5，培养24h。上述百分数均为质量百分比。

[0084] 4、将培养好的种子按5％接种量接种到发酵罐中，发酵罐培养基组成如下：玉米粉3％，豆粕1％，葡萄糖0.5％，酵母膏0.5％，葡萄糖0.5％，硫酸镁0.02％，其余为水。121℃灭菌30分钟，降温至37℃时接二级种子，96r/min，37℃恒温培养16-20h至开始产芽孢为止，即得浓度为100亿/毫升菌液。将菌液浓缩干燥可制得干粉。上述百分数均为质量百分比。

[0085] 5、含菌量检测

[0086] 采用稀释平板法检测发酵完成的含菌量；

[0087] 6、原料混配

[0088] 将步骤4中得到的发酵菌液加入总重量占比3％硅藻土和1％粘结助剂二氧化硅，搅拌混合均匀。混匀后采用板框压滤，得到水分含量不高于30％的滤饼。根据滤饼含菌量加入总重量占比的65％腐殖酸、28％牛粪，得到每克含菌量大于2亿的混合好物料。

[0089] 7、圆盘造粒

[0090] 将步骤6混合好的物料上圆盘造粒机造粒，同时喷雾添加总重量占比10％的发酵菌液粘结造粒；

[0091] 8、低温烘干

[0092] 采用蒸汽加热造粒滚筒夹套至70℃，通过引风机将水汽带出，烘干水分至20％以下。

[0093] 9、分装

[0094] 将检验达标后的成品加入自动包装设备，按市场需求分装成袋，即为产品。

[0095] 二、菌肥的大田试验

[0096] 1、颗粒肥的试验：在河北河北省张北县大囫囵村，海拔1600-1800米，土壤为沙质土壤，有机质1.15％-1.35％。连作5年且疮痂病发病严重的马铃薯地块进行大田试验。试验2
设置三组，每组包括三个重复处理，每个重复处理为20m的马铃薯地块。

[0097] 第一组(对照组)：平行对照处理。

[0098] 第二组(试验组)：2013年3月12日，每平米施加150克菌肥作为底肥一次性施入；

[0099] 第三组(试验组)：2013年3月12日，每平米施加150克普通农家肥作为底肥一次性施入。

[0100] 2013年6月3日，收获马铃薯，调查每组发病率并统计产量。

[0101] 每组分别统计总薯块数和发病薯块数量，计算发病率，生防率和产量。

[0102] 发病率＝发病薯块数量/总薯块数量×100％

[0103] 2、结果展示：

[0104] 生防率＝(对照组发病率-试验组发病率)/对照组发病率×100％。

[0105] 表2菌肥防治实验中发病率结果

[0106]处理组 总薯块数 发病块数 发病率
对照组 289 167 57.79％
处理组一 291 71 24.40％
处理组二 274 53 19.34％
处理组三 276 18 6.52％

[0107] 表3菌肥平均病害指数和平均防治效果

[0108]处理组 平均病害指数(％) 平均防治效果(％)
第一组 24.40 57.78
第二组 19.34 66.53
第三组 6.52 88.72

[0109] 结果表明，本发明提供的枯草芽孢杆菌JQ-001菌肥能够显著降低马铃薯疮痂病的发病率，对马铃薯疮痂病的生防率达到88％以上，最终起到了显著提高了马铃薯的品质和保证其储存的时间。