一种具有抗菌活性的非蛋白质氨基酸及其制备方法

摘要

本发明涉及一种具有抗菌活性的非蛋白质氨基酸及其制备方法，所述非蛋白质氨基酸为7?amino?4?hydroxyoct?2?enoic acid，分子式为C8H15NO3，结构式如下：。本发明制备的非蛋白质氨基酸对枯草芽孢杆菌有较好的抑制作用，可以利用菌株Paecilomyces gunnii发酵制得，培养基原料来源广泛，制备方法简单，容易实现工业化生产。

权利要求

1.一种具有抗菌活性的非蛋白质氨基酸，其特征在于：所述非蛋白质氨基酸为7-amino-4-hydroxyoct-2-enoic acid，分子式为C8H15NO3，结构式如下：。

2.一种如权利要求1所述的非蛋白质氨基酸的制备方法，其特征在于：通过发酵培养古尼拟青霉Paecilomyces gunnii，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化出该化合物或该化合物前体，再将化合物前体进行酸解或碱解得到所述的非蛋白质氨基酸。

3.一种如权利要求1所述具有抗菌活性的非蛋白质氨基酸的前体，其特征在于：所述化合物前体分子式为C20H30N4O5，结构式如下：。

4.如权利要求1所述的非蛋白质氨基酸在制备抗菌药物中的用途。

说明书

一种具有抗菌活性的非蛋白质氨基酸及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种具有抗菌活性的非蛋白质氨基酸及其制备方法，属于生物医药领域。

背景技术

[0002] 大型真菌不但具有丰富的营养价值，也可产生丰富的药用活性物质，如具有抗细菌、促进神经生长因子合成、酶抑制剂、抗真菌、细胞毒、受体拮抗剂和抗氧化等多种生物活性多糖类、多肽、抗生素类、抗肿瘤等活性。大型真菌中具有抗菌活性的天然产物主要是倍半萜、二萜糖苷和多炔类等化合物。Agrocybolacton 是从田蘑分离的drimane 型骨架倍半萜，对革兰氏阳性菌具有抑制作用。Illudin M 和 illudin S是从杯伞分离的倍半萜，它们对Staphylococcus aureus、Klebsiella pneumoniae、Mycobacterium tuberculosis 和Mycobacterium smega 等病原菌的MIC 值都在10 μg/mL以下。从猴头菌菌丝体分离的二萜糖苷erinacine E可抑制耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌 (MRSA)，MIC 值为62.5 μM。Diatrenenitrile 是从Clitocybe diatreta 分离的三炔类化合物，对Micrococcus pyogenes有较强的抑制作用，MIC 值仅为0.1 μg/mL。Cinnatriacetin A和cinnatriacetin B 是从牛舌菌子实体分离的三炔类化合物具有抗细菌活性。因此大型真菌是抗菌活性物质的重要来源。古尼拟青霉是古尼虫草的无性型真菌，具有许多重要的生物活性。细菌性病害是人类健康的主要威胁，寻找安全有效的抗菌药物是人类长期的目标。基于以上背景，开展本发明的研究。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一种具有抗菌活性的非蛋白质氨基酸及其制备方法。

[0004] 本发明的另一目的在于将该非蛋白质氨基酸作为抗菌药物。

[0005] 一种具有抗菌活性的非蛋白质氨基酸，所述非蛋白质氨基酸为7-amino-4-hydroxyoct-2-enoic acid，分子式为C8H15NO3，结构式如下：
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[0006] 所述具有抗菌活性的非蛋白质氨基酸的前体，所述化合物前体分子式为C20H30N4O5，结构式如下：
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[0007] 本发明所述结构新颖的非蛋白质氨基酸制备方法包括：1) 真菌液体发酵：将真菌古尼拟青霉(Paecilomyces gunnii）（参考文献: 古尼拟青霉液体发酵液有机粗提物产量的研究，生物技术，2012，22（1）：88-89）斜面菌种活化后，进行液体深层发酵，培养基配方按重量比为：马铃薯5-40%，葡萄糖1-5%，蛋白胨0.1-3%，余量为水，于0.1 Mpa和121 ℃灭菌30 min。采用恒温摇床或各式发酵罐进行液体发酵，温度设置23-30 ℃，发酵时间4-15天；
2) 发酵产物处理：液体发酵结束后，除去菌丝体的发酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液经脱水、浓缩，得到有机粗提物浸膏；
3) 所述的非蛋白质氨基酸前体的分离：将2)所述的有机粗提物浸膏用甲醇溶解，进行反相硅胶柱层析，用甲醇或丙酮浓度为10-50%的不同梯度甲醇或丙酮水为洗脱剂，将含有目标组分的洗脱液浓缩得到亚组分。用甲醇将亚组分溶解，进行凝胶柱层析，用丙酮或甲醇溶液洗脱，分管收集，将含有所述的非蛋白质氨基酸前体组分的洗脱液合并，接着进行正相硅胶柱层析，以氯仿装柱，干法上样，用含有甲醇体积比为1-10%的氯仿溶剂洗脱，得到含有所述的非蛋白质氨基酸前体组分。

[0008] 4) 所述的非蛋白质氨基酸的制备：将3)制备所得的非蛋白质氨基酸前体用酸或碱进行降解，再进行色谱分离纯化得到所述的非蛋白质氨基酸。

[0009] 5) 所述的非蛋白质氨基酸在抗菌方面上的应用。

[0010] 本发明制备的非蛋白质氨基酸对枯草芽孢杆菌有较好的抑制作用，可以利用菌株Paecilomyces gunnii发酵制得，培养基原料来源广泛，制备方法简单，容易实现工业化生产。

附图说明

[0011] 图1 所述化合物前体的化学结构。

[0012] 图2 所述化合物前体的立体结构。

[0013] 图3 所述化合物7-amino-4-hydroxyoct-2-enoic acid的化学结构。

[0014] 图4 所述化合物的抗菌活性。其中1、2、3、4、5、6表示所述化合物的浓度分别为0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0.025 μg/uL；7、8、9、10分别表示甲醇（10 μL/孔）、青霉素（0.02 μg/uL）、赖氨酸（8 μg/uL）、接10 uL菌液的培养基；11为不接菌的培养基。

具体实施方式

[0015] 以下实施例将对本发明作进一步说明。

[0016] 实施例1将真菌古尼拟青霉(Paecilomyces gunnii）斜面菌种接种于装有150 mL马铃薯液体培养基的三角瓶中活化，活化条件为转速230 r/min，培养温度28℃，培养时间6天，再进行大批量的液体发酵30 L，采用培养基配方为：每升水中含马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，pH自然，0.1 Mpa,121℃灭菌3 0min，置于28 ℃，230 r/min恒温摇床中培养。发酵11天后，用离心法将菌丝体与发酵液分离。发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，所得萃取物用无水硫酸钠脱水，再用旋转蒸发仪于40℃条件下真空浓缩，得到有机粗提物浸膏（6.34 g）。

[0017] 将上一步骤中得到的有机粗提物浸膏（6.34 g），用甲醇溶解，进行反相硅（170 g)柱层析，用30%甲醇水洗脱2 L，流速为15 mL/min，每管收集280 mL，用旋转蒸发仪真空浓缩后，分别取样进行薄层层析分析合并（展开剂为氯仿：甲醇＝10：1，显色剂为碘、10%硫酸乙醇或碘化铋钾），得到含有目标化合物前体的组分（852.3 mg）。

[0018] 从上一步骤得到的组分（852.3 mg），用适量甲醇溶解，进行凝胶(120g，Sephadex LH-20)柱层析，甲醇洗脱，流速约为12 s/drop，每管收集4 mL，根据薄层层析检测合并得到含有目标化合物前体的组分(213.6 mg)。

[0019] 从上一步骤得到的组分(213.6 mg)，用适量丙酮溶解，进行凝胶(120 g，Sephadex LH-20)柱层析，丙酮洗脱，流速约为12 s/drop，每管收集4 mL，根据薄层层析检测合并得到目标化合物前体的组分(61 mg)。

[0020] 从上一步骤得到的组分(61 mg)进行正相硅胶层析（5.2 g 硅胶），氯仿装柱，干法上样，流动相为氯仿：甲醇（60:1），洗脱体积为300 mL，薄层层析检测合并得到目标化合物前体（39.4 mg）。

[0021] 将上一步骤所得的化合物前体，进行核磁共振波谱（1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC、1H－1H COSY和NOESY）、质谱（EI）、高分辨质谱（HREI－MS）、旋光（[α]）、紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）和X射线单晶衍射测定，并确定所述化合物前体结构（图1）。

[0022] 所述的化合物前体，白色，可溶于甲醇，[α] +19.7 (c=0.07，MeOH)；UV-vis(MeOH)，λ/nm：207；HREI MS: 406.2202（[M +]，C20H30N4O5; calc. 406.2216)；IR (KBr) νmax：3428, 2925, 2855, 1720，1384 cm-1；其单晶熔点为197-200 ℃. 结合1H和13C NMR谱数据(表1)确定化合物的分子式为C20H30N4O5。分析1H和13C NMR 以及DEPT谱，表明所述的化合物前体含有3个甲基，4个亚甲基，7个次甲基（其中4个连氮或氧，2个为烯碳），6个季碳（其中3个酰氨基，2个为烯碳）。根据C5(δC 164.4s)，C13(δC 170.6s), C15(δC 165.7s)，和C2(δC 97.8s)的化学位移值，以及在单晶衍射中测得N3-C5 (1.354 Å)，N12-C13 (1.329 Å)，N16-C15 (1.365 Å)和N1-C2 (1.464 Å)的键长，以及在红外光谱中观测到1384 cm-1的红外吸收，可以推测出所述化合物前体含有三个酰氨基团。根据从HMBC实验中观察到甲基H320与
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C3/C2，H19与C13/14/3/2和H14与C19/C14a/C18a/C13的碳氢远程相关，和从 H-H COSY 实验中观察到的H19与H14之间的氢氢相关，以及C14a (δC 97.0s)和C18a (δC 164.1s)的化学位移值可以推测出化合物的一个结构片段1a(C3/C2/C19/C14/C13/C14a/C18a) (图1)。同样根据从HMBC实验中观察到甲基H322与C11/C10，H6/7与C5/8和H10与C11的碳氢远程相关，
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和从H- H COSY 实验中观察到的H10与H11和H8与H9之间的氢氢相关可以推测出化合物的另一个结构片段1b (C5/C6/C7/C8/C9/C10/C22) (图1)。又根据从HMBC实验中观察到的甲基H321与C18的碳氢远程相关，和从1H-1H COSY 实验中观察到的H17与H18之间的氢氢相关可以推测出化合物的另一个结构片段1c(C21/C17/C18) (图1)。综合以上数据，可以推测出所述化合物前体的基本结构(图1)。在室温下，从化合物的甲醇水溶液中可以得到所述化合物前体的单晶，根据 X射线单晶衍射可以得到所述化合物前体的立体构型（图2）。

[0023] 表1 化合物前体的NMR波谱数据（DMSO-d6，500M）取所述化合物前体（10.0 mg）溶于0.5 ml DMSO，置于微型漩涡仪上混匀，在加入30 μL NaOH（浓度为30%）混匀进行反应，反应完进行反相硅胶（30 g)柱层析，用30%甲醇洗脱300 ml，流速控制为15 mL/min，分管收集，每试管取样进行薄层层析，检测合并得到所述化合物(2.1 mg)。

[0024] 将上一步骤所得的化合物，进行质谱（EI）、高分辨质谱（HREI－MS）、旋光（[α]）、紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）和核磁共振波谱（1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC、1H,1H-COSY和NOESY）测定，并确定所述化合物结构（图3）。

[0025] 所述的化合物，白色，可溶于甲醇，[α] －8.9 (c=0.071，MeOH)；UV-vis (MeOH，λ/nm)：205；HREI MS: 173.1050 ([M+], C8H15NO3; calc. 173.1052)；IR (KBr) νmax：3406, 2925, 1563, 1423 cm-1；结合1H和13C NMR谱数据(表2)确定化合物的分子式为C8H15NO3。分析1H和13C NMR 以及DEPT谱，表明化合物含有1个甲基，2个亚甲基，4个次甲基(其中2个烯碳，1个连氧，1个连氮)，1个为酯基碳。从HMBC实验中可观察到甲基H38与C7/C6，H7与C5，H26与C7/C8/C5/C4，H25与C7/C6/C4/C3，H4与C2/C3/C5，H3与C5/C4/C2/C1，以及H2与C4/C1的碳氢远程相关，从1H-1H COSY 实验中可观察到H2与H3，H3与H4，H4与H25，H25与H26，H26与H7，和H7与H38之间的氢氢相关，可以推测出化合物的基本结构。根据H2与H3的藕合常数（J=15.5）可以推测出C2-C3的双键为顺式结构。又由于所述化合物来源于前体，因此其立体型可由前体推测（图3），为(4S,7S,E)-7-amino-4-hydroxyoct-2-enoic acid。

[0026] 表2 化合物7-amino-4-hydroxyoct-2-enoic acid的NMR波谱数据（DMSO-d6，500M）
实施例2
采用96孔板法进行所述化合物的MIC抑菌试验。无菌操作下，在96孔板的每孔中加入
100 μL细菌培养基（1%牛肉膏，1%蛋白胨，0.5%氯化钠，定容至1000 mL ，pH 7.2-7.5，121 ℃ 高压灭菌30 min），10 μL枯草杆菌菌液（含菌数约2.0×106），和10 μL含有不同浓度所述化合物的样品，所述的化合物的终浓度分别0.25、0.2、0.15、0.1、0.05和0.025 μg/μL，设
3个平行，同时设添加10 μL甲醇为溶剂对照，设青霉素为阳性对照(浓度为0.02μg/μL)，另设赖氨酸为阴性对照((浓度为8 μg/μL)，另设液体培养基（1%牛肉膏，1%蛋白胨，0.5%氯化钠，定容至1000 mL ，pH 7.2-7.5）为空白对照。置37 ℃恒温箱内培养24 h， 肉眼观察枯草杆菌生长情况。经观察，所述化合物为0.15 μg/μL时，枯草芽孢杆菌完全不生长(图4)，表明古尼氨酸所述化合物具有抗菌活性，最低抑制浓度为0.87 mM。

[0027] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。