以高良姜素为配体的金属配合物的合成方法及用途

摘要

本发明公开了以高良姜素为配体的金属配合物合成方法及用途，该方法结合与白癜风发病相关的主要金属元素铜、锌、铁和硒，根据高良姜素大π键共轭体系的化学结构特性，通过多种合成反应获得高良姜素Cu（II）、高良姜素Zn（II）、高良姜素Fe（II）和高良姜素Se（Ⅳ）四种金属配合物；采用本发明所述方法获得的高良姜素金属配合物通过体外药效考察对B16细胞增殖、酪氨酸酶活性和黑素合成的作用，结果表明以高良姜素为配体的金属配合物具有抗白癜风活性，有望开发成治疗白癜风的药物。

权利要求

1.一种以高良姜素为配体的金属配合物的合成方法，其特征在于该方法中涉及金属配合物为高良姜素铜、高良姜素锌、高良姜素铁或高良姜素硒，具体操作按下列步骤进行：a、按摩尔比为1:1-5，将金属盐为硝酸铜、氯化铜、醋酸铜、硝酸锌、氯化锌、醋酸锌、氯化亚铁或四氯化硒在水或乙醇中溶解，将高良姜素溶解于溶剂为乙醇、甲醇、二甲基亚砜、乙腈、丙酮、正丁醇、四氢呋喃或氯仿中，反应时间1-72小时，温度20-90℃，不断搅拌，再将金属盐溶液缓缓加入到含有溶剂的高良姜素溶液中，生成沉淀，继续加热回流1-36小时，得到混合溶液；

b、将混合溶液过滤，将沉淀物用水，体积浓度为50%甲醇或60%乙醇，甲醇或乙醇依次进行洗涤，分别洗涤2次，温度50℃烘干至恒重，即得到以高良姜素为配体的金属配合物。

2.一种如权利要求1所述方法获得的以高良姜素为配体的金属配合物在制备抗白癜风药物中的用途。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述金属配合物高良姜素铜、高良姜素锌、高良姜素铁或高良姜素硒中一种或混合后按常规制药方法制成口服或外用制剂。

说明书

以高良姜素为配体的金属配合物的合成方法及用途

技术领域

[0001] 本发明涉及金属配位化合物，特别是以高良姜素为配体的金属配合物；本发明还涉及这种金属配合物的合成方法及其用途。技术背景

[0002] 高良姜素(galangin,3,5,7－三羟基黄酮)是一种天然的黄酮醇类化合物，是姜科植物高良姜(Alpinia officinarum Hance.)的干燥根茎中的主要有效成分，课题组前期研究发现高良姜有效部位具有治疗白癜风的功效(高良姜有效部位在制备治疗白癜风的药物的用途,闫明,霍仕霞,高莉,康雨彤,唐晓琴.专利号：ZL201010122088.6)；并进一步通过分离纯化及合成方法得到高良姜素单体成分，进行药效评价，结果表明高良姜素具有抗白癜风的活性。同时将高良姜素通过官能团转换、酯化等合成方法得到的高良姜素衍生物，经试验表明高良姜素类衍生物具有防治白癜风的作用，而以高良姜素为配体的金属配合物的合成及其药理活性研究尚未有公开的报道。

[0003] 白癜风是一种常见的色素脱失性皮肤病，任何部位都可以发生，好发于颜面部、颈部、腰腹部、骶尾部、胸部、前臂伸面与手背部等，躯干与阴部亦常发生。主要影响美观，给患者造成巨大的精神障碍。微量元素缺失是白癜风的原因之一。目前，在微量元素与白癜风的发病机制研究中，铜、锌、硒、铁研究较多，铜是构成铜依赖性酶的重要成分，对生物体的影响十分广泛。人体血清铜几乎全部与血浆蛋白结合并具有氧化酶活性，故称血清铜氧化酶，铜元素的不足或缺乏，使酪氨酸酶活性降低，影响黑色素的合成代谢，可能是寻常型白癜风的发病机理之一。有报道白癜风患者血清锌降低，在色素形成过程中，某些递氢的氧化酶中均含有锌离子，锌降低可能导致色素形成障碍。硒能刺激免疫球蛋白和抗体的产生而增强机体的抵抗能力，白癜风的发病和诸多因素有关，首先由于遗传素质的个体，在大量的不正常物质和半醌游离基、酚基和色素细胞产生的毒性黑素前身物质等，通过脂质过氧化反应造成色素细胞破坏，然后继发抗体产生引起自身免疫反应最终导致皮肤色素脱失。铁的主要作用是参与血红蛋白的生成，肌体缺铁时常引起血液的改变，长期缺铁易引起白癜风。

[0004] 本发明针对以上报道，研究了四个与白癜风发病关联较大的微量元素，以具有抗白癜风活性的高良姜素为配体与之作用，生成金属配合物，提高疗效，减少毒性，是非常有价值的工作。

[0005] 高良姜素的化学式为C15H10O5，分子量为270，结构式如下：

[0006]

[0007] 高良姜素具有较高的超离域度，完整的大π键共轭体系，强配位的氧原子与合适的空间构型，可作为金属离子良好的配体。

发明内容

[0008] 本发明目的在于，提供一种以高良姜素为配体的金属配合物的合成方法及用途，该方法主要是结合与白癜风发病相关的主要金属元素铜、锌、铁和硒，配合成高良姜素Cu(II)、高良姜素Zn(II)、高良姜素Fe(II)和高良姜素Se(Ⅳ)四种金属配合物；将金属盐为硝酸铜、氯化铜、醋酸铜、硝酸锌、氯化锌、醋酸锌、氯化亚铁或四氯化硒与高良姜素分别溶于溶剂为水、乙醇、甲醇、二甲基亚砜、乙腈、丙酮、正丁醇、四氢呋喃或氯仿任意两种中不断搅拌，再将金属盐水溶液缓缓加入到含有溶剂的高良姜素溶液中，生成沉淀，继续加热回流4小时，将沉淀物用水、50％甲醇、甲醇依次进行洗涤，分别洗涤两次，烘干至恒重，即得到以高良姜素为配体的金属配合物。通过本发明所述方法获得的高良姜素金属配合物通过体外药效考察了对B16细胞增殖、酪氨酸酶活性和黑素合成的作用，结果表明这几种金属配合物具有抗白癜风活性，有望开发成治疗白癜风的药物。

[0009] 本发明所述的一种以高良姜素为配体的金属配合物的合成方法，该方法中涉及金属配合物为高良姜素铜、高良姜素锌、高良姜素铁或高良姜素硒，具体操作按下列步骤进行：

[0010] a、按摩尔比为1:1-5，将金属盐为硝酸铜、氯化铜、醋酸铜、硝酸锌、氯化锌、醋酸锌、氯化亚铁或四氯化硒在水或乙醇中溶解，将高良姜素溶解于溶剂为乙醇、甲醇、二甲基亚砜、乙腈、丙酮、正丁醇、四氢呋喃或氯仿中，反应时间1-72小时，温度20-90℃，不断搅拌，再将金属盐溶液缓缓加入到含有溶剂的高良姜素溶液中，生成沉淀，继续加热回流4小时，得到混合溶液；

[0011] b、将混合溶液过滤，将沉淀物用水，体积浓度为50％甲醇或60％乙醇，甲醇或乙醇依次进行洗涤，分别洗涤两次，温度50℃烘干至恒重，即得到以高良姜素为配体的金属配合物。

[0012] 所述方法获得的以高良姜素为配体的金属配合物在制备抗白癜风药物中的用途。

[0013] 所述金属配合物高良姜素铜、高良姜素锌、高良姜素铁或高良姜素硒单独或者混合后按常规制药方法制成口服或外用制剂。

[0014] 本发明所述的以高良姜素为配体的金属配合物的合成方法，该方法中金属配合物合成时高良姜素的羰基氧和邻苯环上的羟基氧(脱去一个质子)与金属离子配位M，形成六元配合物，金属配合物的结构式为：

[0015]

[0016] 其中，M代表能够接受孤对电子的金属离子；所述的金属离子可以是主族金属离子，或者是过渡金属离子，以及稀土金属离子；本发明选择了四种有利于治疗白癜风的金属离子，同时这几种金属离子也是人体正常生长、发育所需要的，同时不会产生其它毒副作用的。

[0017] 本发明所述的一种以高良姜素为配体的金属配合物的合成方法和用途，采用溶液法，合成步骤如下：

[0018] (1)将摩尔比为1:1-5的金属盐与配体溶于水，或乙醇，或甲醇，或二甲基亚砜，或乙腈，或丙酮，或正丁醇，或四氢呋喃，或氯仿，也可根据具体情况，选择相应的混合溶剂，混合溶液可以是水，或乙醇，或甲醇，或二甲基亚砜，或乙腈，或丙酮，或正丁醇，或四氢呋喃，或氯仿溶液的两种或几种混合，溶液比例视具体试验中溶解情况而定；

[0019] (2)在常温或者加热状态下，进行反应，无需加热的发应在常温下进行，反应较慢的，也可通过加热的方式加快反应的速度，温度设置在20-90℃，反应的时间控制在1-72小时，反应的温度不能超过溶剂的沸点温度，对于易分解的反应物，温度不能过高，必要的情况下，可通过调节反应物的pH值，或者通过避光的方式以增加反应的稳定性。

[0020] (3)将反应后的溶液过滤，取沉淀，用水，或者极性强的有机溶剂，或者极性较弱的有机溶剂进行洗涤出未反应的配体、金属盐以及其它副产物，洗涤后的沉淀，干燥后，进行元素分析等检测，以确认其结构。

[0021] 本发明所述的一种以高良姜素为配体的金属配合物的合成方法和用途，该方法中涉及的高良姜素是通过中国专利201010122088.6方法从植物高良姜根茎中提取分离得到，也可以通过合成的方法制备得到，具体操作按下列步骤进行：

[0022] 以植物高良姜根茎为原料，用50－95％浓度的乙醇提取3次，料液比为10倍，8倍，8倍，提取温度60－80℃，每次时间为2，2，1小时，得到总粗提物；

[0023] 再将总粗提物用体积百分比30-60％乙醇溶解，用大孔树脂、聚酰胺或者葡聚糖凝胶吸附，用体积百分比40％-70％乙醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，即得含高良姜素有效部位，以干品重量计算含总黄酮大于50％，用制备液相色谱仪制备得到高良姜素的含量为20-99.8％；

[0024] 或将步骤a总粗提物用石油醚、乙酸乙酯或氯仿溶剂进行萃取，所得萃取物干燥后得到脂溶性产物，再用体积百分比30-60％乙醇溶解，用大孔树脂、聚酰胺或者葡聚糖凝胶吸附，用体积百分比40％-70％乙醇洗脱，收集洗脱液；将洗脱液减压浓缩，干燥，即得含高良姜素有效部位，以干品重量计算含总黄酮大于50％，用制备液相色谱仪制备得到高良姜素的含量为20-99.8％。

[0025] 本发明所述的一种以高良姜素为配体的金属配合物的合成方法和用途，通过该方法获得的高良姜素金属配合物制备治疗白癜风的药物，是从含有高良姜素的植物中提取、分离、纯化得到高良姜素或者通过合成途径，采用廉价、易得、低毒低污染的原料，经过酯化、官能团转换等方法合成得到高良姜素；然后根据高良姜素大π键共轭体系的化学结构特性，通过多种合成反应获得高良姜素金属配合物，最后将高良姜素金属配合物按常规制药方法制成口服或外用制剂。

[0026] 本发明针对白癜风发病机制，采用相关的药理学实验方法进行了高良姜素金属配合物治疗白癜风的体内外药效实验，分别从酪氨酸酶活性、黑素细胞增殖、黑素含量等方面进行药效研究，说明高良姜素金属配合物在用于治疗白癜风方面的药物用途。

具体实施方式

[0027] 为了进一步阐明本发明，下面以具体实施例对本发明作详细说明，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明具体描述，但不限制本发明的技术方案。

[0028] 实施例1、高良姜素Cu(II)金属配合物

[0029] a、按摩尔比1:1，将硝酸铜1mol溶于50ml水中，将高良姜素1mol溶于50ml乙醇中，反应时间10小时，温度40℃，不断搅拌，再将硝酸铜水溶液缓缓加入到高良姜素乙醇溶液中，生成棕色沉淀，继续加热回流4小时，得到混合溶液；

[0030] b、将混合溶液趁热过滤，将沉淀物用水、体积浓度为50％甲醇和甲醇依次洗涤，分别洗涤2次，温度50℃烘干至恒重，得到棕红色粉末，即得高良姜素-Cu(2:1)配合物。

[0031] 实施例2、高良姜素Cu(II)金属配合物

[0032] a、按摩尔比1:3，将氯化铜1mol溶于50ml水中，将高良姜素3mol溶于50ml甲醇中，反应时间1小时，温度20℃，不断搅拌，再将氯化铜水溶液缓缓加入到高良姜素甲醇溶液中，生成棕色沉淀，继续加热回流4小时，得到混合溶液；

[0033] b、将混合溶液趁热过滤，将沉淀物用水、体积浓度为60％乙醇和乙醇依次洗涤，分别洗涤2次，温度50℃烘干至恒重，得到棕红色粉末，即得高良姜素-Cu(2:1)配合物。

[0034] 实施例3、高良姜素Cu(II)金属配合物

[0035] a、按摩尔比1:5，将醋酸铜1mol溶于50ml水中，高良姜素5mol溶于50ml二甲基亚砜中，反应时间50小时，温度50℃，不断搅拌，再将醋酸铜水溶液缓缓加入到高良姜素二甲基亚砜溶液中，生成棕色沉淀，继续加热回流4小时，得到混合溶液；

[0036] b、将混合溶液趁热过滤，将沉淀物用水、体积浓度为50％甲醇和甲醇依次洗涤，分别洗涤2次，温度50℃烘干至恒重，得到棕红色粉末，即得高良姜素-Cu(2:1)配合物。

[0037] 实施例4高良姜素Zn(II)金属配合物

[0038] a、按摩尔比1:4，将氯化锌1mol溶于40ml水中，将高良姜素4mol溶于40ml丙酮中，反应时间20小时，温度60℃，不断搅拌，将氯化锌水溶液缓缓加入到高良姜素丙酮溶液中，生成棕红色沉淀，继续反应36小时，得到混合溶液；

[0039] b、将混合溶液过滤，将沉淀物用过滤，水、体积浓度为60％乙醇和乙醇依次洗涤，分别洗涤3次，温度50℃烘干至恒重，即得高良姜素-Zn(2:1)配合物。

[0040] 实施例5高良姜素Zn(II)金属配合物

[0041] a、按摩尔比1:4，将硝酸锌1mol溶于40ml水中，将高良姜素4mol溶于40ml正丁醇中，反应时间5小时，温度30℃，不断搅拌，将硝酸锌水溶液缓缓加入到高良姜素正丁甲醇溶液中，生成棕红色沉淀，继续反应36小时，得到混合溶液；

[0042] b、将混合溶液过滤，将沉淀物用过滤，水、体积浓度为50％甲醇和甲醇依次洗涤，分别洗涤3次，温度50℃烘干至恒重，即得高良姜素-Zn(2:1)配合物。

[0043] 实施例6高良姜素Zn(II)金属配合物

[0044] a、按摩尔比1:1，将醋酸锌1mol溶于40ml水中，将高良姜素1mol溶于40ml氯仿中，反应时间72小时，温度50℃，不断搅拌，将醋酸锌水溶液缓缓加入到高良姜素氯仿溶液中，生成棕红色沉淀，继续反应36小时，得到混合溶液；

[0045] b、将混合溶液过滤，将沉淀物用过滤，水、体积浓度为50％甲醇和乙醇依次洗涤，分别洗涤3次，温度50℃烘干至恒重，即得高良姜素-Zn(2:1)配合物。

[0046] 实施例7高良姜素Fe(II)金属配合物

[0047] a、按摩尔比1:2，将氯化亚铁1mol溶于40ml乙醇中，将高良姜素2mol溶于40ml甲醇中，反应时间40小时，温度80℃条件下，不断搅拌，将氯化亚铁溶液缓缓加入到高良姜素甲醇溶液中，生成黄绿沉淀，继续加热回流1小时，得到混合溶液；

[0048] b、将混合溶液趁热过滤，将沉淀物用体积浓度为60％乙醇和乙醇依次洗涤，分别洗涤2次，温度60℃烘干至恒重，即得高良姜素-Fe(2:1)配合物。

[0049] 实施例8高良姜素Se(Ⅳ)金属配合物

[0050] a、按摩尔比1:5，将四氯化硒1mol溶于60ml水中，将高良姜素5mol溶于40ml乙醇中，常温条件下，不断搅拌，将四氯化硒溶液缓缓加入到高良姜素乙醇溶液中，生成白色沉淀，继续反应72h，得到混合溶液；

[0051] b、将混合溶液过滤，将沉淀物用水、体积浓度为80％乙醇和甲醇依次洗涤，分别洗涤3次，温度45℃烘干至恒重，即得高良姜素-Se(4:1)配合物。

[0052] 实施例9

[0053] 高良姜素金属配合物体抗白癜风体外药效试验:

[0054] 1试验材料本实验常规材料。

[0055] 2.实验方法：

[0056] 2.1MTT比色法测定细胞增殖:

[0057] 选择对数生长期的细胞，0.25％胰酶消化，收集并调整细胞浓度为2×104/ml，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，置37℃、5％CO2孵箱培养。待细胞贴壁后弃去培养基后，分别加入终浓度为10、5、1、0.5、0.25μmol/L含高良姜素铜、高良姜素锌、高良姜素铁、高良姜素硒和阳性药8-MOP培养液200μL，继续培养48h。于结束前4h，每孔加入5mg/mL的MTT20μL，继续培养4h后弃去上清液，加入DMSO150μL/孔，震荡10min，使结晶完全溶解，立即于酶标仪490nm处测定吸收值(OD)。每一浓度设4个复孔,取平均值,实验重复3次。增殖率(％)＝加药组OD/空白组OD×100％。

[0058] 2.2酶学方法测定酪氨酸酶活性:

[0059] 选择对数生长期的细胞，0.25％胰酶消化，收集并调整细胞浓度为2×104/ml，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，置37℃、5％CO2孵箱培养。待细胞贴壁后弃去培养基后，分别加入终浓度为10、5、1、0.5、0.25μmol/L含高良姜素铜、高良姜素锌、高良姜素铁、高良姜素硒和阳性药8-MOP培养液200μL，继续培养48h后弃培养液。用PBS洗涤2次,每孔加入1％TritonX-100溶液50μl,迅速置-80℃冻存30min,随后室温融化使细胞完全裂解,37℃预温后加入0.25％L-DOPA溶液10μl,置37℃电热恒温水槽中反应2h，于酶标仪490nm处测定吸收值。每一浓度设4个复孔,取平均值。激活率(％)＝加药组OD/空白组OD×100％。

[0060] 2.3NaOH裂解法测定黑素含量:

[0061] 选择对数生长期的细胞，0.25％胰酶消化，收集并调整细胞浓度为2×104/ml，接种于24孔细胞培养板中，每孔1ml，置37℃、5％CO2孵箱培养。待细胞贴壁后弃去培养基后，加入终浓度为10、5、1、0.5、0.25μmol/L的含高良姜素铜、高良姜素锌、高良姜素铁、高良姜素硒和阳性药8-MOP培养液，每孔1ml,对照不加。继续培养48h，用0.25％胰蛋白酶消化，将细胞收集入离心管3000r/min离心10min倾去上清，再用PBS洗2次后,用1mol/LNaOH0.5ml在37℃作用48h充分碱裂解细胞和溶解黑素颗粒。100μl/孔加入96孔板中，用酶标仪测定
405nm光吸收值，每一浓度设4个复孔,取平均值。黑素含量(％)＝加药组OD/空白组OD×
100％。

[0062] 2.4统计学处理：

[0063] 两组间差异用T检验分析；实验结果以 表示，组间差异的显著性检验以P<0.05为差异有显著性，P<0.01为差异有极显著性。

[0064] 3.实验结果

[0065] 3.2高良姜素金属配合物对细胞增殖的影响：

[0066] 与空白对照组相比，四个高良姜素金属配合物均对B16细胞有不同程度的促增殖作用，但有效给药浓度不同，高良姜素铜在1-5μmol·L-1浓度范围内作用显著(P<0.01)；高良姜素锌在0.5-5μmol·L-1浓度范围内差异显著(P<0.01)；高良姜素铁在0.25-5μmol·L-1浓度范围内作用显著(P<0.01)；高良姜素硒在0.25-5μmol·L-1浓度范围作用均较强(P<0.01)，而且在相同浓度下，高良姜素硒促增殖的作用最大，结果见表1：

[0067] 表1高良姜素金属配合物对B16细胞增殖的影响( n＝4)

[0068]

[0069] 与空白对照组比较*P<0.05**P<0.01

[0070] 3.3高良姜素金属配合物对酪氨酸酶活性的影响：

[0071] 与空白对照相比，高良姜素金属配合物均对酪氨酸酶活性均有不同程度的上调作用，其中高良姜素铜、锌金属配合物给药浓度为0.5μmol·L-1时有显著性差异(P<0.05,P<0.01)，高良姜素铁、硒金属配合物给药浓度为0.5-1μmol·L-1范围内有显著的上调作用(P<
0.05,P<0.01)，且相同浓度下，高良姜素硒的上调作用最强。结果见表2：

[0072] 表2高良姜素金属配合物对B16细胞的酪氨酸酶的影响( n＝4)