柚皮素对映体的模拟移动床色谱拆分方法

摘要

本发明提供了一种柚皮素对映体的模拟移动床色谱拆分方法，所述的拆分方法为：以表面涂敷了直链淀粉?三(3,5?二甲基苯基氨基甲酸脂)的球形硅胶作为手性固定相，甲醇作为流动相，将柚皮素对映体用甲醇溶解，得到样品液，所得样品液经模拟移动床色谱拆分，分别得到单一构型的S?(?)?柚皮素和R?(+)?柚皮素；本发明采用模拟移动床色谱系统，从柚皮素外消旋体中拆分出具有光学纯度的柚皮素单一对映体，工艺简单，生产连续自动化，产品质量稳定，溶剂采用甲醇，可回收利用，无污染，真正实现了清洁生产。

权利要求

1.一种柚皮素对映体的模拟移动床色谱拆分方法，其特征在于，所述的拆分方法包括如下步骤：(1)配制柚皮素对映体样品液：将柚皮素对映体用甲醇溶解，得到样品液，所得样品液中柚皮素对映体的浓度为5～80g/L；

(2)模拟移动床色谱拆分柚皮素对映体：

以粒度为5～75um表面涂敷了直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸脂)的球形硅胶作为手性固定相，甲醇作为流动相；

色谱系统主要由：设有洗脱泵的洗脱液入口、设有萃取泵的萃取液出口、设有进样泵的样品液入口、设有萃余泵的萃余液出口、设有检测器的洗脱液出口和4～24根色谱柱组成，分成I、II、III、IV四个区，每区有1～6根柱子，其中I区位于洗脱液入口与萃取液出口之间，II区位于萃取液出口与样品液入口之间，III区位于样品液入口与萃余液出口之间，IV区位于萃余液出口与洗脱液出口之间；

将步骤(1)配制的样品液和洗脱液甲醇分别从样品液入口和洗脱液入口通过进样泵和洗脱泵注入色谱系统，样品液入口、洗脱液入口、萃取液出口、萃余液出口同时沿洗脱液流动方向定期切换至下一根色谱柱，含有S-(-)-柚皮素的萃取液和含有R-(+)-柚皮素的萃余液分别从萃取液出口和萃余液出口流出系统，收集萃取液和萃余液，各自经浓缩、干燥，分别得到单一构型的S-(-)-柚皮素和R-(+)-柚皮素；

拆分操作的参数条件为：样品液流速1～10mL/min，洗脱液流速1～100mL/min，萃取液流速1～50mL/min，萃余液流速1～50mL/min，切换时间间隔1～10min。

2.如权利要求1所述的拆分方法，其特征在于，所述的模拟移动床色谱系统的操作温度为10～40℃。

3.如权利要求1所述的拆分方法，其特征在于，所述拆分操作的参数条件为：样品液流速2～8mL/min，洗脱液流速5～80mL/min，萃取液流速3～40mL/min，萃余液流速3～40mL/min，切换时间间隔2～8min。

4.如权利要求1所述的拆分方法，其特征在于，所述拆分操作的参数条件为：样品液流速2～6mL/min，洗脱液流速5～50mL/min，萃取液流速5～30mL/min，萃余液流速5～30mL/min，切换时间间隔2～5min。

5.如权利要求1所述的拆分方法，其特征在于，步骤(1)中，所述样品液中柚皮素对映体的浓度为20～40g/L。

6.如权利要求1所述的拆分方法，其特征在于，步骤(2)中，所述表面涂敷了直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸脂)的球形硅胶的粒度为20～40um。

7.如权利要求1所述的拆分方法，其特征在于，步骤(2)中，所述色谱系统中色谱柱为8～16根，每区有2～4根柱子。

说明书

柚皮素对映体的模拟移动床色谱拆分方法

(一)技术领域

[0001] 本发明涉及手性药物的拆分技术，特别涉及一种柚皮素对映体的模拟移动床色谱拆分方法。(二)背景技术

[0002] 柚皮素(别称柚皮苷原；4',5,7-三羟基黄酮；柑橘素)是柚皮甙的甙元，属二氢黄酮类化合物，分子式为C15H12O5，分子量为272.25g/mol，常态下为白色针状晶体，熔点260℃，溶于乙醇、乙醚和苯，几乎不溶于水。分子结构式为：

[0003]

[0004] 柚皮素具有抗菌、抗炎、清除自由基、抗氧化、止咳祛痰、降血脂、抗癌抗肿瘤、解痉和利胆、预防和治疗肝病、抑制血小板凝结、抗粥样动脉硬化等作用，可被广泛地应用于医药、食品等领域(吕爱新,于宏伟,赵志强等.柚皮素研究进展[J].安徽农业科学,2011,39(13):7734-7735.)。

[0005] 柚皮素一般是从天然植物中提取，一种是萃取法，另一种是柚皮苷水解法。柚皮素在化学上可用作分子印迹聚合物的研究；在农药方面是一种环境友好型的新型农药；在临床上可治疗多种疾病，另外其还是一种功能食品添加剂，可以治疗由于人体血液中过多的血液胆固醇和甘油三酯引起的疾病。所以为保证安全用药和降低食品的副作用，拆分柚皮素对映体具有现实意义。现有的拆分柚皮素对映体的方法主要是高效液相色谱法和超临界色谱法。孙亚男等采用高效液相色谱法对柚皮素对映体进行拆分，在chiralpak AD-H色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)上，以正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝75：25：0.1为流动相，在柱温35℃，检测波长290nm的色谱条件下，实现了柚皮素对映体的拆分，但制备量少，溶剂消耗量大(孙亚男,李彤,马辰.高效液相色谱法拆分黄酮类化合物对映体[J].分析测试学报,2013,32(3):346-350.)；Raffaella Gaggeri在超临界色谱上对柚皮素对映体做了拆分，以CO2/methanol(75：25，v/v)作为流动相，流量4.00mL/min，温度30℃，检测波长290nm，采用超临界色谱法生产，柚皮素对映体拆分过程繁琐，系统稳定性差，并且不能实现连续生产(Raffaella Gaggeria,Daniela Rossia,Simona Collina等.Quick development of an analytical enantioselective high performance liquid chromatography separation and preparative scale-up for The flavonoid Naringenin[J].Journal of Chromatography A,2011,1218:5414-5422.)。
(三)发明内容

[0006] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种模拟移动床色谱拆分柚皮素对映体的生产方法，模拟移动床色谱拆分柚皮素对映体是一种可以实现连续化生产、减少溶剂消耗量并提高产率的一种分离方法。

[0007] 本发明采用如下技术方案：

[0008] 一种柚皮素对映体的模拟移动床色谱拆分方法，所述的拆分方法包括如下步骤：

[0009] (1)配制柚皮素对映体样品液：将柚皮素对映体用甲醇溶解，得到样品液，所得样品液中柚皮素对映体的浓度为5～80g/L(优选20～40g/L)；

[0010] (2)模拟移动床色谱拆分柚皮素对映体：

[0011] 以表面涂敷了直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸脂)的球形硅胶作为手性固定相(粒度为5～75um，优选20～40um，可商购获得)，甲醇作为流动相；

[0012] 色谱系统主要由：设有洗脱泵的洗脱液入口、设有萃取泵的萃取液出口、设有进样泵的样品液入口、设有萃余泵的萃余液出口、设有检测器的洗脱液出口和4～24根(优选8～16根)色谱柱组成，分成I、II、III、IV四个区，每区有1～6根(优选2～4根)柱子，其中I区位于洗脱液入口与萃取液出口之间(在此区间实现S-(-)-柚皮素的解吸)，II区位于萃取液出口与样品液入口之间(在此区实现S-(-)-柚皮素反复吸附、解吸、浓缩)，III区位于样品液入口与萃余液出口之间(在此得到R-(+)-柚皮素)，IV区位于萃余液出口与洗脱液出口之间(一方面III区的洗脱液进入到该区可循环利用，另一方面将III区与I区隔开，防止萃余液中的R-(+)-柚皮素进入到I区)；

[0013] 将步骤(1)配制的样品液和洗脱液甲醇分别从样品液入口和洗脱液入口通过进样泵和洗脱泵注入色谱系统，样品液入口、洗脱液入口、萃取液出口、萃余液出口同时沿洗脱液流动方向定期切换至下一根色谱柱，含有S-(-)-柚皮素的萃取液和含有R-(+)-柚皮素的萃余液分别从萃取液出口和萃余液出口流出系统，收集萃取液和萃余液，各自经浓缩、干燥，分别得到单一构型的S-(-)-柚皮素和R-(+)-柚皮素；

[0014] 拆分操作的参数条件为：样品液流速1～10mL/min，洗脱液流速1～100mL/min，萃取液流速1～50mL/min，萃余液流速1～50mL/min，切换时间间隔1～10min。

[0015] 本发明所述的模拟移动床色谱系统的操作温度为10～40℃。

[0016] 优选拆分操作的参数条件为：样品液流速2～8mL/min，洗脱液流速5～80mL/min，萃取液流速3～40mL/min，萃余液流速3～40mL/min，切换时间间隔2～8min。

[0017] 更加优选拆分操作的参数条件为：样品液流速2～6mL/min，洗脱液流速5～50mL/min，萃取液流速5～30mL/min，萃余液流速5～30mL/min，切换时间间隔2～5min。

[0018] 根据本发明模拟移动床色谱拆分方法分离得到单一构型S-(-)-柚皮素和R-(+)-柚皮素，并用高效液相色谱(HPLC)分析检测，纯度≥98％，回收率≥95％。

[0019] 本发明具有如下有益效果：本发明采用模拟移动床色谱系统，从柚皮素外消旋体中拆分出具有光学纯度的柚皮素单一对映体，工艺简单，生产连续自动化，产品质量稳定，溶剂采用甲醇，可回收利用，无污染，真正实现了清洁生产。(四)附图说明

[0020] 图1为本发明的模拟移动床色谱系统结构图。(五)具体实施方式

[0021] 以下通过具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

[0022] 1.设备及条件选择

[0023] 采用模拟移动床色谱系统，该系统包括洗脱泵、进样泵、萃取泵、萃余泵、检测器、色谱柱以及气动阀、单向阀(如图1所示)。样品液和洗脱液分别从样品液入口和洗脱液入口通过进样泵和洗脱泵注入色谱系统，柚皮素两个对映体则分别从萃余液和萃取液两个出口流出系统(如图1箭头所指位置)。每隔一定时间，样品液和洗脱液入口、萃余液和萃取液出口同时沿流动相流动方向切换至下一根色谱柱。

[0024] 2.色谱柱填料及流动相选择

[0025] 色谱柱购自大赛璐药物手性技术(上海)有限公司Chiralpak AD 100*10cm 10um，以表面涂敷了直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸脂)的球形硅胶作为手性固定相，填料粒度为5～75um，微粒越小，粒径分布越窄，越有利于分离；但粒径越小系统压力越大，对模拟移动床系统要求较高。最适宜的粒径范围为20～40um。流动相(洗脱液)为甲醇。

[0026] 3.分离步骤

[0027] 柚皮素外消旋体用流动相(甲醇)溶解，浓度为5g/L～80g/L。色谱系统由4～24根制备柱组成，分为4个区，色谱柱数越多分离越好，但系统的复杂程度也提高，最适合的柱子数目为8～16根。样品溶液和洗脱液依次从进样口和洗脱液入口注入色谱系统，通过模拟移动床色谱系统的控制器，定期控制气动阀的开闭，使洗脱口、进样口、萃取液和萃余液出口沿流动相的方向定期变换，使柚皮素的两个单一对映体从萃取液和萃余液出口流出系统。得到的柚皮素单一对映体溶液，经浓缩、干燥得到高纯度的柚皮素单一对映体。

[0028] 4.成品检测(高效液相色谱)

[0029] 流动相：甲醇

[0030] 流速：1.0mL/min

[0031] 泵：Knauer K501泵

[0032] 色谱柱：4.6×250mm，5um，Chiralpak AD-H柱

[0033] 检测器：Knauer K2500紫外检测器

[0034] 检测波长：290nm

[0035] 下面结合分离实施例进一步说明本发明

[0036] 分离实施例1

[0037] a、操作条件

[0038] 流动相：纯甲醇

[0039] 进样浓度：外消旋体柚皮素浓度20g/L

[0040] 进样液流速：UF＝3.6mL/min

[0041] 洗脱液流速：UD＝12.1mL/min

[0042] 萃余液流速：UR＝6.5mL/min

[0043] 萃取液流速：UE＝7.3mL/min

[0044] 切换时间：TS＝1.6min

[0045] B、成品分析

[0046] 用Chiralpak AD-H柱，紫外检测器，检测波长290nm，流速1.0mL/min，分析萃取液和萃余液组成。萃取液中S-(-)-柚皮素纯度为98.9％，萃余液中R-(+)-柚皮素纯度为99.3％。每公斤固定相每天可生产S-(-)-柚皮素和R-(+)-柚皮素各1.3kg和1.6kg，回收率为96.2％和97.3％。

[0047] 分离实施例2

[0048] a、操作条件

[0049] 流动相：纯甲醇

[0050] 进样浓度：外消旋体柚皮素浓度40g/L

[0051] 进样液流速：UF＝3.1mL/min

[0052] 洗脱液流速：UD＝15.2mL/min

[0053] 萃余液流速：UR＝7.5mL/min

[0054] 萃取液流速：UE＝9.2mL/min

[0055] 切换时间：TS＝1.2min

[0056] b成品分析

[0057] 用Chiralpak AD-H柱，紫外检测器，检测波长290nm，流速1.0mL/min,分析萃取液和萃余液组成。萃取液中S-(-)-柚皮素纯度为99.1％，萃余液中R-(+)-柚皮素纯度为99.3％。每公斤固定相每天可生产S-(-)-柚皮素和R-(+)-柚皮素各2.4kg和2.6kg，回收率为96.5％和97.2％。

[0058] 上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。