一种β-内酰胺酶抑制剂

摘要

一种β-内酰胺酶抑制剂，可抑制A型(SHV、TEM、CTX)、C型(主要是AmpC酶)和D型(如OXA)β-内酰胺酶，且抑制作用强，与头孢他啶连用可减低头孢他啶的最低抑菌浓度。与他唑巴坦相比，本发明提供的产品半衰期明显比他唑巴坦长，部分产品比阿维巴坦钠的半衰期还长，本发明提供的化合物为抗生素的发展提供了更多的可能。

权利要求

1.一种β-内酰胺酶抑制剂，其结构如式(Ⅰ)所示：其中：R1是氢或甲基；

R2选自氢、取代氧基、氨基、环氨基、饱和或不饱和烃基中的一种；

所述取代氧基为甲氧基或乙氧基；

所述环氨基为哌啶基、四氢吡咯基；

所述饱和烃基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基或环己基；

所述不饱和烃基为丙烯基、苄基、对甲基苄基或芳基；

R3为：

2.如权利要求1所述的β-内酰胺酶抑制剂，其特征在于：所述的R1是氢，R2是甲基、甲氧基或正丙基。

3.如权利要求1所述的β-内酰胺酶抑制剂，其特征在于：所述的R1是氢，R2是氢或哌啶基。

4.如权利要求1所述的β-内酰胺酶抑制剂，其特征在于：所述的R1是甲基，R2是甲基或正丙基。

5.如权利要求1所述的β-内酰胺酶抑制剂，其特征在于：所述β-内酰胺酶抑制剂是由下述式(Ⅱ)所述化合物和碱性氨基酸反应制得的，式(Ⅱ)化合物的结构式为其中：R1是氢或甲基；

R2选自氢、取代氧基、氨基、环氨基、饱和或不饱和烃基中的一种；

所述取代氧基为甲氧基或乙氧基；

所述环氨基为哌啶基、四氢吡咯基；

所述饱和烃基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基或环己基；

所述不饱和烃基为丙烯基、苄基、对甲基苄基或芳基。

6.如权利要求5所述的β-内酰胺酶抑制剂的制备方法，其特征在于以式(II)化合物为原料，在三乙胺(TEA)存在条件下与吡啶三氧化硫络合物(Py·SO3)反应生成的硫酸单酯中间体，与碱性氨基酸溶液反应生成化合物(I)沉淀。

7.如权利要求5所述的β-内酰胺酶抑制剂的制备方法，其特征在于所述碱性氨基酸为组氨酸、赖氨酸或精氨酸。

8.如权利要求1-4任一所述的β-内酰胺酶抑制剂与β-内酰胺类抗生素联用，用于制备抗菌治疗中的用作活性成分的药物。

9.以权利要求1-4任一所述的β-内酰胺酶抑制剂和β-内酰胺类药物作为活性成分的药物组合物。

说明书

一种β-内酰胺酶抑制剂

【技术领域】

[0001] 本发明涉及一种酶抑制剂，具体讲涉及一种β-内酰胺酶抑制剂。【背景技术】

[0002] β-内酰胺酶类抗生素是一类在临床上最广泛使用的高效、低毒、广谱的抗感染药物，但由于抗生素耐药性细菌的出现，此类药物疗效已经降低，甚至失效。在革兰氏阴性菌中存在该耐药性的主要原因是β-内酰胺酶的酶在细菌中能够水解β-内酰胺类抗生素，使其失活。细菌能够产生各种β-内酰胺酶，包括青霉素酶、头孢菌素酶、头霉素酶、广谱β-内酰胺酶和超光谱β-内酰胺酶。在β-内酰胺类抗生素被水解之前，可用β-内酰胺酶抑制剂与抗生素联合应用的方法来使抗生素恢复活性。目前可用的β-内酰胺酶抑制剂已不足以应对不断增加的β-内酰胺酶的多样性，因此，需要研制新的β-内酰胺酶抑制剂。【发明内容】

[0003] 本发明的目的在于提针对β-内酰胺酶产生菌的耐药性问题，提供一种β-内酰胺酶抑制剂。

[0004] 本发明提供一种β-内酰胺酶抑制剂，其结构如式(Ⅰ)所示：

[0005]

[0006] 其中：R1是氢或甲基；

[0007] R2选自氢、取代氧基、氨基、环氨基、饱和或不饱和烃基中的一种；

[0008] 所述取代氧基为甲氧基或乙氧基；

[0009] 所述环氨基为哌啶基；

[0010] 所述饱和烃基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基或环己基；

[0011] 所述不饱和烃基为丙烯基、苄基、对甲基苄基或芳基；

[0012] R3为：

[0013]

[0014] 优选的，所述的R1是氢，R2是甲基、甲氧基或正丙基。

[0015] 优选的，所述的R1是氢，R2是氢或哌啶基。

[0016] 优选的，所述的R1是甲基，R2是甲基或正丙基。

[0017] 优选的，所述β-内酰胺酶抑制剂是由下述式(Ⅱ)所述化合物和碱性氨基酸反应制得的，式(Ⅱ)化合物的结构式为：

[0018]

[0019] 其中：R1是氢或甲基；

[0020] R2选自氢、取代氧基、氨基、环氨基、饱和或不饱和烃基中的一种；

[0021] 取代氧基为甲氧基或乙氧基；

[0022] 环氨基为哌啶基；

[0023] 饱和烃基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基或环己基；

[0024] 不饱和烃基为丙烯基、苄基、对甲基苄基或芳基。

[0025] 所述的β-内酰胺酶抑制剂的制备方法，其步骤包括以式(II)所示化合物为原料，在三乙胺(TEA)存在条件下与吡啶三氧化硫络合物(Py·SO3)反应生成的硫酸单酯中间体，与碱性氨基酸溶液反应生成化合物(I)沉淀。优选的，将式(II)所示化合物溶于适当溶剂中，加入适量三乙胺和三氧化硫吡啶络合物，待反应完成后，除去溶剂并将残渣溶解，加入碱性氨基酸的溶液，静置并降温，收集沉淀并洗涤干燥得到化合物(I)。

[0026] 优选的，所述碱性氨基酸为组氨酸、赖氨酸或精氨酸。

[0027] 本发明还提供了将所述的β-内酰胺酶抑制剂与β-内酰胺类抗生素联用，用于制备抗菌治疗的药物的用途，所述β-内酰胺类抗生素包括青霉烷类、青霉烯类、碳青霉烯类、头孢菌素类、碳头孢烯类、氧头孢烯类、头孢霉素类和单环内酰胺类。

[0028] 本发明还提供了以所述的β-内酰胺酶抑制剂和β-内酰胺类药物作为活性成分的药物组合物。β-内酰胺类包括青霉素类如阿莫西林、氨苄西林、阿洛西林、美洛西林、阿帕西林、海他西林、氨苄西林甲戊酯、羧苄西林、磺苄西林、替卡西林或哌拉西林，头孢菌素类如头孢噻吩、头孢噻啶、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢羟唑、头孢唑林、头孢氨苄、头孢拉定、头孢唑肟、头孢西丁、头孢乙氰或头孢他啶，碳青霉烯类如亚胺培南、美洛培南、比阿培南或帕尼培南，单环内酰胺类如氨曲南和卡芦莫南，以及它们的盐。

[0029] 本发明合成部分的部分优选化合物的化学名称、化学结构如下表所示：

[0030]

[0031]

[0032]

[0033]

[0034]

[0035]

[0036]

[0037]

[0038] 本发明提供的抑酶谱广的β-内酰胺酶抑制剂，可抑制A型(SHV、TEM、CTX)、C型(主要是AmpC酶)和D型(如OXA)β-内酰胺酶，且抑制作用强，与头孢他啶联用可降低头孢他啶的最低抑菌浓度。与他唑巴坦相比，本发明提供的抑制剂其半衰期明显长，部分产品比阿维巴坦钠的半衰期更长。【具体实施方式】

[0039] 下面用实施例对本发明做进一步描述，但本发明的具体实施方式不限于以下实施例。

[0040] 实施例1

[0041] 1-1a化合物(2S,5R)-2-氨基甲酰基-7-氧代-1,6-二氮杂二环[3.2.1]辛-6-基硫酸(S)-1-羧基-2-(1H-咪唑-4-基)-乙铵，分子式C13H20N6O8S，分子量420.11。

[0042] 其制备方法如下：

[0043]

[0044] 将(2S,5R)-6-羟 基-7-氧 代-1,6- 二 氮杂 环[3,2,1] 辛烷 -2-甲 酰 胺10.65g(50mmol)溶于吡啶(35mL)中，加入三乙胺(2.5ml)、吡啶三氧化硫络合物(9.6g)，室温搅拌12h，过滤除去固体并用乙酸乙酯洗涤，合并滤液，除去溶剂。残余物用乙酸乙酯(35ml)溶解，滤去不溶物，加入溶解有组氨酸77.6g(50mmol)的甲醇(12ml)溶液，将混合物置于0℃冰水浴中持续搅拌1h，过滤并用少量乙酸乙酯洗涤沉淀，干燥得1-1a白色粉末
170.5g，产率81％。
1

[0045] H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.76(s,1H),7.45(s,1H),4.42(m,1H),4.01(s,1H),3.66(m,2H),3.48(m,1H),3.03(d,J＝11.5Hz,1H),2.90(d,J＝11.5Hz,1H,d),2.33(m,1H),2.11(m,1H),1.85(m,1H),1.69(m,1H).

[0046] 实施例2

[0047] 1-1b(2S,5R)-2-氨基甲酰基-7-氧代-1,6-二氮杂二环[3.2.1]辛-6-基硫酸(S)-1-羧基-5-氨基-戊铵，分子式C13H25N5O8S，分子量411.43。

[0048] 其制备方法如下：

[0049]

[0050] 将(2S,5R)-6-羟 基-7-氧 代-1,6- 二 氮杂 环[3,2,1] 辛烷 -2-甲 酰 胺92.6g(500mmol)溶于吡啶(350mL)中，加入三乙胺(25.0ml)、吡啶三氧化硫络合物(95.5g)，室温搅拌12h，滤去固体并用乙酸乙酯洗涤，蒸出溶剂。残余物用乙酸乙酯(350ml)溶解，滤去不溶物，加入溶解有赖氨酸73.1g(500mmol)的乙酸乙酯(100ml)溶液，将混合物置于0℃冰水浴中搅拌1h，过滤所得的沉淀用少量乙酸乙酯洗涤，干燥得化合物
1-1b白色粉末166.2g，产率81％。

[0051] 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:6.11(s,2H),4.85(m,1H),4.55(m,1H),3.79–3.68(m,1H),3.34(m,2H),3.06(br,2H),2.69(m,2H),2.24(br,2H),2.24(m,1H),1.98(m,1H),1.77(m,4H),1.52(m,2H),1.25(m,2H).

[0052] 实施例3

[0053] 1-1c(2S,5R)-2-氨基甲酰基-7-氧代-1,6-二氮杂二环[3.2.1]辛-6-基硫酸(S)-1-羧基-4-胍基-丁铵，分子式C13H25N7O8S，分子量439.44。

[0054] 其制备方法如下：

[0055]

[0056] 将(2S,5R)-6-羟 基-7-氧 代-1,6- 二 氮杂 环[3,2,1] 辛烷 -2-甲 酰 胺92.6g(500mmol)溶于吡啶(350mL)中，加入三乙胺(25.0ml)、吡啶三氧化硫络合物(95.5g)，室温搅拌12h，滤去固体并用乙酸乙酯洗涤，蒸出溶剂。残余物用乙酸乙酯(350ml)溶解，滤去不溶物，加入溶解有精氨酸盐酸盐87.1g(500mmol)的甲醇(150ml)中的溶液，将混合物置于0℃冰水浴中搅拌1h，过滤所得的沉淀用少量乙酸乙酯洗涤，干燥得化合物1-1c的白色粉末171.1g(78％)。

[0057] 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.26(s,2H),6.56(s,2H),5.93(s,1H),5.53(s,1H),4.95(m,1H),4.78(br,3H),4.29(t,J ＝ 16.4Hz,1H),3.80(m,1H),3.59(t,J ＝8.8Hz,1H),3.38(t,J＝10.8Hz,2H),2.29(m,2H),2.08(m,2H).

[0058] 实施例4

[0059] 1-2a(2S,5R)-2-(二甲基氨基)甲酰基-7-氧代-1,6-二氮杂二环[3.2.1]辛-6-基硫酸(S)-1-羧基-2-(1H-咪唑-4-基)-乙铵，分子式C15H24N6O8S，分子量448.45。

[0060] 其制备方法如下：

[0061]

[0062] 将N,N-二甲基(2S,5R)-6-羟基-7-氧代-1,6-二氮杂环[3,2,1]辛烷-2-甲酰胺10.7g(50mmol)溶解于吡啶(35mL)中，加入三乙胺(2.5ml)、吡啶三氧化硫络合物(9.6g)，室温搅拌12h，过滤除去固体并用乙酸乙酯洗涤，合并滤液并除去溶剂。残余物用乙酸乙酯(35ml)溶解，过滤除去不溶物，加入溶解有组氨酸7.8g(50mmol)的甲醇(12ml)溶液，将混合物置于0℃冰水浴中持续搅拌1h，过滤并用少量乙酸乙酯洗涤沉淀，干燥得(2S,5R)-2-(二甲基氨基)甲酰基-7-氧代-1,6-二氮杂二环[3.2.1]辛-6-基硫酸(S)-1-羧基-2-(1H-咪唑-4-基)-乙铵(1-2a)的白色粉末14.5g，产率65％。

[0063] 1H NMR(600MHz,CD3OD)δ8.73(br,1H),7.66(br,1H),5.57(t,J ＝4.2Hz,1H),4.24–4.17(m,2H),4.05(s,3H),3.79–3.71(m,1H),3.60(m,2H),3.03–
2.94(m,7H),2.45-2.53(m,1H),1.94-2.08(m,1H),1.81–1.71(m,1H),1.63–1.53(m,1H).[0064] 实施例5

[0065] 1-6a(2S,5R)-2-(甲氧基氨基)甲酰基-7-氧代-1,6-二氮杂二环[3.2.1]辛-6-基硫酸(S)-1-羧基-2-(1H-咪唑-4-基)-乙铵，分子式C14H22N6O9S，分子量450.42。

[0066] 其制备方法如下：

[0067]

[0068] 将N-甲氧基(2S,5R)-6-羟基-7-氧代-1,6-二氮杂环[3,2,1]辛烷-2-甲酰胺10.8g(50mmol)溶解于吡啶(35mL)中，加入三乙胺(2.5ml)、吡啶三氧化硫络合物(9.6g)，室温搅拌12h，过滤除去固体并用乙酸乙酯洗涤，合并滤液并除去溶剂。残余物用乙酸乙酯(35ml)溶解，过滤除去不溶物，加入溶解有组氨酸7.8g(50mmol)的甲醇(12ml)溶液，将混合物置于0℃冰水浴中持续搅拌1h，过滤并用少量乙酸乙酯洗涤沉淀，干燥得(2S,5R)-2-(甲氧基氨基)甲酰基-7-氧代-1,6-二氮杂二环[3.2.1]辛-6-基硫酸(S)-1-羧基-2-(1H-咪唑-4-基)-乙铵(1-6a)的白色粉末12.5g，产率56％。

[0069] 1H NMR(600MHz,DMSO-D6)δ8.73(br,1H),7.66(br,1H),6.41(br,1H),5.50(t,J ＝ 8.4Hz,1H),5.18(s,3H),4.06–3.87(m,5H),3.80–3.67(m,2H),3.53(d d,J ＝24.8,14.9Hz,1H),3.17-3.25(m,1H),2.52–2.23(m,2H),1.86-1.98(m,1H),1.65-1.75(m,
1H).

[0070] 实施例6

[0071] 1-9a(2S,5R)-2-哌啶基甲酰基-7-氧代-1,6-二氮杂二环[3.2.1]辛-6-基硫酸(S)-1-羧基-2-(1H-咪唑-4-基)-乙铵，分子式C18H28N6O8S，分子量488.52。

[0072] 其制备方法如下：

[0073]

[0074] 将N-甲氧基(2S,5R)-6-羟基-7-氧代-1,6-二氮杂环[3,2,1]辛烷-2-甲酰胺10.2g(50mmol)溶解于吡啶(35mL)中，加入三乙胺(2.5ml)、吡啶三氧化硫络合物(9.6g)，室温搅拌12h，过滤除去固体并用乙酸乙酯洗涤，合并滤液并除去溶剂。残余物用乙酸乙酯(35ml)溶解，过滤除去不溶物，加入溶解有组氨酸7.8g(50mmol)的甲醇(12ml)溶液，将混合物置于0℃冰水浴中持续搅拌1h，过滤并用少量乙酸乙酯洗涤沉淀，干燥得(2S,5R)-2-(甲氧基氨基)甲酰基-7-氧代-1,6-二氮杂二环[3.2.1]辛-6-基硫酸(S)-1-羧基-2-(1H-咪唑-4-基)-乙铵(1-6a)的白色粉末22.1g，产率90％。

[0075] 1H NMR(600MHz,Chloroform)δ8.73(br,1H),7.66(br,1H),5.52(br,3H),5.00–5.05(m,1H),4.41(t,J ＝ 8.4Hz,1H),4.21-4.28(m,1H),3.81–3.68(m,4H),3.45(dd,J ＝
12.4,2.5Hz,1H),3.38(t,J ＝ 5.4Hz,2H),3.02–3.11(m,1H),2.09–1.97(m,2H),1.89–
1.72(m,2H),1.61–1.49(m,6H).

[0076] 实施例7

[0077] 1-1g(2S,5R)-2-氨基甲酰基-7-氧代-1,6-二氮杂二环[3.2.1]辛-6-基硫酸(S)-1-羧基-3-氨基-丙铵，分子式C11H21N5O8S，分子量383.38。

[0078] 其制备方法如下：

[0079]

[0080] 将(2S,5R)-6-羟 基-7-氧 代-1,6- 二 氮杂 环[3,2,1] 辛烷 -2-甲 酰 胺9.26g(50mmol)溶解于吡啶(35mL)中，加入三乙胺(2.5ml)、吡啶三氧化硫络合物(9.6g)，室温搅拌12h，过滤除去固体并用乙酸乙酯洗涤，合并滤液并除去溶剂。残余物用乙酸乙酯(35ml)溶解，过滤除去不溶物，加入溶解有组氨酸7.8g(50mmol)的甲醇(12ml)溶液，将混合物置于0℃冰水浴中持续搅拌1h，过滤并用少量乙酸乙酯洗涤沉淀，干燥得(2S,5R)-2-氨基甲酰基-7-氧代-1,6-二氮杂二环[3.2.1]辛-6-基硫酸(S)-1-羧基-3-氨基-丙铵(1-1g)的白色粉末14.3g，产率75％。
1

[0081] H NMR(600MHz,Chloroform)δ8.73(br,1H),7.66(br,1H),5.52(br,3H),5.00–5.05(m,1H),4.41(t,J ＝ 8.4Hz,1H),4.21-4.28(m,1H),3.81–3.68(m,4H),3.45(dd,J ＝
12.4,2.5Hz,1H),3.38(t,J ＝ 5.4Hz,2H),3.02–3.11(m,1H),2.09–1.97(m,2H),1.89–
1.72(m,2H),1.61–1.49(m,6H).

[0082] 实施例8

[0083] 生物活性检测试验

[0084] PCR检测常见的β-内酰胺酶基因型：

[0085]

[0086] PCR反应条件：PCR反应总体积为25μL，其中每种引物2μL(10μmol/L)，10×PCR buffer 2.5μL，dNTP 1μL(2.5mmol/L)，Taq酶0.5μL(5U/μL)，DNA模板2μL，DEPC水补足25μL，扩增条件为：95℃预变性3min，然后95℃变性30s，退火温度见表1，时间为30s，72℃延伸1min，进行34个循环，最后延伸5min，PCR产物1.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳后，用凝胶成像系统观察结果。

[0087] MH(A)培养基配比：淀粉1.5g，酪蛋白水解物17.5g，琼脂12.5g，牛肉浸粉5g。

[0088] 把上述成分加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。

[0089] MH(B)培养基配比：淀粉1.5g，酪蛋白水解物17.5g，牛肉浸粉5g，把上述成分加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。

[0090] 细菌浓度：1.5×105CFU/ml。

[0091] 化合物(I)与头孢他啶联用的抗菌活性研究：

[0092] ESBLs 表 型 确 证 实 验 采 用 Clinical and Laboratory Stanard Institute(CLSI)2012版推荐的双纸片确证法：制备0.5麦氏单位悬液，涂布MH琼脂平板，以纸片CTX(30μg)、CAZ(30μg)、CRO(30μg)、CAZ/CA(30μg/10μg)CTX/CA(30Lg/10μg)5种药敏纸片进行ESBLs表型确证，任何一组复合剂纸片抑菌环直径大于或等于单独抗菌药物纸片抑菌环直径5mm，即判定为产ESBLs菌株并将其进行基因分型。

[0093] AmpC酶诱导试验待测菌按K-B法药敏试验法涂布M-H平板，中央贴头孢西丁(FOX)纸片，周围贴头孢他啶(CAZ)、头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CA)、头孢噻肟(CTX)、头孢噻肟/克拉维酸(CTX/CA)和哌拉西林/他唑巴坦(PIP/TZ)，外周纸片与FOX纸片的间距为18mm。任一外周药物的抑菌环朝向FOX一侧出现截平现象，即为诱导产AmpC酶。

[0094] PCR反应筛选产酶菌株SHV、TEM、OXA、CTX、AmpC型菌株。

[0095] 抑酶试验:所有测定均在37℃、pH7.0的0.05mol/L磷酸盐缓冲液中进行。以头孢哌酮作底物，波长为260nm。让不同浓度的化合物(I)和粗酶液混匀放置10min后，再加入底物测定IC50值，测得

[0096]

[0097]

[0098] 底物终浓度为10-4mol/L，酶抑制剂终浓度分别为0、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L，计算抑酶率达到50％的酶抑制剂浓度(IC50)。

[0099] 从实验结果可知，化合物(I)抑酶谱广，可抑制A型(SHV、TEM、CTX)、C型(主要是AmpC酶)和D型β-内酰胺酶(如OXA)，且抑制作用强。化合物(I-1a)，(I-1b)，(I-1c)酶抑制活性各有不同，在部分试验中表现出比阿维巴坦更好的酶抑制活性。

[0100] 药敏试验：据美国临床实验室标准化研究所(CLSI)2012版推荐的进行操作和结果的判读。取100μl原液浓度为2560μg/ml头孢他啶加入400μl的M-H(B)微量肉汤中，此时头孢他啶的药物浓度稀释成了512μg/ml。每孔加入100μl MH(B)培养基，100μl头孢他啶加入第1列灭菌的96孔聚苯乙烯板中，混匀，然后吸取100μl至第2列孔中，混匀后再吸取100μl至第3列孔，如此连续倍比稀释至第11列的孔中，并从第11孔中吸取100μl5
弃去，第12列孔为不含药物的生长对照。将浓度为3×10CFU/ml的菌悬液100μl加入孔
5
中，孔中菌最终浓度为1.5×10CFU/ml，此时每横排各孔的头孢他啶药物浓度依次为256、
128、64、32、16、8、4、2、1、0.025μg/ml。头孢他啶/化合物I-a(4:1,weight/weight)同法操作，将完成上述操作的96孔板放入35±2℃温箱中过夜培养16至18小时观察结果，观察单独应用头孢他啶的最低抑菌浓度(MIC)和两药联用是头孢他啶的最低抑菌浓度(MIC)。

[0101] 试验证明化合物1-1a，1-1b，1-1c具有显著的β-内酰胺酶抑制活性,可抑制A类,C类和部分D类β内酰胺酶；化合物(I)可显著降低头孢他啶的最低抑菌浓度。在部分试验特别是AmpC型β-内酰胺酶阳性菌试验中，化合物1-1a,1-1b与头孢他啶并用,表现出比阿维巴坦与头孢他啶并用更好的抑菌活性。

[0102] 实施例5

[0103] 化合物(I)静脉注射给药在大鼠体内药代动力学试验。

[0104] 配置浓度分别为0.1mg/L，0.2mg/L0.5mg/L，1mg/L，2mg/L，5mg/L，10mg/L的化合物I-1a，I-1b，I-1c，阿维巴坦和他唑巴坦的标准溶液。使用HPLC测定药品的浓度，绘制I-1a，I-1b，I-1c，阿维巴坦和他唑巴坦的化合物浓度标准曲线。

[0105] HPLC条件：固定相ODS 5μ250*4.6mm，梯度洗脱H2O：MeCN＝90：10，10min；H2O：MeCN＝60：40，20min。

[0106] 取SD大鼠60只(雌雄各半)随机分组，分别在尾静脉给药5mg/kg化合物I-1a，化合物I-1a/头孢他啶(3:1)，化合物I-1b/头孢他啶(3:1)，化合物I-1c/头孢他啶(3:1)，阿维巴坦/头孢他啶(3:1)，他唑巴坦/头孢他啶(3:1)，然后分别在5min，10min，20min，30min，1h，2h，4h，6h，12h，24h，48h取血约3ml，置于带肝素钠的离心管中；离心除去血细胞，加入0.01MNaOH 100μl用氯代正丁烷萃取，取水层用用上述HPLC条件检测血液中，
1-1a，1-1b，1-1c，阿维巴坦和他唑巴坦含量。计算平均浓度后并给出被测化合物浓度-时间曲线，计算药物分布情况，半衰期。

[0107] 试验结果证明化合物1-1b，1-1c比1-1a，阿维巴坦半衰期长，前四者半衰期比他唑巴坦长。

[0108] 已根据特定的实施例对本发明进行了描述。对本领域的技术人员来说在不脱离本发明的范围下进行适当的替换或修改将是显而易见的。示例性的实施例仅仅是例证性的，而不是对本发明的范围的限制，本发明的范围由所附的权利要求定义。