一种阿普唑仑的药物组合物及其抗炎镇痛作用

摘要

本发明公开了一种阿普唑仑的药物组合物及其抗炎镇痛作用，本发明提供的阿普唑仑的药物组合物中含有阿普唑仑和一种从川牛膝的干燥根茎中分离得到的结构新颖的天然产物化合物(Ⅰ)，阿普唑仑和该天然产物单独作用时，抗炎镇痛效果一般；二者联合作用时，抗炎镇痛效果显著提高，可以开发成抗炎镇痛的药物。本发明与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。

权利要求

1.一种具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，

2.一种阿普唑仑的药物组合物，其特征在于：包括阿普唑仑、如权利要求1所述的化合物(Ⅰ)和药学上可以接受的载体。

3.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于，包含以下操作步骤：(a)将川牛膝的干燥根茎粉碎，用75％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中正丁醇萃取物用大孔树脂除杂，先用8％乙醇洗脱10个柱体积，再用70％乙醇洗脱12个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中

70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为40:1、20:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为

8:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～14个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(Ⅰ)。

4.根据权利要求3所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。

5.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)在制备抗炎镇痛的药物中的应用。

6.权利要求2所述的阿普唑仑的药物组合物在制备抗炎镇痛的药物中的应用。

说明书

一种阿普唑仑的药物组合物及其抗炎镇痛作用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及阿普唑仑的新用途，具体涉及一种阿普唑仑的药物组合物及其抗炎镇痛作用。

背景技术

[0002] 阿普唑仑为新的BDZ类药物，具有同地西泮相似的药理作用，有抗焦虑、抗抑郁、镇静、催眠、抗惊厥及肌肉松弛等作用。其抗焦虑作用比地西泮强10倍，作用机制可能与脑内β-肾上腺素受体有关。本品口服吸收迅速而完全，1～2小时即可达血药峰浓度，血浆半衰期为12～18小时，2～3天血药浓度达稳态。血浆蛋白结合率约为80％。吸收后分布于全身，并可透过胎盘屏障，乳汁中亦有药物。经肝脏CYP3A酶系代谢为活性物质α-羟三唑安定，但浓度太低无临床意义。最后自肾脏排出体外，体内蓄积量极少，停药后清除快。

[0003] 目前，尚未见阿普唑仑及其药物组合物与抗炎镇痛的相关报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种阿普唑仑的药物组合物，该药物组合物中含有阿普唑仑和一种从川牛膝中分离得到的结构新颖的天然产物，阿普唑仑和该天然产物可以协同抗炎镇痛。

[0005] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

[0006] 一种具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，

[0007]

[0008] 一种阿普唑仑的药物组合物，包括阿普唑仑、如上所述的化合物(Ⅰ)和药学上可以接受的载体。

[0009] 如上所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将川牛膝的干燥根茎粉碎，用75％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中正丁醇萃取物用大孔树脂除杂，先用8％乙醇洗脱10个柱体积，再用70％乙醇洗脱12个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为40:1、20:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为8:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～14个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(Ⅰ)。

[0010] 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。

[0011] 如上所述的化合物(Ⅰ)在制备抗炎镇痛的药物中的应用。

[0012] 如上所述的阿普唑仑的药物组合物在制备抗炎镇痛的药物中的应用。

[0013] 本发明的优点：

[0014] 本发明提供的阿普唑仑的药物组合物中含有阿普唑仑和一种从川牛膝中分离得到的结构新颖的天然产物，阿普唑仑和该天然产物单独作用时，抗炎镇痛效果一般；二者联合作用时，抗炎镇痛效果显著提高，可以开发成抗炎镇痛的药物。本发明与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。

具体实施方式

[0015] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

[0016] 实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证

[0017] 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。

[0018] 分离方法：(a)将川牛膝的干燥根茎(5kg)粉碎，用75％乙醇热回流提取(20L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(4L)，依次用石油醚(4L×3次)、乙酸乙酯(4L×3次)和水饱和的正丁醇(4L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中正丁醇萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用8％乙醇洗脱10个柱体积，再用70％乙醇洗脱12个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为40:1(8个柱体积)、20:1(8个柱体积)、10:1(8个柱体积)和5:1(10个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为8:1(8个柱体积)、5:1(10个柱体积)和2:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～14个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(Ⅰ)(288mg，HPLC归一化纯度大于98％)。

[0019] 结构确证：无色油状物，HR-ESI-MS显示[M+H]+为m/z 435.2245，结合核磁特征可得分子式为C26H30N2O4，不饱和度为13。核磁共振氢谱数据δH(ppm，CDCl3，500MHz)：H-3(3.98，t，J＝3.2Hz)，H-5(3.48，d，J＝7.3Hz)，H-6a(3.32，dd，J＝16.3，7.3Hz)，H-6b(2.61，br，d，J＝16.3Hz)，H-9(7.49，d，J＝8.2Hz)，H-10(7.11，td，J＝8.2，1.3Hz)，H-11(7.22，td，J＝8.2，1.3Hz)，H-12(7.30，d，J＝8.2Hz)，H-14a(2.74，d，J＝13.0Hz)，H-14b(1.88，d，J＝
13.0Hz)，H-17a(4.33，d，J＝12.1Hz)，H-17b(4.16，d，J＝12.1Hz)，H-18(1.57，s)，H-20(2.89，dd，J＝12.3，8.4Hz)，H-21(1.88，m)，H-21(2.41，m)，H-23(6.22，d，J＝10.4Hz)，H-24(6.05，dd，J＝10.4，3.2Hz)，H-25(4.92，m)，H-26(3.41，dd，J＝12.1，3.2Hz)，H-26(3.81，dd，J＝12.1，2.0Hz)，N1-Me(3.64，s)，N4-Me(2.34，s)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，CDCl3，
125MHz)：132.4(C，2-C)，53.5(CH，3-C)，61.4(CH，5-C)，23.7(CH2，6-C)，107.3(C，7-C)，
126.8(C，8-C)，118.4(CH，9-C)，119.2(CH，10-C)，121.2(CH，11-C)，109.5(CH，12-C)，136.7(C，13-C)，33.3(CH2，14-C)，126.2(C，15-C)，130.0(C，16-C)，59.6(CH2，17-C)，24.3(CH3，
18-C)，116.2(C，19-C)，40.1(CH，20-C)，32.2(CH2，21-C)，101.2(C，22-C)，139.2(CH，23-C)，132.7(CH，24-C)，89.4(CH，25-C)，64.5(CH2，26-C)，30.2(CH3，N1-Me)，41.3(CH3，N4-Me)。
-1
红外波谱中在3415cm 吸收峰是由该化合物中的羟基产生；且UV谱图表明在233nm与284nm有紫外吸收，显示该化合物含有吲哚发色基团。13C-NMR、DEPT和HSQC谱中显示有26个碳信号，包括三个甲基δC24.3，30.2，41.3；一个羟甲基δC64.5；四个亚甲基(一个连氧亚甲基)δC23.7，33.3，59.6，32.2；十个次甲基(一个连氧次甲基)δC53.5，61.4，118.4，119.2，121.2，
109.5，40.1，139.2，132.7，89.4；以及八个季碳(两个二连氧季碳)δC132.4，107.3，126.8，
136.7，126.2，130.0，116.2，101.2；以上功能结构再结合不饱和数表明该化合物为七环结构。1H-NMR谱显示一组无取代吲哚片段的质子信号δH-97.49(1H，d，J＝8.2Hz)、δH-107.11(1H，td，J＝8.2，1.3Hz)、δH-117.22(1H，td，J＝8.2，1.3Hz)与δH-127.30(1H，d，J＝8.2Hz)；一对羟甲基质子信号δH-263.41(1H，dd，J＝12.1，3.2Hz)与3.81(1H，dd，J＝12.1，2.0Hz)；一个甲基质子信号δH-181.57(3H，s，Me)；两个N-CH3质子信号δH3.64(3H，s，N1-Me)与2.34(3H，s，N4-Me)；一组移向低场的连氧亚甲基质子信号δH-17a 4.33(1H，d，J＝12.1Hz)与δH-17b 4.16(1H，d，J＝12.1Hz)；三组亚甲基质子信号δH-6a 3.32(1H，dd，J＝16.3，7.3Hz)与δH-6b 2.61(1H，d，J＝16.3Hz)、δH-14a 2.74(1H，d，J＝13.0Hz)与δH-14b 1.88(1H，d，J＝13.0Hz)以及δH-211.88(1H，m)与δH-212.41(1H，m)；一组烯烃质子信号δH-236.22(1H，dd，J＝10.4Hz)与δH-246.05(1H，d，J＝10.4，3.2Hz)；一个连氧次甲基质子信号δH-254.92(1H，m)。13C-NMR谱、DEPT谱显示该化合物中存在吲哚结构片段δC-2132.4(C)、δC-7107.3(C)、δC-8126.8(C)、δC-9118.4(CH)、δC-
10119.2(CH)、δC-11121.2(CH)、δC-12109.5(CH)与δC-13136.7(C)，一个羟甲基信号δC-2664.5(CH2OH)，一个甲基信号δC-1824.3(CH3)，两个N-甲基信号δC30.2(CH3，N1-Me)与41.3(CH3，N4-Me)。COSY与HSQC波谱数据揭示该化合物中含有-NCHCH2-结构片段(-N4-C5-C6-与-N4-C3-C14-)。进一步分析HMBC谱，H2-14与C-15和C-20，H2-17与C-15和C-19，H-20与C-14和C-19存在相关信号，结合13C-NMR谱中相关碳信号暗示结构中存在连氧六元环片段，此外H3-18与C-
19的相关信号表明C-19位连有一个甲基。COSY谱中，还存在一组复杂的1H-1H相关信号，通过这组信号可以分析出该化合物中可能存在的结构片段-CHCH2-和-CHCHCHCH2O-，结合HMBC谱分析，可以推断出该化合物的结构中E/F环为双五元螺环结构。另在HMBC谱中还显示存在H-
5与C-3、C-7和C-17，H2-14与C-13，N1-Me与C-2和C-13的相关信号，可构建该化合物的相关碳氢连接方式。NOESY谱中，H3-18与H-17a、H-20的相关信号确定了E/F环的连接方式为H3-18与H-20顺式连接成α构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致。

[0020] 该化合物化学结构式及碳原子编号如下：

[0021]

[0022] 实施例2：抗炎镇痛作用

[0023] 1、材料与方法

[0024] 1.1药物及试剂

[0025] 阿普唑仑购自中国药品生物制品检定所。化合物(Ⅰ)自制，制备方法见实施例1。阿司匹林肠溶片(济南永宁制药股份有限公司)，吐温80(天津市广成化学试剂有限公司)；二甲苯(天津市博通化工有限公司)；依文思蓝(国药集团化学试剂有限公司)。

[0026] 1.2动物

[0027] 昆明种小鼠，体重18～22g，雌雄各半，清洁级，由泰山医学院实验动物中心提供。

[0028] 1.3镇痛实验：小鼠扭体法

[0029] 取小鼠50只，雌雄各半，体重18～22g，随机分为阿普唑仑组(0.2g·kg-1)、化合物(Ⅰ)组(0.2g·kg-1)、阿普唑仑与化合物(Ⅰ)组合物组(0.1g·kg-1+0.1g·kg-1)、阿司匹林组(0.2g·kg-1)及生理盐水对照组。每组10只，灌胃给药。给药容积20mL·kg-1。生理盐水组和阿司匹林组给药30min后、给药组给药60min后，腹腔注射0.6％冰醋酸10mL·kg-1，观察记录15min内小鼠出现扭体反应鼠数和扭体次数，计算扭体次数均值及抑制扭体反应率。

[0030] 抑制率＝(对照组扭体数-给药组扭体数)/对照组扭体数×100％

[0031] 1.4镇痛实验：小鼠甩尾法实验

[0032] 取昆明种小鼠50只，雌雄各半，体重18～22g，实验前12h禁食不禁水。把小鼠装入小鼠固定筒内，尾部暴露于外，测痛时，使小鼠尾尖部1/3处与聚光灯灯孔重合，待动物安静后进行测量，以鼠尾受热刺激出现甩尾作为疼痛反应指标。记录小鼠从开始光照射到甩尾反应的潜伏期(TFLs)作为痛阈。分组及给药同1.3。生理盐水组和阿司匹林组给药30min后、给药组给药60min后，测定其甩尾时间。计算痛阈均值及痛阈提高率。

[0033] 痛阈提高率＝(给药后痛阈-基础痛阈)/基础痛阈×100％

[0034] 1.5抗炎实验：对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

[0035] 分别称取18～22g健康小白鼠40只，分为5组，每组8只，雌雄各半。每只小鼠按20mL·kg-1灌胃给药，剂量设置同1.3。连续给药7d。第7天给药0.5h后，各组小鼠于右耳正反面涂上二甲苯50μL致炎，1h后将小鼠脱颈椎处死，沿耳廓基线剪下两耳，用8mm直径打孔器分别在同一部位打下圆耳片，立即称重并记录其质量，计算肿胀度和肿胀率。

[0036] 肿胀度＝右耳质量-左耳质量；肿胀率＝[(右耳质量-左耳质量)/左耳质量]×100％

[0037] 1.6抗炎实验：对冰醋酸致小鼠血管通透性改变的影响

[0038] 分组给药同1.3。第7天给药0.5h后，尾静脉注射1％的依文思蓝生理盐水溶液10mL·kg-1，立即腹腔注射0.6％醋酸生理盐水溶液10mL·kg-1，30min后脱颈椎处死小鼠，轻揉小鼠腹部1min后，打开腹腔，收集腹腔液，待收集完毕用4mL生理盐水分数次冲洗腹腔，用注射器吸出洗涤液，合并后加入生理盐水至5mL，以1000r·min-1离心5min，取上清液用
721型分光光度计于680nm处测吸光度(A)，计算渗出抑制率。

[0039] 渗出抑制率＝(阴性对照组A-给药组A)/阴性对照组A×100％

[0040] 1.7统计方法

[0041] 采用SPSS19.0软件，数据以x±s表示，比较用t检验，P＜0.05为有统计意义。

[0042] 2、实验结果

[0043] 2.1镇痛作用

[0044] 与对照组比，阿普唑仑与化合物(Ⅰ)组合物组小鼠扭体反应次数和扭体反应鼠数均显著降低(P<0.01)，对醋酸致小鼠扭体反应次数的抑制效果优于阳性药阿司匹林，且优于阿普唑仑或化合物(Ⅰ)单独作用时对醋酸致小鼠扭体反应次数的抑制效果。结果见表1。

[0045] 与对照组比，阿普唑仑与化合物(Ⅰ)组合物组小鼠光热辐射致疼痛反应的痛阈显著提高(P<0.01)，痛阈提高率与阳性药阿司匹林基本一致，且优于阿普唑仑或化合物(Ⅰ)单独作用时对小鼠光热辐射致疼痛反应的痛阈提高率。结果见表2。

[0046] 表1对冰醋酸致小鼠扭体次数的影响(x±s，n＝10)

[0047]组别 剂量/g·kg-1 扭体数/只 扭体次数抑制率/％
对照组 - 10 0
阿司匹林组 0.2 5 64.4
阿普唑仑组 0.2 8 43.6
化合物(Ⅰ)组 0.2 8 47.4
阿普唑仑与化合物(Ⅰ)组合物组 0.1+0.1 6 69.5

[0048] 表2对热刺激致小鼠痛阈改变的影响(x±s，n＝10)

[0049]组别 剂量/g·kg-1 痛阈提高率/％
对照组 - 0
阿司匹林组 0.2 64.4
阿普唑仑组 0.2 25.8
化合物(Ⅰ)组 0.2 27.9
阿普唑仑与化合物(Ⅰ)组合物组 0.1+0.1 66.3

[0050] 2.2抗炎作用

[0051] 二甲苯致炎后，阿普唑仑组、化合物(Ⅰ)组小鼠耳廓肿胀率低于对照组(P＜0.05)，阿普唑仑与化合物(Ⅰ)组合物组的小鼠耳廓肿胀率降低显著(P＜0.01)。结果见表3。冰醋酸致炎后，阿普唑仑组、化合物(Ⅰ)组小鼠腹腔液依文思蓝A低于阴性对照组(P＜0.05)，阿普