长春花中长春新碱的提取方法转让专利
申请号 : CN201410824749.8
文献号 : CN105801605A
文献日 : 2016-07-27
发明人 : 于航 , 吴琼
申请人 : 辽宁药联制药有限公司
摘要 :
本发明公开了一种长春花中长春新碱的提取方法。该方法采用超声技术进行提取，超声温度为40℃、功率为600w、超声30min、取长春花叶部分、粒度为60目以下、溶剂为90%甲醇水溶液、浸泡时间为16h。采用本发明方法提取长春新碱所需设备简单、操作方便、提取时间短、节能、节约药材，通过高效液相色谱法检验证明，提取后的长春新碱分离效率高、提出率高，可以有效的减少钾离子对血管的刺激性，益于临床应用，为不适合口服给药的患者提供了一种顺应性较高的、快速的补钾制剂。
权利要求 :
1.长春花中长春新碱的提取方法，采用超声方式进行提取，最佳工艺是：超声温度为
40℃、功率为600w、超声30min、取长春花叶部分、粒度为60目以下、溶剂为90%甲醇水溶液、浸泡时间为16h。
2.根据权利要求1所述的长春新碱的提取方法，其特征在于，比传统的冷浸法提取时间缩短95.83%。
3.根据权利要求1所述的长春新碱的提取方法，其特征在于，比热回流法提取时间缩短89.38%。
4.根据权利要求1所述的长春新碱的提取方法，其特征在于，长春新碱的提取率可达到91.14%。
5.根据权利要求2所述，超声法15min的提取率等于冷浸法6h的提取率。
6.根据权利要求3所述，超声法17min的提取率相当于热回流2.4h的提取率。
说明书 :
长春花中长春新碱的提取方法
技术领域
[0001] 本发明涉及长春花中一种生物碱的提取，该生物碱具有治疗癌症的功效，属于药物制剂领域。
背景技术
[0002] 长春新碱的提取是长春花开发和长春新碱应用的关键技术之一，选择适宜的提取方法对生物碱保持有效成分的活性具有重要意义。目前，使用的传统方法按照固液接触状态可分为静态方式（如煎煮 、浸渍）和动态方式（如回流 、渗漉），但在实际生产中，提取时间长，提取率也低。随着现代科学技术的发展，超声技术已广泛的应用于工业 、农业 、医药卫生等领域，由于该方法具有所需设备简单、操作方便、提取时间短、提出率高、节能、节约药材等优点，因而超声技术在提取中草药成分方面的应用受到了越来越多的重视。
[0003] 长春花的有效成分长春碱、长春新碱、环氧长春碱、长春花碱、异长春碱、长春花胺等均有抗癌活性，对大多数实验性肿瘤有较好的防治作用。长春花的各有效成分因实验性肿瘤不一而有不同的抗肿瘤活性。
[0004] 长春新碱对DBA/2小鼠的移植性淋巴细胞白血病P—1534在低剂量时可以延长病鼠生存时间，治疗量时常使病鼠获得100%“治愈”。长春新碱对DBA/1小鼠乳房肿瘤有明显抑制作用。长春新碱对腺癌755有作用，对乳腺癌也有一定作用。长春新碱对体外培养的人肝癌细胞株有明显的抗癌作用，实验结果表明，随着药物浓度增高，其抗癌作用增强。100μg·ml-1的长春新碱对癌细胞的杀伤率为59%，增殖抑制率为68%~69%，蛋白质含量的抑制率为75%，表明长春新碱体外抗肝癌作用是明显的。
[0005] 长春新碱对小鼠白血病L1210、小鼠移植性淋巴细胞白血病P—1534、AKP—白血病、大鼠W255、IRC741/1398白血病、小鼠肉瘤S180、艾氏腹水癌和移植性及自发性乳腺癌都有实验治疗作用，并可防止AKP小鼠的自发性白血病，能使患ICR741白血病的Fis her大鼠血流中存在的瘤细胞迅速消失。
[0006] 长春新碱抑制肿瘤细胞以及正常动物骨髓细胞的有丝分裂，使停止于中期。进一步研究证明长春新碱能干扰微管蛋白的合成，从而阻止微管蛋白装配成有功能的纺锤丝。最近证明药物与微管蛋白在一定的受体部位结合，阻止微管装配以形成高度规则的结晶，此外，还出现其抑制嘌呤、RNA或DNA合成。长春新碱浓度集于神经细胞较血细胞为多。长春新碱是一种周期特异性药物，对细胞增殖周期的有延缓或阻滞作用，剂量增大时可杀伤S期细胞，对动物肿瘤的作用超过长春碱。
[0007] 小鼠注射硫酸盐能使血栓明显溶解，蛋氨酸锶的吸收增加，血小板蛋白质的合成增加。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于提供一种提取纯度高，分离度高的长春新碱提取方法，并采用适宜的提取条件，以降低成本，提高提取效率。
[0009] 本文用超声波法提取长春新碱，研究了在超声波条件下，影响提取率的几个因素：包括超声时间、功率、超声温度、粒度、溶剂、浸泡时间等几个方面，得到了一条操作简便、省时、提取率高、选择性好的工艺。最佳工艺是：超声温度为40℃、功率为600w、超声30min、取长春花叶部分、粒度为60目以下、溶剂为90%甲醇水溶液、浸泡时间为16h。超声提取与传统的提取方法相对照，比传统的冷浸法提取时间缩短95.83%、比热回流法提取时间缩短
89.38%，且长春新碱的提取率可达到91.14%。
89.38%，且长春新碱的提取率可达到91.14%。
[0010] 以下实施例提供了上述发明的具体实施方式，但它们不局限于本发明的整个范围。实施例中的物料均为药学上可接受的物料。
具体实施方式
[0011] 长春新碱超声提取条件的选择最大提取率
长春干草中长春新碱的最大提取方法，将长春干草中草质粉碎筛分，取200目以下粉末3.00g，加含1%硫酸的80%甲醇水溶液60ml，浸泡72h，超声提取20min，功率400w。抽滤，再加入1%硫酸的80%甲醇水溶液60ml，浸泡72h，超声提取20min，功率400w。抽滤，反复5次，将滤液合并。取200ml滤液旋蒸至干，再取10ml甲醇完全溶解，在波长297nm处测定峰面积为53166，与标准曲线对照，计算长春新碱含量。
长春干草中长春新碱的最大提取方法，将长春干草中草质粉碎筛分，取200目以下粉末3.00g，加含1%硫酸的80%甲醇水溶液60ml，浸泡72h，超声提取20min，功率400w。抽滤，再加入1%硫酸的80%甲醇水溶液60ml，浸泡72h，超声提取20min，功率400w。抽滤，反复5次，将滤液合并。取200ml滤液旋蒸至干，再取10ml甲醇完全溶解，在波长297nm处测定峰面积为53166，与标准曲线对照，计算长春新碱含量。
[0012] 超声提取条件的选择提取次数的选择
分别取30—40目的长春干草两份，用30ml甲醇溶液按下列规定条件进行超声提取，抽滤，取15ml滤液，用旋转蒸发仪与真空泵连接的自制装置，减压旋蒸至干，得浸膏，再取1ml甲醇使其完全溶解，微孔有机滤膜过滤，用液相检测，在波长297nm处测定峰面积，与标准曲线对照，计算提取率。见表1：
表1 提取次数的选择
1. 编号 2. 生药质量(g) 3. 超声条件 4. 峰面积（uV·S）5. 提取率(%)
6. 1 7. 3.00g 8. 加甲醇超声提取10min,到处提取液，再次加入甲9. 210932 10. 45.83醇继续提取10min,功率400w
11. 2 12. 3.00g 13. 加甲醇超声提取20min,功率400w 14. 279986 15. 60.06结果表明，超声提取一次20min比超声提取两次每次10min的提取率略高一些，故以下实验均采用超声提取一次20min。
分别取30—40目的长春干草两份，用30ml甲醇溶液按下列规定条件进行超声提取，抽滤，取15ml滤液，用旋转蒸发仪与真空泵连接的自制装置，减压旋蒸至干，得浸膏，再取1ml甲醇使其完全溶解，微孔有机滤膜过滤，用液相检测，在波长297nm处测定峰面积，与标准曲线对照，计算提取率。见表1：
表1 提取次数的选择
1. 编号 2. 生药质量(g) 3. 超声条件 4. 峰面积（uV·S）5. 提取率(%)
6. 1 7. 3.00g 8. 加甲醇超声提取10min,到处提取液，再次加入甲9. 210932 10. 45.83醇继续提取10min,功率400w
11. 2 12. 3.00g 13. 加甲醇超声提取20min,功率400w 14. 279986 15. 60.06结果表明，超声提取一次20min比超声提取两次每次10min的提取率略高一些，故以下实验均采用超声提取一次20min。
[0013] 超声功率的选择取30—40目长春干草用6份，用30ml甲醇按下列功率分别超声提取20min。抽滤，取滤液15ml旋蒸至干，再取1ml甲醇溶解，在波长297nm处测定峰面积，与标准曲线对照，计算提取率。见表2：
表2 超声功率的选择
超声功率（w） 生药质量（g） 峰面积（uV·S） 提取率(%)
100 3.01 208974 45.43
200 3.00 224830 48.69
300 3.01 250951 54.08
400 3.00 290085 62.13
500 3.00 297088 63.58
600 3.00 303257 64.85
结果表明，随着超声功率的增大，提取率上升，但当功率高于400w时，随着功率的增大提取率变化并不显著。
表2 超声功率的选择
超声功率（w） 生药质量（g） 峰面积（uV·S） 提取率(%)
100 3.01 208974 45.43
200 3.00 224830 48.69
300 3.01 250951 54.08
400 3.00 290085 62.13
500 3.00 297088 63.58
600 3.00 303257 64.85
结果表明，随着超声功率的增大，提取率上升，但当功率高于400w时，随着功率的增大提取率变化并不显著。
[0014] 超声时间的选择取30—40目长春干草，用30ml甲醇按下列时间超声提取，功率400w。抽滤，取滤液
15ml旋蒸至干，再取1ml甲醇溶解，在波长297nm处测定峰面积，与标准曲线对照，计算提取率。见表3：
表3 超声时间的选择
超声时间（min） 生药质量（g） 峰面积（uV·S） 提取率(%)
5 3.00 98326 22.64
10 3.00 179385 39.33
15 2.99 255423 55.00
20 3.00 306327 65.48
25 3.00 314965 67.26
30 3.00 318987 68.03
实验表明，随着超声时间的增加，提取率增大，超声时间在30min时为最佳，但随超声时间的逐渐增大，提取率的增加有变缓的趋势。
15ml旋蒸至干，再取1ml甲醇溶解，在波长297nm处测定峰面积，与标准曲线对照，计算提取率。见表3：
表3 超声时间的选择
超声时间（min） 生药质量（g） 峰面积（uV·S） 提取率(%)
5 3.00 98326 22.64
10 3.00 179385 39.33
15 2.99 255423 55.00
20 3.00 306327 65.48
25 3.00 314965 67.26
30 3.00 318987 68.03
实验表明，随着超声时间的增加，提取率增大，超声时间在30min时为最佳，但随超声时间的逐渐增大，提取率的增加有变缓的趋势。
[0015] 超声温度的选择取30—40目长春干草，用30ml甲醇按下列温度超声提取20min，功率400w。抽滤，取滤液15ml旋转蒸发至干，再取1ml甲醇使其完全溶解，在波长297nm处测定峰面积，与标准曲线对照，计算提取率。见表4：
表4 超声温度的选择
超声温度（℃） 生药质量（g） 峰面积（uV·S） 提取率(%)
10 3.00 231705 50.11
20 3.00 273159 58.65
30 3.00 314630 67.19
40 3.01 365782 77.72
50 3.00 352976 75.09
60 3.00 337581 71.92
实验结果表明，在一定范围内，温度的升高有利于目标产品长春新碱从植物细胞中溶出，从而增大提取率。但升至40℃后再往上升温至50℃时，提取率不再上升，反而略有下降，这是温度过高导致目标产品长春新碱被少量破坏的结果，所以，超声提取时，提取温度以40℃为佳。
表4 超声温度的选择
超声温度（℃） 生药质量（g） 峰面积（uV·S） 提取率(%)
10 3.00 231705 50.11
20 3.00 273159 58.65
30 3.00 314630 67.19
40 3.01 365782 77.72
50 3.00 352976 75.09
60 3.00 337581 71.92
实验结果表明，在一定范围内，温度的升高有利于目标产品长春新碱从植物细胞中溶出，从而增大提取率。但升至40℃后再往上升温至50℃时，提取率不再上升，反而略有下降，这是温度过高导致目标产品长春新碱被少量破坏的结果，所以，超声提取时，提取温度以40℃为佳。
[0016] 粉碎粒度的选择取不同粒度范围的长春花的叶和花部分及粉碎前后的茎，用30ml甲醇超声提取
20min，功率400w。抽滤，取滤液15ml，连接真空泵及旋转蒸发仪，在减压条件下旋转蒸发至干，再取1ml甲醇，使其完全溶解，微孔有机滤膜过滤，在波长297nm处测定峰面积，与标准曲线对照，计算提取率。
20min，功率400w。抽滤，取滤液15ml，连接真空泵及旋转蒸发仪，在减压条件下旋转蒸发至干，再取1ml甲醇，使其完全溶解，微孔有机滤膜过滤，在波长297nm处测定峰面积，与标准曲线对照，计算提取率。
[0017] 实验结果表明，长春干花的叶和花中长春新碱的含量远高于茎中的含量，且粒度越小，提取率越高，当粉碎粒度达到60目以下时，提取率最大。实验结果见表5：表5 生药粉碎度的选择
提取溶剂的选择
取粒度为30—40目的长春花粉末，分别用10倍甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、含1%硫酸的80%甲醇溶液进行超声提取，抽滤，取15ml滤液旋蒸至干，再取1ml甲醇溶解，在波长297nm处测定峰面积，与标准曲线对照，计算提取率。见表6：
表6 提取溶剂的选择
提取溶剂 生药质量(g) 峰面积（uV·S） 提取率(%)
甲醇 3.00 303158 64.83
乙醇 3.01 179936 39.44
丙酮 3.00 192217 41.98
氯仿 3.00 201684 43.93
乙酸乙酯 3.00 278394 59.72
含1%硫酸的80%甲醇 3.00 421069 89.11
实验表明，用含1%硫酸的80%甲醇溶液做为溶剂进行超声提取，提取率最高，这是因为溶剂极性很高，基本将长春花干草中的长春新碱都提取出来，但也由于极性太高，所以选择性较低，使其它杂质一并提取出来，且不易于回收再利用。而其它有机溶剂虽然选择性好，但提取效果都比较差，所以，可选择甲醇做溶剂进行大规模工业生产。
提取溶剂的选择
取粒度为30—40目的长春花粉末，分别用10倍甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、含1%硫酸的80%甲醇溶液进行超声提取，抽滤，取15ml滤液旋蒸至干，再取1ml甲醇溶解，在波长297nm处测定峰面积，与标准曲线对照，计算提取率。见表6：
表6 提取溶剂的选择
提取溶剂 生药质量(g) 峰面积（uV·S） 提取率(%)
甲醇 3.00 303158 64.83
乙醇 3.01 179936 39.44
丙酮 3.00 192217 41.98
氯仿 3.00 201684 43.93
乙酸乙酯 3.00 278394 59.72
含1%硫酸的80%甲醇 3.00 421069 89.11
实验表明，用含1%硫酸的80%甲醇溶液做为溶剂进行超声提取，提取率最高，这是因为溶剂极性很高，基本将长春花干草中的长春新碱都提取出来，但也由于极性太高，所以选择性较低，使其它杂质一并提取出来，且不易于回收再利用。而其它有机溶剂虽然选择性好，但提取效果都比较差，所以，可选择甲醇做溶剂进行大规模工业生产。
[0018] 溶剂量的选择取粒度为30—40目的长春干草，分别用5倍、8倍、10倍、15倍甲醇超声提取20min，功率400w。抽滤，取滤液15ml旋蒸至干，再取1ml甲醇使其完全溶解，在波长297nm处测定峰面积，与标准曲线对照，计算提取率。见表7：
表7 溶剂量的选择
固液比 生药质量（g） 峰面积（uV·S） 提取率(%)
1：5 3.00 198435 43.25
1：8 3.00 282524 60.57
1：10 2.98 286213 61.33
1：15 3.01 288922 61.89
实验表明，溶剂量的增大对目标产品长春新碱从植物细胞中溶出，提取率上升。当固液比达到1：8以后，溶剂量的增加对提取率影响不大，使用更多的溶剂，既浪费资源又污染环境。所以固液比的选择以1：8为佳。
表7 溶剂量的选择
固液比 生药质量（g） 峰面积（uV·S） 提取率(%)
1：5 3.00 198435 43.25
1：8 3.00 282524 60.57
1：10 2.98 286213 61.33
1：15 3.01 288922 61.89
实验表明，溶剂量的增大对目标产品长春新碱从植物细胞中溶出，提取率上升。当固液比达到1：8以后，溶剂量的增加对提取率影响不大，使用更多的溶剂，既浪费资源又污染环境。所以固液比的选择以1：8为佳。
[0019] 溶剂浓度的选择取粒度为30—40目的长春干草，分别用60%、70%、80%、90%、100%甲醇超声提取20min，功率400w。抽滤，取15ml滤液旋转蒸发至干，再取1ml甲醇使浸膏完全溶解，在波长297nm处测定峰面积，与标准曲线对照，计算提取率。见表8：
表8 溶剂浓度的选择
溶剂浓度（%） 生药质量(g) 峰面积（uV·S） 提取率(%)
60 3.01 251039 54.09
70 3.00 271482 58.30
80 3.00 289907 62.09
90 2.99 298856 63.94
100 3.02 292461 62.62
实验表明，用含少量水的甲醇溶液提取，提取率较高，但为方便回收再利用，采用无水甲醇为佳。
表8 溶剂浓度的选择
溶剂浓度（%） 生药质量(g) 峰面积（uV·S） 提取率(%)
60 3.01 251039 54.09
70 3.00 271482 58.30
80 3.00 289907 62.09
90 2.99 298856 63.94
100 3.02 292461 62.62
实验表明，用含少量水的甲醇溶液提取，提取率较高，但为方便回收再利用，采用无水甲醇为佳。
[0020] 浸泡时间的选择取粒度为30—40目的长春干草，分别用10倍甲醇浸泡0、1、2、4、8、16h后进行超声提取，抽滤，取15ml滤液旋蒸至干，再取1ml甲醇使其完全溶解，在波长297nm处测定峰面积，与标准曲线对照，计算提取率。见表9：
表9 浸泡时间的选择
浸泡时间(h) 生药质量(g) 峰面积（uV·S） 提取率(%)
0 2.99 285339 61.14
１ 3.00 319206 68.13
２ 3.00 338741 72.15
4 2.99 353921 75.28
8 3.02 379784 80.60
16 3.01 380297 80.71
实验结果表明，浸泡时间越长，提取率越高，但随着时间的延长，提取率增大趋势变缓。
表9 浸泡时间的选择
浸泡时间(h) 生药质量(g) 峰面积（uV·S） 提取率(%)
0 2.99 285339 61.14
１ 3.00 319206 68.13
２ 3.00 338741 72.15
4 2.99 353921 75.28
8 3.02 379784 80.60
16 3.01 380297 80.71
实验结果表明，浸泡时间越长，提取率越高，但随着时间的延长，提取率增大趋势变缓。
[0021] 正交实验1、实验设计
采用正交实验设计，以超声温度、超声时间、超声功率为考察对象，以长春新碱的含量
4
为指标，采用L9（3）表，优选超声提取长春新碱的条件，取30—40目长春花中叶的部分，以甲醇为溶剂，超声提取。表头设计见表10：
表10 因素水平表
A（超声温度） B（超声时间） C（功率）
1 40℃ 20min 400w
2 50℃ 25min 500w
3 60℃ 30min 600w
2、样品测定
称取30—40目长春花的花和叶部分3.00g，加入30ml甲醇按表15设计的超声温度、时间和超声功率进行提取。将提取液进行抽滤，取15ml滤液，旋蒸至干，再用该溶剂1ml将其完全溶解，待测。
采用正交实验设计，以超声温度、超声时间、超声功率为考察对象，以长春新碱的含量
4
为指标，采用L9（3）表，优选超声提取长春新碱的条件，取30—40目长春花中叶的部分，以甲醇为溶剂，超声提取。表头设计见表10：
表10 因素水平表
A（超声温度） B（超声时间） C（功率）
1 40℃ 20min 400w
2 50℃ 25min 500w
3 60℃ 30min 600w
2、样品测定
称取30—40目长春花的花和叶部分3.00g，加入30ml甲醇按表15设计的超声温度、时间和超声功率进行提取。将提取液进行抽滤，取15ml滤液，旋蒸至干，再用该溶剂1ml将其完全溶解，待测。
[0022] 表11 超声法提取长春新碱的方案L9（34）及结果表12 方差分析表：
F0.025(2,2)=39.00 F0.05(2,2)=19.00
由表11得，超声温度因素中第一水平（即40℃）最好；超声功率因素中第三水平（即
600w）最好；超声时间因素中第三水平（即30min）最好。取30—40目长春花，以无水甲醇为溶剂，在控制40℃以下，超声30min，功率600w，据此进行考察得表13：
表13 对最优超声条件进行考察
3、实验设计
采用正交实验设计，以粒度、溶剂浓度、超生前浸泡时间为考察对象，以长春新碱的含
4
量为指标，采用L9（3）表，优选超声提取长春新碱的条件。表头设计见表14：
表14 因素水平表
E（粒度） F（溶剂浓度） G（浸泡时间）
1 30~40目 80% 4h
2 40~60目 90% 8h
3 60目以下 100% 16h
4、样品测定
称取某粒度的样品3.00g，加入30ml溶剂按表14设计的粒度、溶剂浓度和浸泡时间进行提取。将提取液抽滤，取15ml滤液，旋蒸至干，再取1ml将其溶解，待测。
F0.025(2,2)=39.00 F0.05(2,2)=19.00
由表11得，超声温度因素中第一水平（即40℃）最好；超声功率因素中第三水平（即
600w）最好；超声时间因素中第三水平（即30min）最好。取30—40目长春花，以无水甲醇为溶剂，在控制40℃以下，超声30min，功率600w，据此进行考察得表13：
表13 对最优超声条件进行考察
3、实验设计
采用正交实验设计，以粒度、溶剂浓度、超生前浸泡时间为考察对象，以长春新碱的含
4
量为指标，采用L9（3）表，优选超声提取长春新碱的条件。表头设计见表14：
表14 因素水平表
E（粒度） F（溶剂浓度） G（浸泡时间）
1 30~40目 80% 4h
2 40~60目 90% 8h
3 60目以下 100% 16h
4、样品测定
称取某粒度的样品3.00g，加入30ml溶剂按表14设计的粒度、溶剂浓度和浸泡时间进行提取。将提取液抽滤，取15ml滤液，旋蒸至干，再取1ml将其溶解，待测。
[0023] 表15 超声法提取长春新碱的方案L9（34）及结果表16 方差分析表：
F0.025(2,2)=39.00 F0.05(2,2)=19.00
由表15得，粒度因素中第三水平（即60目以下）最好；浸泡时间因素中第三水平（即
16h）最好；溶剂浓度因素中第二水平（即90%）最好，据此进行考察得表17：
表17 对最优条件进行考察
超声提取与传统提取方法的比较
本实验以质量体积比为1：10（g·ml-1）加入甲醇，比较不同操作时间与提取率的关系。
F0.025(2,2)=39.00 F0.05(2,2)=19.00
由表15得，粒度因素中第三水平（即60目以下）最好；浸泡时间因素中第三水平（即
16h）最好；溶剂浓度因素中第二水平（即90%）最好，据此进行考察得表17：
表17 对最优条件进行考察
超声提取与传统提取方法的比较
本实验以质量体积比为1：10（g·ml-1）加入甲醇，比较不同操作时间与提取率的关系。
[0024] 超声法分别取30—40目长春花约3g，加甲醇30ml超声提取10、15、20、25、30min，功率400w。
抽滤，取15ml滤液旋蒸至干，再取1ml甲醇溶解，在波长297nm处测定峰面积，与标准曲线
抽滤，取15ml滤液旋蒸至干，再取1ml甲醇溶解，在波长297nm处测定峰面积，与标准曲线