化合物4(S)-4,5-二羟基-α-四氢萘酮4-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷及其制备方法与应用转让专利
申请号 : CN201610263598.2
文献号 : CN105801638A
文献日 : 2016-07-27
发明人 : 周媛媛 , 苏晓琳 , 蒋艳秋
申请人 : 黑龙江中医药大学
摘要 :
权利要求 :
1.化合物4(S)-4,5-二羟基-α-四氢萘酮4-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷,其结构式如下:。
2.权利要求1所述化合物的制备方法,其特征在于:所述化合物4(S)-4,5-二羟基-α-四氢萘酮4-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷以核桃青皮为原料,依次通过醇提、柱层析制备得到。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:所述4(S)-4,5-二羟基-α-四氢萘酮4-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷以核桃青皮为原料,依次通过醇提、大孔树脂柱、正相硅胶柱、反相硅胶柱、葡聚糖凝胶柱和制备型HPLC制备得到。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:所述4(S)-4,5-二羟基-α-四氢萘酮4-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷通过以下步骤制备:(1)醇提:以核桃青皮为原料,采用95%乙醇冷浸14-21天,过滤得乙醇提取液,减压回收溶剂,干燥,得粉末状提取物;
(2)富集纯化:将步骤(1)所得粉末状提取物用水分散至相对密度为1.25±0.05的溶液,经AB-8型大孔树脂柱色谱富集纯化,分别以水、30%乙醇、95%乙醇依次洗脱,收集30%乙醇洗脱液,减压回收溶剂得30%乙醇洗脱部分;
(3)正相硅胶柱层析:取步骤(2)所得30%乙醇洗脱部分采用正相硅胶柱,依次采用体积比为5:1的二氯甲烷和甲醇混合溶液、体积比为4:1的二氯甲烷和甲醇混合溶液、体积比为
3:1的二氯甲烷和甲醇混合溶液、体积比为2:1的二氯甲烷和甲醇混合溶液、体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶液、体积比为1:2的二氯甲烷和甲醇混合溶液、甲醇进行系统梯度洗脱,收集馏分,经薄层色谱层析检识后相近者合并,根据洗脱顺序依次得到Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4四部分;
(4)反相硅胶柱层析:取Fr.2部分减压回收溶剂,通过反相硅胶ODS柱色谱,依次以体积比为1.5:1的甲醇和水混合溶液、体积比为1:1的甲醇和水混合溶液进行洗脱,收集体积比为1:1的甲醇和水混合溶液洗脱部分,回收溶剂;
(5)葡聚糖凝胶柱纯化:取经步骤(4)层析后的产物,通过葡聚糖凝胶柱,以50%甲醇洗脱,收集洗脱液,回收溶剂,得粗品;
(6)制备型HPLC纯化:将步骤(5)所得粗品采用甲醇溶解进入制备型HPLC,流动相为体积比为30:70的甲醇和水混合溶液,流速为3mL/min,收集馏分后,回收干燥即得。
5.权利要求1所述4(S)-4,5-二羟基-α-四氢萘酮4-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷在制备预防和治疗肿瘤药物方面的应用。
6.权利要求1所述4(S)-4,5-二羟基-α-四氢萘酮4-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷在制备预防和治疗宫颈癌、肺癌药物方面的应用。
说明书 :
化合物4(S)-4,5-二羟基-α-四氢萘酮4-O-β-D-吡喃葡萄糖(1
→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷及其制备方法与应用
技术领域
背景技术
发明内容
95%乙醇的用量与原料的比例为6L:1kg,合并提取液过滤即得上述乙醇提取液;
(2)富集纯化:将步骤(1)所得粉末状提取物用水分散至相对密度为1.25±0.05的溶液,经AB-8型大孔树脂柱色谱富集纯化,分别以水、30%乙醇、95%乙醇依次洗脱,收集30%乙醇洗脱液,减压回收溶剂得30%乙醇洗脱部分;
(3)正相硅胶柱层析:取步骤(2)所得30%乙醇洗脱部分采用正相硅胶柱,依次采用体积比为5:1的二氯甲烷和甲醇混合溶液、体积比为4:1的二氯甲烷和甲醇混合溶液、体积比为
3:1的二氯甲烷和甲醇混合溶液、体积比为2:1的二氯甲烷和甲醇混合溶液、体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶液、体积比为1:2的二氯甲烷和甲醇混合溶液、甲醇进行系统梯度洗脱,收集馏分,经薄层色谱层析检识后相近者合并,根据洗脱顺序依次得到Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4四部分;其中,采用的甲醇均为100%甲醇;
(4)反相硅胶柱层析:取Fr.2部分减压回收溶剂,通过反相硅胶ODS柱色谱,依次以体积比为1.5:1的甲醇和水混合溶液、体积比为1:1的甲醇和水混合溶液进行洗脱,收集体积比为1:1的甲醇和水混合溶液洗脱部分,回收溶剂;
(5)葡聚糖凝胶柱纯化:取经步骤(4)层析后的产物,通过葡聚糖凝胶柱,以50%甲醇洗脱,收集洗脱液,回收溶剂,得粗品;
(6)制备型HPLC纯化:将步骤(5)所得粗品采用甲醇溶解进入制备型HPLC,流动相为体积比为30:70的甲醇和水混合溶液,流速为3mL/min,收集馏分后,回收干燥即得。
附图说明
图3为本发明化合物的1H-NMR谱图;
图4为本发明化合物的13C-NMR谱图;
图5为本发明化合物的DEPT谱图;
图6为本发明化合物的HSQC谱图;
图7为本发明化合物的HMBC谱图;
图8为本发明化合物的HMBC谱主要相关关系图。
具体实施方式
(2)分离:将步骤(1)所得乙醇提取物用水分散至相对密度为1.25±0.05(35℃)的溶液,经AB-8型大孔树脂(色谱柱内径5cm长1.2m,其中树脂有效高度0.8m)柱色谱富集纯化,分别以水(用量4.5个柱体积)、30%乙醇(6个柱体积)、95%乙醇(5个柱体积)依次洗脱,收集
30%乙醇洗脱液,减压回收溶剂,干燥后得30%乙醇洗脱部分26g;
(3)正相硅胶柱层析:取步骤(2)所得30%乙醇洗脱部分采用正相硅胶柱(色谱柱内径
3cm长1.5m,其中硅胶有效高度1m),依次采用二氯甲烷-甲醇(5:1,V/V,1柱体积)→二氯甲烷-甲醇(4:1,V/V,2柱体积)→二氯甲烷-甲醇(3:1,V/V,1.5柱体积)→二氯甲烷-甲醇(2:
1,V/V,1.5柱体积)→二氯甲烷-甲醇(1:1,V/V,1.5柱体积)→二氯甲烷-甲醇(1:2,V/V,0.5柱体积)→甲醇(1个柱体积)进行系统梯度洗脱,每150mL(补充各馏分体积)收集馏分,经薄层色谱层析检识后相近者合并,根据洗脱顺序依次得到Fr.1、F.2、Fr.3、Fr.4四部分;
(4)反相硅胶柱层析:取Fr.2部分减压回收溶剂,干燥后得3.9g,通过反相硅胶ODS柱色谱(色谱柱内径2cm,长0.8m,其中反相硅胶有效高度0.4m),以甲醇:水=1.5:1(V/V)洗脱5个柱体积,弃去。然后更换至甲醇:水=1:1(V/V)洗脱3个柱体积,收集洗脱液,回收至干称重
1.2g;
(5)葡聚糖凝胶柱纯化:步骤(4)纯化后所得产品,结合葡聚糖凝胶柱色谱(内径1.5cm,柱长1.5m),以50%甲醇洗脱,洗脱1.5个柱体积弃去,然后再洗脱2个柱体积,收集馏分回收至干,称重0.19g;
(6)制备型HPLC纯化:将步骤(5)葡聚糖凝胶柱纯化后的产物用甲醇溶解(进样浓度不超过20mg/mL)进入制备型HPLC(Waters,515-2414,SunFireTM Prep C18,250 mm×10 mm i.d.,5μm),以流动相(MeOH:H2O= 30:70,V/V,流速3mL/min)得到本发明化合物(3.8mg,tR=
22.5min)。
实施例1制备得到的化合物为黄色无定形粉末(MeOH)。UV光谱(MeOH)在258 nm处呈现最大吸收。正性HR-ESI-MS谱中,如图2所示,在m/z 525.1593处可见[M+Na]+离子峰,表明该
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化合物的分子量为502。结合 H-NMR、C-NMR及DEPT谱等推测其分子式为C22H30O13,计算其不饱和度为8。
使用人宫颈癌HeLa、人肺癌细胞A549细胞株对化合物进行活性测试。
阳性对照组:5-氟尿嘧啶组:5.3、10.5、23.8、47.5、95、190 μM;
空白对照组:细胞培养液。
5.3、10.5、23.8、47.5、95、190 μM每组均设3个平行孔。溶液继续在37℃ 5% CO2 培养箱中共同培养48h。每孔加入20 μL MTT 溶液(5 mg/mL,溶解于PBS中,继续培养4 h后,终止培养。小心吸弃上清液,每孔加入150 μL DMSO,摇床上震荡10min,使结晶物完全充分溶解。用酶标仪在550 nm处测每孔的吸光值(A),计算出细胞存活抑制率:细胞存活抑制率%=[1-(实验组A-空白组A)/(对照组A-空白组A)]×100%。数据使用SPSS软件分析系统进行处理。