调控植物叶绿素合成的复合物及其应用

摘要

本发明提供一种调控植物叶绿素合成的复合物及其应用。具体地，本发明提供了一种蛋白-核酸复合物，所述的复合物是SCL27蛋白结合于PORC基因的特定区域而形成。实验证实，该复合物可参与调控PORC基因的表达，从而简便有效地调控植物叶绿素的合成，调节植物叶绿素的含量及叶片颜色等性状，进而达到控制叶色或调节植物光合作用效率的目的。

权利要求

1.一种蛋白-核酸复合物，其特征在于，所述的复合物是SCL27蛋白结合于PORC基因的选自下组的序列而形成：(a)-788nt至-598nt的核酸片段II，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第911-1100位所示；

(b)-572nt至-372nt的核酸片段III，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第1127-1326位所示；

(c)-500nt～-438nt的核酸片段W，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第1199-1260位所示；

(d)POC的全长启动子区。

2.一种分离的核酸序列，其特征在于，所述的核酸序列选自下组：(a)PORC基因的-788nt至-598nt的核酸片段II，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第

911-1100位所示；

(b)PORC基因的-572nt至-372nt的核酸片段III，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第1127-1326位所示；

(c)PORC基因的-500nt～-438nt的核酸片段W，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第

1199-1260位所示。

3.如权利要求2所述的核酸序列的用途，其特征在于，用于制备权利要求1所述的复合物。

4.一种权利要求1所述的蛋白-核酸复合物或权利要求2所述的核酸序列的用途，其特征在于，用于调控叶绿素合成，或用于制备调控叶绿素的制剂。

5.一种反义序列，其特征在于，所述的反义序列与权利要求2中任一核酸序列完全或部分互补。

6.一种权利要求5所述的反义序列的用途，其特征在于，用于调控叶绿素合成，或用于制备调控叶绿素的制剂。

7.一种抑制剂或促进剂的用途，其特征在于，所述的抑制剂或促进剂是权利要求1所述的蛋白-核酸复合物的抑制剂或促进剂，并且所述抑制剂或促进剂被用于用于调控叶绿素合成，或用于制备调控叶绿素的制剂；

较佳地，所述的抑制剂为PORC基因的-500nt～-438nt的核酸片段，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第1199-1260位所示。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂是SCL27蛋白，并且所述的调控是抑制叶绿素的合成或降低植物中叶绿素的含量；或所述的促进剂是miR171，并且所述的调控是促进叶绿素的合成或提高植物中叶绿素的含量。

9.一种改良植物的方法，其特征在于，所述的改良包括促进叶绿素的合成，其中，所述方法包括步骤：降低所述植物中权利要求1所述复合物的数量。

10.一种确定测试物质是否是促进或抑制权利要求1所述复合物的促进剂或抑制剂的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(i)在对照组，在适合形成所述复合物中的条件下，将SCL27蛋白或其活性片段与PORC基因的启动子区域的特定区域进行孵育，从而形成本发明的复合物，测定所述复合物的数量，记为C0；并且在测试组中，在与对照组相同的所述条件下，在添加了测试物质的情况下，测定所述测试组中本发明所述复合物的数量，记为C1；

其中，所述的特定区域选自下组：

(a)PORC基因的-788nt至-598nt的核酸片段II，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第

911-1100位所示；

(b)PORC基因的-572nt至-372nt的核酸片段III，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第1127-1326位所示；

(c)PORC基因的-500nt～-438nt的核酸片段W，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第

1199-1260位所示；

(d)POC的全长启动子区；

(ii)比较所述C0和C1，如果C1显著高于C0，则表明所述测试物质为促进所述复合物形成的促进剂；如果如果C1显著低于C0，则表明所述测试物质为抑制所述复合物形成的抑制剂。

说明书

调控植物叶绿素合成的复合物及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及植物基因工程领域，具体地，本发明提供了一种调控植物叶绿素合成的复合物、核酸序列及其应用。

背景技术

[0002] 高等绿色植物光合作用的光反应必须在叶绿体内完成，叶绿体中接受光能的主要分子是叶绿素，包括叶绿素a和叶绿素b，叶绿素能捕获光子，将光能转变为化学能，从而为植物的合成代谢和生长提供原动力。

[0003] 叶绿素由叶绿体DNA编码，但其表达和定位都受到核基因的严格控制。由于叶绿素是植物光合作用的基础，所以研究和开发参与该途径的相关基因及控制功能，对提高植物的光合效率和产量有重要的作用。

[0004] 研究表明，叶绿素合成调控机理非常复杂。一般来说，植物快速生长的时候，合成叶绿素也慢。

[0005] 叶绿素存在于蛋白复合体中，在光合作用中参与两大重要功能，即捕获光能并将其传递至光系统反应中心。在此过程中，叶绿素分子被激发后不可避免地产生高能单线态氧，从而抑制光合作用及植物生长，严重的情况下会导致细胞死亡。另外，叶绿素合成过程中的许多中间产物也是潜在的光敏剂，在光照条件下产生活性氧。因此，叶绿素合成途径必须受到精密调控。经过一个多世纪的研究，现已明确叶绿素合成途径主要的调控点位于ALA的合成、Mg分支位点以及由POR酶催化的原叶绿素酸酯向叶绿素的转化。

[0006] 综上所述，目前本领域对于叶绿素的合成还了解较少，因此，本领域迫切需要开发参与和/或调控叶绿素合成的技术，例如开发在植物生长的同时快速促进叶绿素的合成的方法，从而应用于农业、园艺等领域。

发明内容

[0007] 本发明的目的就是提供一种可有效调控植物叶绿素合成的复合物及其应用。

[0008] 在本发明的第一方面，提供了一种蛋白-核酸复合物，所述的复合物是SCL27蛋白结合于PORC基因的选自下组的序列而形成：

[0009] (a)-788nt至-598nt的核酸片段II，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第911-1100位所示；

[0010] (b)-572nt至-372nt的核酸片段III，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第1127-1326位所示；

[0011] (c)-500nt～-438nt的核酸片段W，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第1199-1260位所示；

[0012] (d)POC的全长启动子区。

[0013] 在另一优选例中，所述的SCL27蛋白结合于所述序列的GT顺式作用元件。

[0014] 在另一优选例中，所述的POC的全长启动子区的序列如SEQ ID NO.:1所示。

[0015] 在另一优选例中，所述的复合物是SCL27 蛋白结合于PORC 基因的-500nt～-438nt的核酸片段所形成的。

[0016] 在本发明的第二方面，提供了一种分离的核酸序列，所述的核酸序列选自下组：

[0017] (a)PORC基因的-788nt至-598nt的核酸片段II，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第911-1100位所示；

[0018] (b)PORC基因的-572nt至-372nt的核酸片段III，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第1127-1326位所示；

[0019] (c)PORC基因的-500nt～-438nt的核酸片段W，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第1199-1260位所示。

[0020] 在另一优选例中，用于制备本发明第一方面所述的复合物。

[0021] 在本发明的第三方面，提供了一种本发明第一方面所述的蛋白-核酸复合物或本发明第二方面所述的核酸序列的用途，它们被用于调控叶绿素合成，或用于制备调控叶绿素的制剂。

[0022] 在另一优选例中，所述的调控包括：抑制叶绿素的合成，和/或降低植物中叶绿素的含量。

[0023] 在本发明的第四方面，提供了一种反义序列，所述的反义序列与本发明第二方面中任一核酸序列完全或部分互补。

[0024] 在另一优选例中，所述的反义序列与元件(a)、(b)或(c)完全互补。

[0025] 在本发明的第五方面，提供了本发明第四方面所述的反义序列的用途，它们被用于调控叶绿素合成，或用于制备调控叶绿素的制剂。

[0026] 在另一优选例中，所述的调控是促进叶绿素的合成，或提高植物中叶绿素的含量。

[0027] 在本发明的第六方面，提供了一种抑制剂或促进剂的用途，所述的抑制剂或促进剂是本发明第一方面所述的蛋白-核酸复合物的抑制剂或促进剂，并且所述抑制剂或促进剂被用于用于调控叶绿素合成，或用于制备调控叶绿素的制剂。

[0028] 在另一优选例中，所述的抑制剂为PORC基因的-500nt～-438nt的核酸片段，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第1199-1260位所示。

[0029] 在另一优选例中，所述的抑制剂是SCL27蛋白，并且所述的调控是抑制叶绿素的合成或降低植物中叶绿素的含量。

[0030] 在另一优选例中，所述的促进剂是miR171，并且所述的调控是促进叶绿素的合成或提高植物中叶绿素的含量。

[0031] 在本发明的第七方面，提供了一种改良植物的方法，所述的改良包括促进叶绿素的合成，其中，所述方法包括步骤：降低所述植物本发明第一方面所述复合物的数量。

[0032] 在另一优选例中，所述方法包括通过提高miR171的数量，从而降低所述复合物的数量。

[0033] 在另一优选例中，所述的植物包括农作物(如水稻、小麦)和模式植物(如拟南芥)。

[0034] 在本发明的第八方面，提供了一种确定测试物质是否是促进或抑制本发明第一方面所述复合物的促进剂或抑制剂的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

[0035] (i)在对照组，在适合形成所述复合物中的条件下，将SCL27蛋白或其活性片段与PORC基因的启动子区域的特定区域进行孵育，从而形成本发明的复合物，测定所述复合物的数量，记为C0；并且在测试组中，在与对照组相同的所述条件下，在添加了测试物质的情况下，测定所述测试组中本发明所述复合物的数量，记为C1；

[0036] 其中，所述的特定区域选自下组：

[0037] (a)PORC基因的-788nt至-598nt的核酸片段II，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第911-1100位所示；

[0038] (b)PORC基因的-572nt至-372nt的核酸片段III，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第1127-1326位所示；

[0039] (c)PORC基因的-500nt～-438nt的核酸片段W，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第1199-1260位所示；

[0040] (d)POC的全长启动子区；

[0041] (ii)比较所述C0和C1，如果C1显著高于C0，则表明所述测试物质为促进所述复合物形成的促进剂；如果如果C1显著低于C0，则表明所述测试物质为抑制所述复合物形成的抑制剂。

[0042] 优选地，所述“显著高于”指C1/C0≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3.0。

[0043] 优选地，所述“显著高于”指C1/C0≤2/3，较佳地≤1/2，更佳地≤1/3。

[0044] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

[0045] 图1显示了miR171靶向的SCL蛋白在光下通过POR调控叶绿素的合成。

[0046] 其 中，图 1(a)显 示 了 野 生 型(Col)、MIR171c-OX、scl6 scl22 scl27 和35S::LUC-rSCL27植株在长日照条件下生长25天的表型。Bars＝1cm.

[0047] 图1(b)显示了对应于(a)图中的各植株叶片的叶绿素含量。

[0048] 图1(c)显示了植株在强光(800μmol m-2 s-1)处理以及黑暗恢复后的光系统II的活性(Fv/Fm)。

[0049] 图1(d)显示了Northern杂交分析各突变体中HEMA1、GUN4、GUN5、PORC和CAO基因的转录水平。

[0050] 图1(e)显示了免疫印记检测POR在各突变体中的蛋白水平。

[0051] 图1(f)显示了用人工microRNA技术(por-amiR和por-amiR/MIR171c-OX)分别在野生型和MIR171c-OX背景中下调POR基因的表达。图为生长22天的植株表型。Bars＝1cm。

[0052] 图1(g)显示了对应于图1(f)的各基因型植株的叶绿素含量。

[0053] 图1(h)显示了用人工microRNA技术在scl6 scl22 scl27背景中下调POR基因的表达，导致叶片变黄。Bars＝1cm。

[0054] 图1(i)显示了对应于图1(h)的各基因型植株的叶绿素含量。

[0055] 图2显示了SCL27直接结合PORC基因的启动子区。

[0056] 其中，图2(a)显示了三段不同长度的PORC启动子区(pPORC-1685、pPORC-861、pPORC-455)的相对活性。由pPORC-1685、pPORC-861、pPORC-455驱动的LUC报告基因在烟草叶片中与6xMYC-rSCL27或空载共转。LUC的相对活性与内源性对照35S::REN进行标准化后衡量。

[0057] 图2(b)显示了PORC启动子及其基因的示意图。DNA片段I(-1,524bp到-1,324bp)、ΙΙ(-778bp到-598bp)、ΙΙΙ(-572bp到-372bp)用于ChIP实验，而编码区的DNA片段IV(1,144bp到1,246bp)则作为负对照。

[0058] 图2(c)显示了ChIP沉淀中各DNA片段的相对丰度。

[0059] 图2(d)显示了EMSA实验证实SCL27结合到PORC启动子区的片段II和III。

[0060] 图2(e)显示了包含GT元件的DNA片段(W)及其对应的突变片段(M)。

[0061] 图2(f)显示了EMSA实验证实SCL27能够结合GT元件(W)片段而不能结合GT元件(M)片段。

[0062] 图2(g)显示了当加入未标记的GT元件(W)时能够竞争结合SCL27蛋白，而当加入未标记的GT元件(M)时则不能发生竞争结合。

[0063] 图3显示了PORC启动子区域的序列(SEQ ID NO.:1)，其中核心的含4个GT元件的区域用下划线标示。

具体实施方式

[0064] 本发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现，在植物中存在一种SCL27：PORC复合物。利用该复合物，本发明人首次通过有效PORC基因的过量表达或者沉默调节植物叶绿素的含量以及叶片颜色等性状，从而达到控制夜色或调节植物光合作用效率的目的。在此基础上完成了本发明。

[0065] 如本文所用，术语“本发明的复合物”、“SCL27-PORC复合物”、“本发明的蛋白-核酸复合物”、或“SCL27蛋白-PORC基因复合物”可互换使用，均指SCL27蛋白(或其活性片段)结合于PORC基因的启动子区域的某些特定区域而形成的复合物。本发明的研究表明，该复合物在调控叶绿素合成中发挥核心作用。

[0066] PORC基因及其启动子

[0067] 在本发明的蛋白-核酸复合物中，一种核心元件是PORC基因的启动子区域。

[0068] PORC基因的序列可参见例如公共数据库。

[0069] 一种典型的PORC基因的启动子序列如SEQ ID NO.:1中所示。该启动子区域对应于PORC基因上游的-1698nt至-1nt的核苷酸序列。

[0070] SCL27蛋白

[0071] 在本发明的蛋白-核酸复合物中，另一种核心元件是SCL27蛋白。

[0072] 如本文所用，术语“SCL27蛋白”指一类植物特有的转录因子，属于GRAS(GAI,RGA,SCR)蛋白家族。本发明的研究表明，miR171可以靶向SCL27转录因子。

[0073] 一种典型的SCL27的氨基酸序列如下所示：

[0074] MPLSFERFQGEGVFGLSSSSFYSDSQKIWSNQDKTEAKQEDLGYVVGGFLPEPTSVLDALRSPSPLASYSSTTTTLSSSHGGGGTTVTNTTVTAGDDNNNNKCSQMGLDDLDGVLSASSPGQEQSILRLIMDPGSAFGVFDPGFGFGSGSGPVSAPVSDNSNLLCNFPFQEITNPAEALINPSNHCLFYNPPLSPPAKRFNSGSLHQPVFPLSDPDPGHDPVRRQHQFQFPFYHNNQQQQFPSSSSSTAVAMVPVPSPGMAGDDQSVI IEQLFNAAELIGTTGNNNGDHTVLAQGILARLNHHLNTSSNHKSPFQRAASHIAEALLSLIHNESSPPLITPENLILRIAAYRSFSETSPFLQFVNFTANQSILESCNESGFDRIHIIDFDVGYGGQWSSLMQELASGVGGRRRNRASSLKLTVFAPPPSTVSDEFELRFTEENLKTFAGEVKIPFEIELLSVELLLNPAYWPLSLRSSEKEAIAVNLPVNSVASGYLPLILRFLKQLSPNIVVCSDRGCDRNDAPFPNAVIHSLQYHTSLLESLDANQNQDDSSIERFWVQPSIEKLLMKRHRWIERSPPWRILFTQCGFSPASLSQMAEAQAECLLQRNPVRGFHVEKRQSSLVMCWQRKELVTVSAWKC(SEQ ID NO.:2)。

[0075] 应理解，在本发明中，SCL27蛋白不仅包括来自拟南芥或水稻的SCL27蛋白，还包括来源于其他不同的具有叶绿素的植物的同源蛋白。此外，该SCL27蛋白不仅包括野生型蛋白，而且还包括其突变型蛋白或活性片段，只要所述突变型蛋白或活性片段仍保留与PORC基因的启动子区域(尤其是片段II、片段III和片段A)结合能力并进而调控PORC基因表达的功能或能力。

[0076] 作为具有叶绿素的植物，代表性的例子包括：单子叶植物、双子叶植物以及其他低等植物。优选的植物例子(但并不限于)：农作物(如水稻、小麦、玉米)、花卉、树木、以及模式植物(如拟南芥)等。

[0077] 蛋白-核酸复合物

[0078] 在本发明中，提供了一种SCL27-PORC复合物(也称为“本发明复合物”)，该复合物是SCL27蛋白(或其活性片段)结合于PORC基因的启动子区域的某些特定区域而形成的，这些特定区域包括(但并不限于)：

[0079] (a)-788nt至-598nt的核酸片段II，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第911-1100位所示；

[0080] (b)-572nt至-372nt的核酸片段III，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第1127-1326位所示；

[0081] (c)-500nt～-438nt的核酸片段，该片段的序列如SEQ ID NO.:1中第1199-1260位所示；

[0082] (d)POC的全长启动子区。

[0083] 利用本发明的复合物，不仅可以在植物体内中可逆地调控(包括促进或抑制)叶绿素的合成，还可以在体外高效地筛选(a)促进所述复合物形成的促进剂；和(b)抑制所述复合物形成的抑制剂。

[0084] 典型地，一种典型地确定测试物质是否是促进或抑制本发明复合物的促进剂或抑制剂的方法包括步骤：

[0085] (a)在对照组，在适合形成本发明所述复合物中的条件下，将SCL27蛋白(或其活性片段)与PORC基因的启动子区域的上述特定区域进行孵育，从而形成本发明的复合物，测定所述复合物的数量，记为C0；并且在测试组中，在与对照组相同的所述条件下，在添加了测试物质的情况下，测定所述测试组中本发明所述复合物的数量，记为C1；

[0086] (b)比较所述C0和C1，如果C1显著高于C0，则表明所述测试物质为促进所述复合物形成(或防止所述复合物解离)的促进剂；如果如果C1显著低于C0，则表明所述测试物质为抑制所述复合物形成(或促进所述复合物解离)的抑制剂。

[0087] 通常，所述“显著高于”指C1/C0≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3.0。

[0088] 通常，所述“显著高于”指C1/C0≤2/3，较佳地≤1/2，更佳地≤1/3。

[0089] 优选地，所述的测试物质包括(但并不限于)：小分子化合物、激素、蛋白、糖类、核酸等。

[0090] 多核苷酸构建物

[0091] 根据本发明所提供的miRNA序列(即miR171)，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被宿主细胞剪切且表达成所述的miRNA。

[0092] 作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式II所示的结构：

[0093] Seq正向-X-Seq反向

[0094] 式II

[0095] 式II中，

[0096] Seq正向为可在细胞中表达成所述的miR171的核苷酸序列，Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq正向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；

[0097] X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；

[0098] 式I所示的结构在转入宿主细胞后，形成式III所示的二级结构：

[0099]

[0100] 式III

[0101] 式III中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述；

[0102] ||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。

[0103] 通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

[0104] miR171的反义核酸分子

[0105] 本发明还提供了一种针对miR171的反义核酸分子，所述的反义核酸分子可竞争性地抑制miR171的作用，通过构建含有该反义核酸分子的表达载体，对反义核酸分子进行超表达，从而对miR171的作用进行干扰。

[0106] 本领域的普通技术人员可以使用通用的方法构建所述的反义核酸分子的超表达载体。

[0107] 本发明的主要优点在于：

[0108] (a)首次提供了一种有效而简便地调控叶绿素合成的手段。

[0109] (b)利用本发明首次发现的“蛋白-核酸复合物”，不仅可以方便而有效地正调控(促进)叶绿素的合成，而且可以方便而有效地负调控(抑制)叶绿素的合成。

[0110] (c)利用本发明的首次发现的“蛋白-核酸复合物”，可以可逆地调控叶绿素的合成。

[0111] (d)利用本发明的首次发现的“蛋白-核酸复合物”，可方便地在体外筛选促进或抑制叶绿素合成的化合物或其他物质。

[0112] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

[0113] 材料

[0114] 实施例中所用引物如下表1所示:

[0115] 表1

[0116]

[0117]

[0118]

[0119] 方法：

[0120] 植物材料和生长条件

[0121] MIR171c-OX与35S::LUC-rSCL27是拟南芥哥伦比亚(Columbia)生态型背景；scl6、scl22、scl27三突变体是通过scl6(Ler背景)、scl27(Ws背景)以及scl22(Col背景)杂交方法获得的；之后三突变体与Col回交四代；por-amiR/MIR171c-OX植株是通过把por-amiR和MIR171c-OX杂交获得的；所有的种子均在含有1％蔗糖的1/2MS培养基上发-2 -1
芽，植物在长日照条件下生长，温度为21℃，光照强度为110μmol﹒m ﹒s 。

[0122] 质粒构建和植物转化

[0123] PORC启动子区1.7kb片段从野生型基因组DNA中扩增，然后通过酶切连接克隆到pGREEN0800LUC载体，构建产生pPORC-1685::LUC载体。

[0124] PORC起始密码子上游861bp和455bp片段也用同样的方法构建到pGREEN0800LUC载体。为了构建POR amiRNA，PORC基因的amiRNA靶向序列通过WMD3网站(http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi)预测，amiRNA前体片段通过PCR技术从pRS300(购自Tübingen Univers ity，Germany)模板扩增获得，并用gateway(invitrogen)系统构建到植物表达载体pGWB2(invi trogen)。为了进行体外蛋白质-DNA结合分析，将SCL27克隆到pET28b载体并转化表达菌株BL21。

[0125] 荧光定量PCR

[0126] 定量PCR分析用SYBR-Green PCR Mastermix(Takara)进行，其扩增过程由荧光定量监测PCR系统记录(Appl ied Biosystems)。

[0127] ChIP分析

[0128] 将生长三周的6xMYC-rSCL27-OX转基因植株约3克进行固定、超声并重悬于提取液中分为三份。其中一份作为上样量对照，第二份加入MYC-agarose(Sigma)进行沉淀，第三份加入HA-agarose作为负对照。获得的DNA样品用PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化，相应DNA片段的浓度通过定量PCR进行分析。

[0129] EMSA.

[0130] 将Cy5荧光标记的DNA与体外纯化的SCL27蛋白在结合溶液中于30℃孵育20分钟，然后用6％丙烯酰胺非变性胶在4℃ 100V条件下电泳1-2h(电泳液为5xTris-borate-EDTA).电泳后，胶上的DNA荧光信号用Starion FLA-9000进行检测。

[0131] 结果

[0132] miR171靶向的SCL蛋白在光下通过POR调节叶绿素的合成

[0133] 与之前的报道一致，MIR171c过量和scl6scl22scl27三突变体叶片都是深绿色的，其叶绿素含量大约高于野生型40％。而过量表达不受miR171调控的LUC-rSCL27荧光素酶融合蛋白的转基因植株叶片变黄，叶绿素含量显著降低。这些结果提示miR171靶向的SCL蛋白是叶绿素合成的负调节因子。于是本发明人通过检测反应光系统II活性的最大光化学效率Fv/Fm，评估了SCL蛋白在植物强光胁迫条件下的功能。相较于野生型，MIR171c-OX和scl6 scl22 scl27植株的光系统II活性下降的比较慢，而LUC-rSCL27-OX植株的光系统II活性则下降的更快，因此miR171靶向的SCL蛋白参与植物对强光的适应性。因为叶绿素合成途径在黑暗和光照条件下受到不同的调控，本发明人首先检测了在暗下SCL蛋白的功能。有意思的是，野生型相较于MIR171c-OX、scl6、scl22、scl27或者LUC-rSCL27-OX植株在原叶绿素酸酯的含量以及原片层体的结构上都没有显著差异。综上，发明人认为SCL蛋白主要在光下参与叶绿素合成的抑制。

[0134] 为了证明SCL蛋白是否直接参与叶绿素合成途径的调控，本发明人检测了参与到叶绿素合成关键步骤的一些基因包括HEMA1、GUN4、GUN5、PORC和CAO的转录水平。Northern杂交和定量PCR分析表明，在这些基因中只有PORC和CAO的表达在MIR171c-OX和scl6 scl22 scl27植株中升高而在LUC-rSCL27-OX植株中降低。PORC和CAO的这种表达模式与在MIR171c-OX、scl6、scl22、scl27和LUC-rSCL27-OX植株中的叶绿素含量是吻合的，提示PORC和CAO的表达是受到SCL蛋白调控的。而GUN4、GUN5和HEMA1的表达模式与SCL的转录水平不相关。免疫印迹实验显示MIR171c-OX和scl6 scl22 scl27相较于野生型和LUC-rSCL27-OX植株积累更高水平的PORC和PORB蛋白。因为CAO是一个控制叶绿素b合成的关键酶，如果CAO也是SCL的一个主要靶标，那么叶绿素a/b的值应该会随着SCL的表达水平而改变。但是，在野生型、MIR171c-OX、scl6 scl22 scl27和LUC-rSCL27-OX植株中叶绿素a/b并没有显著差异，提示CAO活性并不受到SCL的转录调控。因此本发明的实验结果表明，在叶绿素合成途径中，POR是一个受SCL蛋白调控的关键酶。

[0135] 为了确定SCL蛋白调控的叶绿素合成是否由POR所介导，利用人工microRNA技术在野生型、MIR171c-OX和scl6 scl22 scl27中下调POR的表达。在这些植株中POR表达水平的下调导致新叶淡绿的表型和叶绿素含量的显著下降。这些结果都证实POR在SCL调控的叶绿素合成途径中起着重要作用。

[0136] SCL27结合于PORC启动子

[0137] 本发明的试验结果表明POR的表达与SCL的表达密切相关，这促使本发明人考虑SCL是否能够直接控制POR基因的启动子活性。

[0138] 为了检测这个假说是否成立，本发明人将POR启动子融合的LUC与6xMYC-rSCL27在烟草中用瞬时表达体系共转化。LUC的表达在与6xMYC-rSCL27共转时下降很多，提示PORC启动子区是SCL27的直接作用靶标。

[0139] 为了鉴定SCL27结合的PORC启动子区，本发明人将PORC启动子区的三个不同长度的片段(从启动子到上游的-1685bp、-861bp和-455bp)与LUC报告基因融合，pPORC-1685与pPORC-861驱动的LUC的表达会在6xMYC-rSCL27共转时显著抑制，而pPORC-455驱动的LUC的表达量较低，并且不受6xMYC-rSCL27的影响。这些结果提示位于POR启动子区-861到-455之间的区域含有SCL27的顺式作用元件。

[0140] 本发明人进一步进行了染色质免疫共沉淀(ChIP)实验和定量PCR分析来进一步缩小SCL27的结合位点。

[0141] 实验结果显示，在6xMYC-rSCL27转基因植株中，片段II(-788bp到-598bp)和片段III(-572bp到-372bp)在免疫共沉淀中富集，而片段I(-1524bp到-1324bp)和编码区的片段IV(1,144bp到1,246bp)并没有富集，提示片段II和III均含有SCL结合的顺式作用元件。本发明人于是进行了EMSA实验来检测是否SCL27能够直接结合到PORC启动子区的片段II和片段III。与CHIP-qPCR结果一致，当SCL27重组蛋白与DNA片段II和III孵育后可以检测到迁移的条带，并且带的强度随着SCL蛋白浓度的增加而逐渐增强，而当SCL27与片段I孵育后则没有检测到迁移。总之，本发明的体内体外实验均表明SCL27能够直接结合PORC启动子，并抑制基因的表达。

[0142] 生物信息学分析显示，片段II和片段III包含与GT1结合区一致的顺式作用元件G(A/G)(A/T)AA(A/T)，称为GT元件。GT元件在许多基因的启动子区广泛分布。为了检测是否SCL27直接结合GT元件，本发明人选择了位于-500bp到-438bp区域包含三个GT元件重复结构域的62bp长的DNA片段(W)以及对应的GT元件突变片段(M)进行EMSA实验，结果显示SCL重组蛋白能够结合到W片段，但不能结合到M片段，并且SCL27-DNA的结合能够被过量的未标记W片段所抑制，而M片段则没有作用。

[0143] 上述结果表明，SCL27通过直接结合于PORC基因启动子的特定的GT元件(尤其是核酸片段A中的GT元件)调控PORC的表达。

[0144] 此外，试验表明，一个GT元件不足以有效地形成本发明的复合物，而下表中的编号为8-11的4个GT元件是PORC基因启动子区域中最有效的SCL27结合区域(即SEQ ID NO.:1中第1199-1260位)，也是对PORC表达调控效果最佳的区域。

[0145] 表 PORC启动子中的GT元件

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[0148] 讨论

[0149] 研究表明，POR基因的转录很大程度上参与了叶绿素合成。拟南芥基因组存在三个POR基因：PORA(在黄化苗中表达量最高，在光下降解)，PORB(光和暗下均表达)和PORC(在光照条件下表达)。研究表明，PORA和PORB的转录主要受到EIN3以及它的同源蛋白EIL1的调控，这两个转录因子可以直接结合PORA和PORB的启动子，称之为EBS位点。而PORC的转录受到转录因子PIF1的正向调节。然而，基于这些相互作用机理对叶绿素合成进行调控，却难以获得令人满意的调控效果。

[0150] 虽然已有研究显示：miR171作用靶标SCL6/22/27参与调控植物的许多重要的生物学过程，但对其作用的分子机制依然知之甚少。为此，本发明人的研究证明：miR171可调控SCL的表达，而SCL在调控叶绿素合成途径的分子机制中起到核心作用。SCL突变导致光下生长的植物叶绿素含量升高(图1)。进一步研究表明，SCL蛋白通过结合光响应基因PORC启动子区的G(A/G)(A/T)AA(A/T)GT顺式元件，从而有效调控编码原叶绿素酸酯氧化还原酶的关键基因的表达(图2)。

[0151] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。