固定化脂肪酶及其制备方法和用途

摘要

本申请公开了固定化脂肪酶，包含固体载体和与其结合的含有纤维素结合域(Cellulose binding domain，CBD)的脂肪酶融合蛋白。本申请还公开产生固定化脂肪酶的方法，以及该固定化脂肪酶在油脂加工领域中的应用。

权利要求

1.固定化脂肪酶，包含固体载体和与其结合的含有纤维素结合域（Cellulose binding domain，CBD）的脂肪酶融合蛋白；

其中所述固定载体为棉布，所述棉布用含有表面活性剂的试剂洗涤并用酸处理。

2.如权利要求1所述的固定化脂肪酶，其由固体载体和与其结合的含有纤维素结合域的脂肪酶融合蛋白组成。

3.如权利要求1或2所述的固定化脂肪酶，其中所述脂肪酶融合蛋白包含以下的氨基酸序列：(a) 脂肪酶的氨基酸序列；以及

(b) 与（a）所述序列融合连接的纤维素结合域的氨基酸序列。

4.如权利要求3所述的固定化脂肪酶，其中所述脂肪酶融合蛋白由以下的氨基酸序列组成：(a) 脂肪酶的氨基酸序列；以及

(b) 与（a）所述序列融合连接的纤维素结合域的氨基酸序列。

5.产生固定化脂肪酶的方法，

提供固体载体，

将含有纤维素结合域（Cellulose binding domain，CBD）的脂肪酶融合蛋白与基质接触；

其中所述固定载体为棉布，所述棉布用含有表面活性剂的试剂洗涤并用酸处理。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述脂肪酶融合蛋白包含以下的氨基酸序列：(a) 脂肪酶的氨基酸序列；以及

(b) 与（a）所述序列融合连接的纤维素结合域的氨基酸序列。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述脂肪酶融合蛋白由以下的氨基酸序列组成：(a) 脂肪酶的氨基酸序列；以及

(b) 与（a）所述序列融合连接的纤维素结合域的氨基酸序列。

8.如权利要求5所述的方法，其中在酸处理后，还包括调节pH的步骤。

9.权利要求1-4任一项所述的固定化脂肪酶在生产柴油中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其包括利用所述固定化脂肪酶将棕榈油脂肪酸（PFAD）甲醇酯化。

说明书

固定化脂肪酶及其制备方法和用途

发明领域

[0001] 本发明属于酶工程与油脂或食品工业领域，具体地，涉及固定化脂肪酶及其制备方法和用途。

[0002] 发明背景

[0003] 脂肪酶是一类特殊的酰基水解酶，能够在油-水界面上催化酯水解、酯合成、酯交换、及立体异构体拆分等化学反应，常被应用于食品、日化、生物能源等领域。将游离酶固定于不溶性固体载体上，有利于提高酶的使用稳定性。

[0004] 目前，关于固定化脂肪酶的研究有了不少进展。比如，采用硅胶或介孔氧化硅，磁颗粒，纳米纤维膜，树脂等直接吸附的方式固定脂肪酶。有用表面修饰阳离子聚合物(如聚乙烯亚胺)去静电吸附脂肪酶，并用交联剂(如戊二醛)加以稳固。还有采用聚丙烯酸酯，聚氨酯，有机硅等作为粘合剂与粗酶粉或酶溶液混成浆状涂布于基质上的方案。

[0005] 至今为止，并未发现固定改造的脂肪酶方法和产品。

发明内容

[0006] 第一方面，提供固定化脂肪酶，包含固体载体和与其结合的含有纤维素结合域(Cellulose binding domain，CBD)的脂肪酶融合蛋白。

[0007] 在一些实施方案中，所述固定化脂肪酶中的脂肪酶融合蛋白包含以下的氨基酸序列或由以下的氨基酸序列组成：

[0008] (a)脂肪酶的氨基酸序列或其变体，所述变体为由所述的脂肪酶的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加至少一个氨基酸后得到的序列，优选地，所述取代、缺失和/或添加的氨基酸为保守氨基酸，更优选地，所述取代、缺失和/或添加发生在所述氨基酸序列的N端和/或C端；以及

[0009] (b)与(a)所述序列融合连接的纤维素结合域的氨基酸序列或其变体，所述变体为由所述的CBD序列经过取代、缺失和/或添加至少一个氨基酸后得到的序列，优选地，所述取代、缺失和/或添加发生在保守氨基酸之间，更优选地，所述取代、缺失和/或添加发生在所述氨基酸序列的N端和/或C端。

[0010] 在一些实施方案中，所述固体载体为含有纤维素的载体，优选含有棉纤维素的固体载体，更优选地，所述固体载体选自棉布和含有微晶纤维素的材料。

[0011] 第二方面，提供产生固定化脂肪酶的方法，包括

[0012] 提供固体载体，

[0013] 将含有CBD的脂肪酶融合蛋白与基质接触。

[0014] 在一些实施方案中，所述方法中的脂肪酶融合蛋白包含以下的氨基酸序列或由以下的氨基酸序列组成：

[0015] (a)脂肪酶的氨基酸序列或其变体，所述变体为由所述的脂肪酶的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加至少一个氨基酸后得到的序列，优选地，所述取代、缺失和/或添加的氨基酸为保守氨基酸，更优选地，所述取代、缺失和/或添加发生在所述氨基酸序列的N端和/或C端；以及

[0016] (b)与(a)所述序列融合连接的纤维素结合域(Cellulose binding domain，CBD)的氨基酸序列或其变体，所述变体为由所述的CBD序列经过取代、缺失和/或添加至少一个氨基酸后得到的序列，优选地，所述取代、缺失和/或添加发生在保守氨基酸之间，更优选地，所述取代、缺失和/或添加发生在所述氨基酸序列的N端和/或C端。

[0017] 在一些实施方案中，所述方法中使用的固体载体为含有纤维素的载体，优选含有棉纤维素的固体载体，更优选地，所述固体载体选自棉布和含有微晶纤维素的材料。

[0018] 在一些实施方案中，所述方法中提供固体载体的步骤包括用含有表面活性剂试剂洗涤固体载体，任选地，还包含用酸处理所述固体载体的步骤，优选地，在酸处理后，还包括调节pH的步骤。

[0019] 第三方面，提供本公开的固定化脂肪酶在生产柴油中应用。

[0020] 第四方面，提供水解脂质的方法，包括

[0021] 提供本公开的固定化脂肪酶，以及

[0022] 将所述固定化脂肪酶与脂质接触，从而使得脂质水解。

[0023] 第五方面，提供酯化方法，包括

[0024] 提供本公开的固定化脂肪酶，以及

[0025] 将所述固定化脂肪酶与脂肪酸和低级醇接触，从而使得所述脂肪酸酯化。

[0026] 第六方面，还提供了本公开的固定化酶的应用，例如融合脂肪酶在乳制品工业、家具清洁产品、油脂化学和医疗领域(治疗肥胖和动脉粥样硬化等)中的应用。

[0027] 附图简要说明

[0028] 图1A显示含纤维素结合域(CBD)的米黑根毛霉(Rhizomucor miehei lipase,RML)脂肪酶(CBDnew-RML)表达。其中，泳道1：诱导剂加入之前菌体取样检测，泳道2：诱导之后菌体破碎液上清，泳道3：诱导之后菌体破碎液沉淀。

[0029] 图1B显示含纤维素结合域的南极假丝酵母(Candida antarctica lipaseB,CALB)脂肪酶(CBDnew-CALB)表达。其中泳道1：空载体(不含目的基因)转化子发酵液，泳道2：目的基因转化子发酵液。

[0030] 图2A-2B显示微晶纤维素脂肪酶(RML和CBDnew-RML)固定化检测。

[0031] 图2A显示RML微晶纤维素固定化：泳道1：粗酶液，泳道2：粗酶液固定化后流过液，泳道3：固定化酶洗涤液(含0.8M NaCl的Tris-Cl缓冲液洗涤)，泳道4：固定化酶变性液(用含10M尿素的Tris-Cl缓冲液变性)。

[0032] 图2B显示CBDnew-RML微晶纤维素固定化：泳道1：粗酶液，泳道2：粗酶液固定化后流过液，泳道3-5：固定化酶洗涤液(含0.8M NaCl的Tris-Cl缓冲液洗涤)，泳道6：固定化酶变性液(用含10M尿素的Tris-Cl缓冲液变性)。

[0033] 图2C显示微晶纤维素脂肪酶(CBDnew-CALB)固定化检测，其中泳道1：酶发酵液，泳道2：发酵液固定化后流出液，泳道3：固定化酶洗涤液(Tris-Cl缓冲液洗涤)，泳道4：固定化酶变性液(用含10M尿素的Tris-Cl缓冲液变性)。

[0034] 图3A-3C显示脂肪酶(RML和CBDnew-RML)棉布固定化检测。

[0035] 图3A显示RML在经过处理的棉布上固定化：泳道1：粗酶液，泳道2：粗酶液固定化后流过液，泳道3：固定化酶洗涤液(含0.8M NaCl的Tris-Cl缓冲液洗涤)，泳道4：固定化酶变性液(用含10M尿素的Tris-Cl缓冲液变性)。

[0036] 图3B显示CBD-RML在未经处理的棉布上的固定化：泳道1：粗酶液，泳道2：粗酶液固定化后流过液，泳道3：固定化酶洗涤液(含0.8M NaCl的Tris-Cl缓冲液洗涤)，泳道4：固定化酶变性液(用含10M尿素的Tris-Cl缓冲液变性)。

[0037] 图3C显示CBDnew-RML在经过处理的棉布上的脂肪酶固定化：泳道1：粗酶液，泳道2：粗酶液固定化后流过液，泳道3-5：固定化酶洗涤液(含0.8M NaCl的Tris-Cl缓冲液洗涤)，泳道6：固定化酶变性液(用含10M尿素的Tris-Cl缓冲液变性)。

[0038] 图3D显示CBDnew-CALB在经过处理的棉布上的脂肪酶固定化检测，其中，泳道1：酶发酵液，泳道2：发酵液固定化后流出液，泳道3：固定化酶洗涤液(Tris-Cl缓冲液洗涤)，泳道4：固定化酶变性液(用含10M尿素的Tris-Cl缓冲液变性)。

[0039] 图4A显示微晶纤维素和棉布固定化CBDnew-RML脂肪酶负载量检测，其中泳道1-5：浓度为50，100，200，500和1000μg/mL的BSA溶液，泳道6：微晶纤维素固定化酶变性液，泳道
7：棉布固定化酶变性液。

[0040] 图4B微晶纤维素和棉布固定化CBDnew-CALB脂肪酶负载量检测，其中泳道1-5：浓度为50，100，200，500和1000μg/mL的BSA溶液，泳道6：微晶纤维素固定化酶变性液，泳道7：棉布固定化酶变性液。

[0041] 图5A显示微晶纤维素和棉布固定化CBDnew-RML脂肪酶酯水解活力检测，纵坐标为每克固定化酶所表现出的酯水解活力。

[0042] 图5B-5C显示微晶纤维素和棉布固定化CBDnew-CALB脂肪酶对棕榈油脂肪酸(PFAD)和甲醇进行酯化的能力检测。图5B显示微晶纤维素和棉布固定化脂肪酶的棕榈油脂肪酸(PFAD)甲醇酯化率曲线，横坐标为相对于PFAD体积的含水量，纵坐标为转化率；图5C显示30％含水量的棉布固定化酶样品反应物状态：左为该样品反应产物，右为未固定酶的同样含水量的棉布作为阴性对照的反应产物。一般凝固状态可认为无酯生成，有酯PFAM生成时，由于其融点低，一般为油状，如左图所示。

[0043] 图6A-6B分别显示融合脂肪酶CBD1-RML和CBD3-RML在经过处理的棉布上的固定化检测，其中泳道1为粗酶液，泳道2为粗酶液固定化后流过液，泳道3为固定化酶洗涤液(含0.8M NaCl的Tris-Cl缓冲液洗涤)，泳道4为固定化酶变性液(用含10M尿素的Tris-Cl缓冲液变性)。

具体实施方式

[0044] 第一方面，提供固定化脂肪酶，其包含固体载体和与其结合的含有纤维素结合域(Cellulose binding domain，CBD)的脂肪酶融合蛋白。

[0045] 在一些实施方案中，所述酶为脂肪酶。在一些实施方案中，脂肪酶选自动物、植物和微生物脂肪酶或其组合。

[0046] 植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽等；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用pH、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源。

[0047] 因此，优选地，本申请所用的脂肪酶来自产生脂肪酶的微生物。例如，所述微生物可以是米黑根毛霉(Rhizomucor  miehei)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、德氏根霉(Rhizopus delemar)、米根霉(Rhizopus oryzae)、米曲霉(Aspergillus oryzea)、南极假丝酵母(Candida antarctic)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、褶皱假丝酵母(Candida rugosa)、柱状假丝酵母(Candida cylindracea)和假单胞菌属(Pseudononas sp.)等。在一优选的实施方案中，本申请所用的脂肪酶为米黑根毛霉脂肪酶(RML)或南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)。

[0048] 在一些实施方案中，本申请公开的纤维素结合域(Cellulose binding domain，CBD)为存在于纤维类原料酶(如纤维素酶)中的相对分子质量在0.4×104～2.0×104Da不等的片段，它可插入和分开纤维素的结晶区，通过芳香族氨基酸疏水平面(疏水作用)以及芳香环与葡萄糖环的堆积力吸附到纤维素链表面。

[0049] 在一些实施方案中，所述纤维素结合域来自动物、植物或诸如真菌和细菌的微生物的纤维素酶。在一些实施方案中，所述纤维素结合域来自真菌和细菌的纤维素酶。在一些实施方案中，所述纤维素结合域来自上述动物、植物或诸如真菌和细菌的微生物的外切葡聚糖酶纤维素酶、内切葡聚糖酶和/或β-葡聚糖苷酶中的纤维素结合域。在一些实施方案中，所述纤维素结合域来自细菌纤维素酶，例如醋酸菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobiou)和/或巴叠球菌属(Sarcina)纤维素酶中的纤维素结合域。典型的细菌纤维素酶的例子有葡糖醋杆菌(Glucoacetobacterxylinum)、产琥珀酸拟杆菌(B.succinogenes)、粪碱纤维单胞菌纤维素酶，或者外切葡聚糖酶纤维素酶、内切葡聚糖酶和/或β-葡聚糖苷酶。在一些实施方案中，所述纤维素结合域来自真菌纤维素酶的纤维素结合域，例如，木棉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)纤维素酶的纤维素结合域。典型的真菌纤维素酶的例子有里氏木霉外切葡聚糖酶、哈茨木霉内切葡聚糖酶II。

[0050] 在一些实施方案中，所述脂肪酶融合蛋白中的纤维素结合域的来源可以与其连接的脂肪酶的来源相同或不同，只要二者能够实现连接形成融合蛋白即可。

[0051] 在一些实施方案中，所述脂肪酶的选择是根据其应用的需要而对其来源进行选择。在一些脂质水解反应的具体实施方案中，可选择偏向水解功能的特定来源的脂肪酶，例如米黑根毛霉脂肪酶(RML)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus,TL)等；在一些酯化反应的具体实施方案中，可选择偏向酯化反应的特定来源的脂肪酶，例如，南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)、TL突变体(Callera trans L，诺维信)等。

[0052] 在一些实施方案中，所述固定化脂肪酶中的脂肪酶融合蛋白包含以下的氨基酸序列或由以下的氨基酸序列组成：

[0053] (a)脂肪酶的氨基酸序列或其变体，所述变体为由所述的脂肪酶的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加至少一个氨基酸后得到的序列，优选地，所述取代、缺失和/或添加的氨基酸为保守氨基酸，更优选地，所述取代、缺失和/或添加发生在所述氨基酸序列的N端和/或C端；以及

[0054] (b)与(a)所述序列融合连接的纤维素结合域的氨基酸序列或其变体，所述变体为由所述的CBD序列经过取代、缺失和/或添加至少一个氨基酸后得到的序列，优选地，所述取代、缺失和/或添加发生在保守氨基酸之间，更优选地，所述取代、缺失和/或添加发生在所述氨基酸序列的N端和/或C端。

[0055] 在一些实施方案中，所述酶变体或CBD变体氨基酸序列与其天然氨基酸序列具有至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同源性或同一性。在优选的实施方案中，酶变体或CBD变体与其天然序列具有99％以上的同源性或同一性。在一些实施方案中，所述酶或CBD的变体可以是与该酶或CBD属于同一物种的其他种属的酶或CBD的天然序列，因种属不同导致序列之间具有上述不同序列或序列同一性。

[0056] 本文所述的“同源性”或“同一性”被定义为经过序列比对和引入空位后，氨基酸或核苷酸序列变体中相同的残基的百分比，如果需要，达到最大百分比的同源性。用于比对的方法和计算机程序在本领域内是公知的，例如利用NCBI公开的Blast(Basic local alignment search tool)进行分析与比对，其中可以使用BLASTP、BLASTN、BLASTX、TBLASTN等。

[0057] 在一些实施方案中，在所述酶或CBD的天然氨基酸序列基础上，取代、缺失或添加1-30个，优选为1-20个，更优选为1-10个氨基酸残基后获得的多肽变体仍然能够进行融合。
在优选的实施方案中，上述变体与其天然氨基酸序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。在更优选的实施方案中，上述变体与天然氨基酸序列相差约
1、2、3、4或5个氨基酸的取代、缺失或添加。在更优选的实施方案中，上述变体是通过在天然氨基酸序列的C端和/或N端区域被截短或添加约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
20、25或更多个氨基酸而获得的。

[0058] 在优选的实施方案中，上述变体的序列是在其天然氨基酸序列中包含一个或几个保守性氨基酸取代的序列，其中经取代后的序列具有与所述天然序列类似的功能。

[0059] 被称为“保守氨基酸取代”的某些氨基酸取代能够在蛋白质中频繁出现，但不改变该蛋白质的构象或功能，这是蛋白质化学中已建立的法则。

[0060] 本申请中的保守氨基酸取代包括但不限于用甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)中的任一个取代这些脂肪族氨基酸的任何另外一个；用丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)，反之亦然；用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；用谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，反之亦然；用赖氨酸(K)取代精氨酸(R)，反之亦然；用苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)取代这些芳香族氨基酸中的任何另外一个；以及用甲硫氨酸(M)取代半胱氨酸(C)，反之亦然。其他的取代也可以被视为是保守性的，这取决于特定氨基酸环境和它在蛋白三维结构中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)经常可以互换，如同丙氨酸(A)和缬氨酸(V)可以互换。相对疏水的甲硫氨酸(M)可以经常与亮氨酸和异亮氨酸互换，以及有时与缬氨酸互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)经常在以下位置互换：其中氨基酸残基的重要特征是其电荷，以及这两种氨基酸残基的不同pK并不明显。

[0061] 在一些实施方案中，纤维素结合域多肽或变体序列选自SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:14，以及SEQ ID NO:19。

[0062] 在一些实施方案中，所述固体载体为含有纤维素的载体，优选含有植物纤维素的固体载体，例如选自棉纤维素、竹纤维素、麻纤维素、半纤维素和木质素或其任意组合。在一些实施方案中，所述固体载体选自棉布、含有棉纤维素的材料、含有微晶纤维素的材料或其任意组合。在一些实施方案中，使用的棉布包括但不限于棉纱布、棉毛巾、棉帆布、棉麻布和/或棉绒布等。

[0063] 第二方面，本申请提供产生固定化脂肪酶的方法，包括

[0064] 提供固体载体，

[0065] 将含有CBD的脂肪酶融合蛋白与固体载体接触。

[0066] 在一些实施方案中，所述固体载体为含有纤维素的载体，优选含有植物纤维素的固体载体，例如选自棉纤维素、竹纤维素、麻纤维素、半纤维素和木质素或其任意组合。在一些实施方案中，所述固体载体选自棉布、含有棉纤维素的材料、含有微晶纤维素的材料或其任意组合。在一些实施方案中，使用的棉布包括但不限于棉纱布、棉毛巾、棉帆布、棉麻布和/或棉绒布。

[0067] 在一些实施方案中，所述方法中提供固体载体的步骤包括用含有表面活性剂试剂洗涤固体载体的处理步骤；任选地，还包含用酸处理所述固体载体的步骤。

[0068] 在一些实施方案中，含有表面活性剂试剂为含有高级脂肪酸(例如10～18碳)盐的试剂，例如包括但不限于洗涤剂、洗衣液、清洁剂、肥皂水、和/或洗洁精等。

[0069] 在一些实施方案中，所述方法还包含用酸处理所述固体载体的步骤。使用酸处理所述固体载体，可进一步去除固体载体上的蜡质、果胶，从而更有利于含有纤维素结合域(Cellulose binding domain，CBD)的脂肪酶融合蛋白与固体载体的结合。因此，在一些实施方案中，所述酸为能够实现上述效果但不明显破坏所述纤维素的酸，例如可以是弱酸、稀酸或有机酸，或者不能为诸如浓硫酸或浓盐酸的强酸。在一些具体的实施方案中，可用于所述方法的酸例如可包括但不限于磷酸、醋酸、稀盐酸、HF、碳酸、磺酸、氯仿以及甲酸等，在优选的实施方案中，所述酸为磷酸，在更优选的实施方案中，所述酸为10-95％(W/V)磷酸，优选，30-90％(W/V)磷酸，更优选50-90％(W/V)磷酸、或60-85％(W/V)磷酸。例如，60％、65％、70％、75％、80％或85％(W/V)磷酸。在一些实施方案中，所述酸为0.05-5mol/l盐酸，优选
0.05-3mol/l盐酸，更优选0.1-3mol/l盐酸，尤其优选0.5-1mol/l盐酸。例如，0.1mol/l盐酸、0.2mol/l盐酸、0.5mol/l盐酸、0.8mol/l盐酸、1mol/l盐酸、1.5mol/l盐酸、2mol/l盐酸、
2.5mol/l盐酸、3mol/l盐酸。

[0070] 在一些实施方案中，所述方法还包括，调节所述酸处理后的固体载体的pH的步骤，以去除或基本去除残留的酸或将固体载体调节至合适的pH。在一些具体的实施方案中，用于调节所述酸处理后的固体载体的pH的适合使用的溶液例如包括但不限于碱溶液、盐溶液、缓冲液、水等。在一些实施方案中，所述碱溶液和盐溶液包括但不限于碳酸钠、碳酸氢钠、乙酸钠、磷酸钠、氨水、氢氧化铝、氢氧化镁、氢氧化锌、氢氧化二铁、氢氧化三铁等溶液。在优选的实施方案中，所述碱和盐为碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠，例如，0.1％-30％(W/V)碳酸氢钠，优选0.5％-10％(W/V)碳酸氢钠,，更优选0.5％-5％(W/V)碳酸氢钠，例如，
0.5％、1％、2％(W/V)碳酸氢钠；0.1％-30％(W/V)碳酸钠，优选0.5％-10％(W/V)碳酸钠,，更优选0.5％-5％(W/V)碳酸钠，例如，0.5％、1％、2％(W/V)碳酸钠；0.1％-30％(W/V)氢氧化钠，优选0.5％-10％(W/V)氢氧化钠，更优选0.5％-5％(W/V)氢氧化钠，例如，0.5％、1％、
2％(W/V)氢氧化钠。

[0071] 在一些实施方案中，所述提供固体载体的步骤中的每一处理步骤之后，任选用清水或无离子水或缓冲液洗涤或冲洗固体载体。任选地，所述固体载体处理之后放入低级醇，例如包括但不限于乙醇、异丙醇中保存，优选10-95％乙醇溶液，例如10、20、30、40、50、60、70、80、和90％的乙醇溶液。在一些实施方案中，所述将含有CBD的脂肪酶融合蛋白与固体载体接触的步骤在缓冲液中进行。

[0072] 在一些实施方案中，所述本申请方法中使用的缓冲液例如但不限于：磷酸盐缓冲液(PBS)、Tris-HCl、柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液、硼酸缓冲液、精氨酸缓冲液等。

[0073] 在一些实施方案中，所述方法中的含有CBD脂肪酶融合蛋白为本申请第一方面及其实施方案中所述的脂肪酶融合蛋白。

[0074] 在一些实施方案中，含有CBD脂肪酶融合蛋白可以通过本领域人员已知的任何合适的方法制备，例如通过重组技术产生，或者化学合成。

[0075] 产生融合蛋白的重组方法是本领域已知的。例如通过使编码所述融合蛋白的核苷酸序列或核酸分子在合适的宿主细胞中进行基因表达。如果需要，能够使用终标签(eventual tag)来分离或纯化所述融合蛋白。

[0076] 在一些实施方案中，所述编码CBD的多核苷酸可以与编码酶的DNA序列可操作连接，得到上述的编码融合蛋白的核酸分子。

[0077] 可以利用本领域内已知的和可获得的多种成熟技术中的任何一种来制备、操控和/或表达多核苷酸或核酸分子。例如，编码本申请的融合蛋白的多核苷酸序列可以用于重组DNA分子中以指导融合蛋白在适当的宿主细胞中表达。由于遗传密码子固有的简并性，编码基本上相同或在功能上等同的氨基酸序列的其他DNA序列也可以用于本申请中，并且这些序列可以用于克隆和表达给定的蛋白。

[0078] 在某些实施方案中，本申请的多核苷酸或核酸分子通过人工合成产生，例如直接的化学合成或酶合成。在可选的实施方案中，上述多核苷酸或核酸分子通过重组技术产生。在某些具体的实施方案中，通过重叠PCR(overlap-PCR)的方法将编码上述CBD多肽的核苷酸序列与编码相关酶的核苷酸序列串联重复在一起。

[0079] 在某些实施方案中，可以通过常规方法优选如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS,1977,74:5463-5467)测定所获得的多核苷酸或核酸分子的序列。这类多核苷酸序列测定也可用购买的测序试剂盒来完成。为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。

[0080] 在一些实施方案中，本申请提供了表达载体，其包含编码本文所述融合蛋白的核酸分子。

[0081] 本公开所述的“表达载体”是重组或合成产生的核酸构建体，其具有一系列允许特定的核酸在宿主细胞中转录的特异性核酸元件。本申请中的表达载体可以是诸如pET30a、pET-24a(+)、pIRES2-EGFP、pcDNA3.1、pCI-neo、pDC516、pVAC、pcDNA4.0、pGEM-T、pDC315的质粒载体，或者是诸如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(sFv)载体的病毒载体。

[0082] 在优选的实施方案中，用于克隆本文所述核酸分子的表达载体为质粒载体。在更优选的实施方案中，所述质粒载体为pET30a。

[0083] 在某些实施方案中，利用本领域的技术人员熟知的方法构建包含编码融合蛋白的重组核苷酸序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,a Laboratory Manual,cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。核苷酸序列可操作地连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性实例包括：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。

[0084] 在具体的实施方案中，通过T4连接酶(Fermentas)将重组核苷酸序列连接到载体中，例如将RML-CBDnew重组序列连接到载体PET30a中。

[0085] 此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。

[0086] 在一些实施方案中，本申请提供了表达载体的宿主细胞。

[0087] 在某些实施方案中，将编码融合蛋白的核酸分子或含有该核酸分子的表达载体转化或转导入宿主细胞，获得含有该核酸分子或表达载体的基因工程化宿主细胞。

[0088] 本文所用的宿主细胞可以是本领域技术人员熟知的任一种宿主细胞，包括原核细胞、真核细胞，例如细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞等。示例性的细菌细胞包括埃希氏菌属、杆菌属、链霉菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属和葡萄球菌属中的任何种，包括例如大肠杆菌、乳酸球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽胞杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、荧光假单胞菌。选择合适的宿主在本领域技术人员的能力范围内。

[0089] 可以利用本领域已知的任何技术将表达载体导入宿主细胞中，包括转化、转导、转染、病毒感染、基因枪或Ti-介导的基因转移。具体的方法包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔等(Davis,L.,Dibner,M.,Battey,I.,Basic Methods in Molecular Biology,(1986))。作为示例，当宿主为原核生物如大肠杆菌时，可在指数生长期后收获感受态细胞，用本领域熟知的CaCl2法进行转化。

[0090] 在具体的实施方案中，本发明所用的宿主细胞为大肠杆菌。在优选的实施方案中，将携带重组多核苷酸序列的表达载体转化至大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21进行诱导表达。

[0091] 在具体的实施方案中，提供了制备本申请的融合蛋白的方法，其包括：

[0092] 1)将编码融合蛋白的核酸分子克隆在表达载体上，

[0093] 2)将表达载体转化或转导至合适的宿主细胞中，

[0094] 3)在合适的培养基中，培养宿主细胞，

[0095] 4)从所述宿主细胞或培养基中分离并纯化所述融合蛋白。

[0096] 合适的宿主细胞是指适于表达载体或目的核酸表达的宿主细胞。合适的培养基指适于宿主细胞生长或对其进行诱导表达的培养基。

[0097] 在优选的实施方案中，融合蛋白中的CBD多肽部分和酶部分通过连接子连接。连接子又称接头序列(Linker)。接头序列设计为融合蛋白制备中的常用技术，即通过一段适当的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来，使其在适当的生物体内表达成为一条肽链，其中起连接作用的氨基酸称为连接子。本领域技术人员能够根据融合蛋白分子的大小和特性选择合适的连接子。

[0098] 在某些实施方案中，根据所用的宿主细胞，可以选择各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。优选地，工程化的宿主细胞可以在被修饰适于激活启动子的常规营养培养基中进行培养，以筛选转化子或扩增本发明的多核苷酸。转化合适的宿主细胞并当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间，以允许其生产目的多肽或蛋白。

[0099] 在某些实施方案中，通过离心收获宿主细胞，通过物理或化学方法破碎细胞，并且将得到的粗提物保留用于进一步纯化。用于蛋白表达的微生物细胞可以通过任何便利的方法进行破碎，包括冻融循环、超声、机械破碎或使用细胞裂解剂。这些方法是本领域技术人员熟知的。

[0100] 在某些实施方案中，宿主细胞生产的重组多肽可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。例如，表达的蛋白可以通过本领域熟知的以下方法从重组细胞培养物中回收并纯化：常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。在具体的实施方案中，通过Ni2+琼脂糖凝胶层析柱来纯化融合蛋白。

[0101] 在一具体的实施方案中，提供了制备RML-CBD或CBD-CALB融合蛋白的方法，其包括：将编码RML-CBD或CBD-CALB的重组多核苷酸分别克隆在表达载体pET30a(细菌用载体，RML-CBD)和pAOX1(酵母用载体，CBD-CALB)中，以及将带有该多核苷酸序列的pET30a、pAOX1分别转化至大肠杆菌BL21和毕赤酵母中进行诱导表达，然后从大肠杆菌BL21或毕赤酵母中分离并纯化RML-CBD或CBD-CALB融合蛋白。

[0102] 第三方面，提供本公开的固定化脂肪酶在生产柴油中应用。

[0103] 在一些实施方案中，利用本申请公开的固定化脂肪酶使棕榈油脂肪酸(PFAD)、大豆油脂肪酸、或油酸与甲醇或乙醇发生酯化反应，从而生产柴油。

[0104] 第四方面，提供水解脂质的方法，包括

[0105] 提供本公开的固定化脂肪酶，以及

[0106] 将所述固定化脂肪酶与脂质接触，从而使得脂质水解。

[0107] 在一些实施方案中，能够被所述固定化脂肪酶水解的脂质选自棕榈酸对硝基苯酯(pNPP)、三丁酸甘油酯、橄榄油等。

[0108] 第五方面，提供酯化方法，包括

[0109] 提供本公开的固定化脂肪酶，以及

[0110] 将所述固定化脂肪酶与脂肪酸和低级醇接触，从而使得所述脂肪酸酯化。

[0111] 在一些实施方案中，所述方法中的脂肪酸为C16-C22脂肪酸；任选地棕榈油脂肪酸、油酸、大豆油脂肪酸，所述低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇和异丁醇。

[0112] 此外，本申请公开的固定化酶可以用于乳制品工业、家具清洁产品、油脂化学(例如生产生物柴油)和医疗领域(例如治疗肥胖和动脉粥样硬化等)中。

[0113] 本文公开的词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。

[0114] 应该理解，在本文公开的特定方面、实施方案中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，并可以任意组合或省略，除非与之矛盾。

[0115] 本申请公开的固定化酶、制备方法及其应用具备以下一种或多种优点：

[0116] i.与市面上硅胶，大孔树脂等固定化脂肪酶(如诺维信固定化酶Novozym435)以及文献中氧化硅颗粒，磁颗粒等固定化脂肪酶相比，本申请的固定化酶所采用固定载体成本低。

[0117] ii.本申请的固定化酶中的酶和载体之间的牢固度更高。

[0118] iii.本申请的固定化酶为高纯度酶产品。

[0119] iv.本申请的固定化酶的负载量高。

[0120] v.本申请的固定化酶可以不含聚乙烯亚胺，戊二醛，聚丙烯酸酯，聚氨酯，有机硅等化学试剂或粘合剂。

[0121] vi.本申请的酶直接和纤维素链的结合，不牵涉对酶的交联，粘合，混浆处理，避免了对酶的损伤。

[0122] vii.本申请的酶在固定化的同时，完成了对酶的纯化。

[0123] 上述公开内容总体上描述了本申请的实施方案，通过下面的实施例进一步示例本申请的实施方案。描述这些实施例仅为说明的目的，而不是限制本申请的实施方案的范围。

[0124] 实施例

[0125] 实施例中使用的米黑根毛霉(Rhizomucor miehei，RML)脂肪酶RML脂肪酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；未连接连接子的CBD核酸序列如SEQ ID NO:2所示(GenBank No.AAA23089)，经过优化含连接子的CBD(本文称CBDnew)的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；所用扩增引物序列为：RML-F-BamHI(SEQ ID NO:5)；RML-R(SEQ ID NO:6)；CBD-F(SEQ ID NO:7)；CBD-R-SalI(SEQ ID NO:8)。上述CBDnew序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

[0126] 使用的南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)脂肪酶的核酸和氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；相应的扩增引物序列为：CALB-F-HindIII(SEQ ID NO:10)；CALB-R(SEQ ID NO:11)；CBD-F(SEQ ID NO:12)；CBD-R-EcoRI(SEQ ID NO:13)。

[0127] 来源于里氏木霉外切纤维素酶的CBD(本文称为CBD1)的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO:14和15所示。制备CBD1-RML所用扩增引物序列为：RML-F-BamHI(SEQ ID NO:5)；RML-1-R(SEQ ID NO:16)；CBD-1-F(SEQ ID NO:17)；CBD-1-R-SalI(SEQ ID NO:18)。

[0128] 来源于哈茨木霉内切葡聚糖酶II(THEGII)的CBD(本文称为CBD3)的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO:19和20所示。制备CBD 3-RML所用扩增引物序列为：CBD-3-F-BamHI(SEQ ID NO:21)；CBD-3-R(SEQ ID NO:22)；RML-3-F(SEQ ID NO:23)；RML-3-R-SalI(SEQ ID NO:24)。

[0129] 实施例1A含固定化分子标签的脂肪酶(CBD-RML)表达

[0130] 用primestar高保真聚合酶(Takara公司)对RML(由上海生工合成)和CBDnew核酸序列(含有连接子(linker)的CBD序列)分别进行PCR扩增，以RML和CBDnew的PCR产物为模板，通过重叠PCR(overlap-PCR)(曹阳等，重叠延伸PCR方法的建立与应用。河北医药2005年11月第27卷11期)的方法将RML和CBDnew序列串联重复在一起，RML和CBDnew序列之间有CBD中天然new存在的连接子(linker)序列连接。然后用T4连接酶(Fermentas)将RML-CBD 重组序列连接到载体PET30a(购自上海生工)中。

[0131] 将连接后的载体用热激法(42℃,90秒)转入大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自上海生工)，并将其在含50μg/mL的抗生素氨苄青霉素的固体LB培养基平板(1.5％琼脂糖，酵母粉5％、蛋白胨10％、NaCl 5％)中于37℃培养过夜，随后转入5mL LB培养基(酵母粉5％、蛋白胨10％、NaCl 5％)中于37℃，200rpm振荡培养。用Qigen质粒提取试剂盒提取质粒，送上海生工测序。测序结果正确的质粒即为所需要的表达载体。

[0132] 选取序列正确的表达载体转化至大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21。在LB培养基中扩大培养至OD600值为0.6～0.8时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂(1mM)进行诱导，继续16℃，150rpm过夜培养，收集菌体。

[0133] 将收集的菌体用Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液悬浮，超声波破碎；或者采用裂解液重新悬浮菌体，冰浴破碎20min。然后将破碎液在10000转/分钟(rpm)的转速下，离心15min。离心后获得的上清液即为粗酶液。

[0134] 利用聚丙烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测样品，结果如图1A所示，我们可以看到，加入诱导剂之后，目的蛋白得以大量表达，且很大一部分在上清液当中。

[0135] 实施例1B含固定化分子标签的脂肪酶(CBD-CALB)表达

[0136] 用primerstar高保真聚合酶(Takara公司)对CALB和CBDnew序列分别进行PCR扩增，以CALB和CBD的PCR产物为模板，通过overlap-PCR的方法将CALB和CBD序列串联重复在一起，CALB和CBD序列之间有CBD中天然存在的Linker连接。然后用T4连接酶(Fermentas)将CALB-CBD重组序列连接到载体pAOX1中。提取质粒，测序。将测序正确的载体用SalI单酶切线性化后，按照毕赤酵母的标准转化方法，电击转化毕赤酵母感受态细胞，涂布到选择培养基MDS筛选平板，于28℃培养过夜。

[0137] 挑取酵母单菌落接种于5mL YPD培养基中，28℃，200rpm过夜培养。接种至50mL的BMGY培养基中，28℃，220rpm培养，收集菌体。用无菌水重悬洗涤菌体2次，然后用BMMY培养基重悬菌体。向BMMY培养基中添加2％的甲醇，28℃，220rpm诱导表达。每隔24h取样测定酶活，并向50mL培养基中补加0.5mL甲醇。诱导3d后，发酵液浓缩收集。结果如图1B所示。

[0138] 实施例2A微晶纤维素脂肪酶固定化

[0139] 取微晶纤维素(Avicel，11365-1KG，Sigma)100mg至离心管中，加入200μL Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液浸泡10min，离心弃上清。

[0140] 加入500μL CBD-RML菌体裂解上清液或粗酶液，4℃摇荡孵育30min，离心弃上清。

[0141] 用含0.8M NaCl的Tris-HCl缓冲液洗涤。

[0142] SDS-PAGE检测各流出或洗涤样品，固定化的酶用150μL含10M尿素的Tris-HCl缓冲液变性并检测。

[0143] 用不含CBD序列的RML做对照，重复上述步骤，结果如图2A-2B所示。

[0144] 从图2A-2B所示结果可以看到，未引入CBD标签的RML脂肪酶不能被固定化，而引入CBD标签的CBD-RML脂肪酶可被微晶纤维素纯化和固定化。

[0145] 实施例2B微晶纤维素脂肪酶固定化

[0146] 从发酵液中一步纯化和固定化脂肪酶效果，以纯纤维素成分的Sigma产品微晶纤维素Avicel(11365-1KG)作为阳性对照，取其粉末70mg至离心管中，加入200μL Tris-Cl(pH 6.0)缓冲液浸泡10min，离心弃上清。

[0147] 加入1mL CBD-CALB发酵液或粗酶液，4℃摇荡孵育30min，离心弃上清。

[0148] 用Tris-Cl缓冲液洗涤。

[0149] SDS-PAGE检测各流出或洗涤样品，固定化的酶用250μL含10M尿素的Tris-Cl缓冲液变性并检测，结果如图2C所示。

[0150] 从图2C所示结果可以看到，引入CBD标签的CBD-CALB脂肪酶可被微晶纤维素纯化和固定化。

[0151] 实施例3A棉布脂肪酶固定化

[0152] 棉布处理：

[0153] 将市场上购买到的纯棉帆布，剪成约1cm2的小块，称其质量为41.6±5.5mg。用10％市售洗衣液煮沸1h，清水洗涤，接着用85％(W/V)磷酸4℃处理1h，后用水涮洗，然后用
1％(W/V)NaHCO3中和，并用清水洗至pH5-7，最后置于20％乙醇溶液中4℃保存。

[0154] 取棉布小块2个至离心管中，加入200μL Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液浸泡10min，弃上清。

[0155] 加入500μl粗酶液，菌体裂解上清液，4℃摇荡孵育30min，弃上清。

[0156] 用含0.8M NaCl的Tris-HCl缓冲液洗涤。

[0157] SDS-PAGE检测各流出或洗涤样品，固定化的酶用250μL含10M尿素的Tris-HCl缓冲液变性并检测。

[0158] 用不含CBD序列的RML做对照，重复上述步骤，同时用未经任何处理的棉布重复CBD-RML固定化步骤，作为阴性对照，结果如图3A-3C所示。

[0159] 可以看到，未引入CBD标签的RML脂肪酶仍然不能被棉布固定化，但未经处理的棉布也不能固定化含CBD标签的CBD-RML脂肪酶。

[0160] 同时可以看到：高离子浓度洗涤液仍然不能将CBD-RML脂肪酶洗脱，说明其结合牢固度非常高；从载体上变性下来的酶样品的电泳条带证明，其纯度也非常之高。

[0161] 实施例3B棉布脂肪酶固定化

[0162] 棉布处理：

[0163] 将市场上购买到的纯棉帆布，剪成约1cm2的小块，。用10％肥皂水煮沸1h，清水洗涤，接着用70％(W/V)磷酸4℃处理1h，后用水涮洗，然后用1％(W/V)KHCO3中和，并用清水洗至pH5-7，最后置于20％异丙醇溶液中4℃保存。

[0164] 取上述处理布块105℃加热4h至恒重，降至室温称其重量，每棉布块重量约为35mg。

[0165] 取棉布2块至离心管中，加入200μL Tris-Cl(pH 6.0)缓冲液浸泡10min，弃上清。

[0166] 加入1mL CBD-CALB脂肪酶发酵液，4℃摇荡孵育30min，弃上清。

[0167] 用Tris-Cl缓冲液洗涤。

[0168] SDS-PAGE检测各流出或洗涤样品，固定化的酶用250μL含10M尿素的Tris-Cl缓冲液变性并检测，结果如图3D所示。

[0169] 经上述处理后的棉布均可以达到Avicel类似的纯化和固定化效果。

[0170] 实施例4A微晶纤维素和棉布固定化脂肪酶负载量

[0171] 以1mg/mL浓度的牛血清白蛋白(BSA)为标准样品，分别稀释至500、200、100和50μg/mL，与微晶纤维素和棉布的尿素变性液共同制样并电泳检测，结果如图4A所示。

[0172] AlphaImager HP软件分析条带，以条带面积与密度的乘积为横坐标，以浓度为横纵标，得到标准曲线方程y＝8×10-5*x-732.62(R2＝0.9856)，并计算所得微晶纤维素和棉布的CBD-RML脂肪酶负载量分别为：2.28mg/g基材，3.97mg/g基材。以上脂肪酶因连接了CBD，其负载量应视为纯酶的负载量。

[0173] 因此，对比目前市场上大孔树脂约为1mg/g的粗酶负载量(因为它不具有固定化专一性)，本公开的微晶纤维素和棉布固定化产品的酶负载量显得更为可观。

[0174] 实施例4B微晶纤维素和棉布固定化脂肪酶负载量

[0175] 以1mg/mL浓度的牛血清白蛋白(BSA)为标准样品，分别稀释至500、200、100和50μg/mL，与微晶纤维素和棉布的尿素变性液共同制样并电泳检测，结果如图4B所示。

[0176] AlphaImager HP软件分析条带，以条带面积与密度的乘积为横坐标，以浓度为横纵标，得到标准曲线方程y＝8×10-5*x-732.62(R2＝0.9856)，并计算所得微晶纤维素和棉布的CBD-CALB脂肪酶负载量均约为1mg/g基材。以上脂肪酶因连接了CBD，其负载量应视为纯酶的负载量。

[0177] 因此，对比目前市场上大孔树脂约为1mg/g的粗酶负载量(因为它不具有固定化专一性)，本公开的微晶纤维素和棉布固定化产品的酶负载量显得更为可观。

[0178] 实施例5A微晶纤维素和棉布固定化脂肪酶酯水解活力

[0179] 根据上述实施例中所得的计算值，将各固定化酶和游离酶摩尔浓度用Tris-Cl缓冲液调节至5μg/ml，采用pNPP法检测其酯水解活力，样品水解底物为棕榈酸对硝基苯酯(pNPP)，反应条件为温度40℃，pH值8.0。

[0180] 硝基苯棕榈酸酯(pNPP)法测定脂肪酶活力的具体方法如下。

[0181] 以对硝基苯棕榈酸酯(pNPP)为底物，以单位体积的酶液在单位时间内酶解产生对硝基苯酚(pNP)的生成量进行酶活力的计算。具体方法如下：预先配置底物和缓冲液，底物：6mg/mL pNPP(异丙醇溶解)，缓冲液：0.05M Tris(pH8.0，0.1％阿拉伯胶)。将底物和缓冲液以1:9(v/v)配成反应混合液。取两个2mL离心管，分别为对照管和样品管。分别添加400μL反应混合液至两离心管，在合适的反应温度(例如35℃)预温浴5min。向样品管中加入20μL的稀释酶液，混合均匀后，继续温浴15min。加入1.5mL乙醇至上述两离心管终止反应，并添加同样量的稀释酶液至对照管。以12000rpm离心2min，取上清，测405nm处的吸光值。

[0182] 酶活力单位定义为：1个单位即指在标准实验条件下每分钟催化释放1μmol的pNP所需的酶量。根据标准曲线所得酶活力计算公式为：

[0183] A＝-([A1-A0]×0.7885-0.0118)×V1×n/(V2×t)。

[0184] 其中，A：样品酶活(U/mL)，A1：样品酶液的OD405，A0：对照酶液的OD405，V1：总反应液的体积(mL)，n：酶液的稀释倍数，V2：酶液的体积(mL)，t：反应时间(min)。

[0185] 最终计算得到的微晶纤维素和棉布固定化脂肪酶的酯水解活力(用所得酶活力单位除以固定化基材的质量)如图5所示，分别为352.61±18.26U/g微晶纤维素(Avicel)和589.23±13.35U/g棉布(Cotton)，两者的差距可能来源于负载量的不同。

[0186] 如实施例4A中所示，每克微晶纤维素和棉布所负载的酶量分别为2.28mg和3.97mg，换算成同样量的RML所表现出的活力为75.31U和131.13U(经与固定化酶同步测试所得的RML水解比酶活为33.03±3.27U/mg)。

[0187] 通过上述分析可以得出，与原来的脂肪酶RML相比，通过引入CBD标签并固定化到微晶纤维素和棉布上的方式，并不会使酶活降低，甚至表现活性增高。

[0188] 实施例5B微晶纤维素和棉布固定化脂肪酶酯化能力检测

[0189] 步骤如下：

[0190] 棕榈油脂肪酸(PFAD)加热融化，取400μL至1.5mL离心管中，50℃，14000rpm降温。

[0191] 根据上述实施例计算所得负载量，加入含酶量为100μg的CBD-CALB微晶纤维素或棉布固定化脂肪酶样品，甲醇50μL，每隔1h加一次甲醇，共反应4h。

[0192] 然后在12000rpm下离心2min，取200μL上清至三角瓶中(归零，称重，一般0.15～0.17g)。用5mL乙醇溶解，加入一两滴酚酞做指示剂。

[0193] 滴定测定酸价(或称中和值、酸值、酸度，表示中和1克化学物质所需的氢氧化钾(KOH)的毫克数)。酸价＝V*C*M/反应物质量，比如初始酸价10*0.05*56/0.15＝186。

[0194] 转化率(酯化率)＝(原始酸价-初始酸价)/原始酸价。

[0195] 结果如图5B所示，横坐标为相对于PFAD体积的含水量，纵坐标为转化率，可以看到，在30％含水量处，棉布(Cotton)固定化产品可表达出最高酯化性能(近90％)，而含同样酶量的微晶纤维素(Avicel)样品要表现出最高的酯化性能所需的含水量为80％，且酯化率不到70％。这可能跟Cotton固定化酶样品不需要过多的水量就能与底物充分接触，而粉末状的Avicel样品需要更多的水量来保持分散状态有关，因为更多的水含量不利于酯化的进行(水是酯化的产物之一)。图5C展示了棉布最高酯化能力时的反应状态，酯化产物棕榈油脂肪酸甲酯(PFAM)的融点较低，所以终产物表现为油状，如左图所示。

[0196] 实施例6其他CBD序列棉布固定化效果

[0197] 按照实施例1A的方法分别制备CBD1-RML和CBD3-RML融合脂肪酶。按照实施例3A所述的方法处理棉布，并检测融合酶的固定化效果。结果如图6A和图6B所示。与CBDnew-RML的结果类似，高离子浓度洗涤液不能将CBD1-RML和CBD3-RML脂肪酶从棉布上洗脱下来，说明其结合牢固度非常高；从载体上变性下来的酶样品的电泳条带证明，其纯度也非常高。