本发明人腺病毒抗原表位嵌合蛋白及其制备、应用涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。通过计算机分析腺病毒3型、7型、11型、14型及55型六邻体蛋白的氨基酸序列，分别筛选出含强抗原性的蛋白片段，片段之间用两个甘氨酸和一个丝氨酸进行连接，形成一个多抗原片段串联的嵌合蛋白，选择原核偏爱的密码子，将其翻译成相应的核酸序列，化学合成全长基因。基因工程技术表达纯化得到该嵌合蛋白，嵌合蛋白全长363个氨基酸。表达的嵌合蛋白可用于疫苗研究、HAdV抗体或抗原的检测等，本发明涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。
人腺病毒抗原表位嵌合蛋白及其制备、应用
技术领域
[0001] 本发明人腺病毒抗原表位嵌合蛋白及其制备、应用涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。本发明是将人腺病毒（HAdV） 3型、7型 、11型、14型及55型特异性抗原表位蛋白片段串联，利用基因工程技术，制备含有五种型别腺病毒强抗原表位的嵌合蛋白。通过计算机分析，从五种型别腺病毒六邻体蛋白中筛选出含有强抗原表位的蛋白片段，蛋白片段之间用两个甘氨酸和一个丝氨酸连接，串联成一个多抗原表位嵌合蛋白。化学合成该嵌合蛋白的基因序列，并利用基因工程技术表达该嵌合蛋白。表达的嵌合蛋白可用于HAdV抗体或抗原的检测，及疫苗的研制等。
背景技术
[0002] 人腺病毒，即HAdV（Human Adenovirus），是一种在幼儿园、军队等高密度人群具有高危害性的病毒。自2011年12月以来，我国不同地区先后发生多起经呼吸道传播的暴发传染病疫情，疫情波及面广，传染性强，经实验室病原检测鉴定分别为B组55型、7型和14型腺病毒。
[0003] 腺病毒主要引起呼吸道疾病，但也可感染消化道、泌尿道、眼部、心肌等部位而引起疾病。通常认为B1、C、E组腺病毒主要引起呼吸道疾病，而B2组主要引起泌尿系统感染。全球多次报道由腺病毒引发的呼吸道疾病在新兵中暴发流行。
[0004] 腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，属腺病毒科，基因组全长34.7kb，衣壳呈规则的20面体结构，直径80-100nm。核心由双股DNA及蛋白质组成，外有核壳，上有252个颗粒，由240个六邻体和12个五联体组成。六邻体上的表位是区别不同血清型的标准，是病毒对免疫选择压力最敏感的部位。
[0005] 目前，实验室检测腺病毒感染的方法一般有两种。一是通过聚合酶链式反应特异性检测腺病毒核酸，该法较复杂，不易操作，且腺病毒分型较困难。二是利用酶联免疫吸附实验检测血清中的特异性IgM及IgG抗体。一般情况下，病毒感染时，人体免疫系统能够激发体液免疫和细胞免疫反应并逐渐控制感染、清除病毒。感染早期出现病毒血症时，从患者血清和鼻、咽分泌物中可以检测到病毒核酸。腺病毒感染后可诱发较强的免疫反应，产生特异性抗体。一般发病后1周，患者体内的IgM开始产生，7-10天IgG开始产生，随后逐渐升高。因此可利用特异性抗原检测血清中的特异性抗体。但目前一种抗原通常只能检测一种型别的腺病毒抗体，所以在检测血清内HAdV抗体时需要使用多种抗原来提高抗体检测率，确诊感染类型，提高了检测成本，并且仍存在一定的假阴性概率。研制多抗原表位基因重组抗原是建立腺病毒特异抗体快速检测试剂的发展方向，也是研制疫苗的发展方向。
发明内容
[0006] 本发明目的是针对上述不足之处提供一种人腺病毒抗原表位嵌合蛋白，人腺病毒（HAdV）外壳的六邻体蛋白上具有多种表位，是病毒体对免疫选择压力最敏感的部位，诱导机体产生多种特异性抗体，所以该蛋白是用作抗原研制人腺病毒（HAdV）抗体检测试剂的理想蛋白。
[0007] 通过计算机分析腺病毒六邻体蛋白的氨基酸序列，分别筛选出五种型别腺病毒含有强抗原表位的蛋白片段，蛋白片段之间用两个甘氨酸和一个丝氨酸连接，串联成一个多抗原表位嵌合蛋白。化学合成该嵌合蛋白的基因序列，并利用基因工程技术表达该嵌合蛋白。表达的嵌合蛋白可用于HAdV抗体或抗原的检测，及疫苗的研制等。
[0008] 本发明是化学合成人腺病毒（HAdV）由腺病毒3型、7型、11型、14型及55型的抗原表位嵌合蛋白的基因序列，利用基因工程技术，制备含有五种类型腺病毒抗原表位的嵌合蛋白。通过计算机分析人腺病毒3、7、11、14和55型六邻体蛋白的氨基酸序列，分别筛选出含强抗原表位的蛋白片段。腺病毒3型共筛选出四个蛋白片段，分别是第136～151位氨基酸，共16个氨基酸；第164～187位氨基酸，共24个氨基酸；第265～284位氨基酸，共20个氨基酸；第
422～437位氨基酸，共16个氨基酸。腺病毒7型共筛选出四个蛋白片段，分别是第136～148位氨基酸，共13个氨基酸；第161～181位氨基酸，共21个氨基酸；第258～276位氨基酸，共19个氨基酸；第415～426位氨基酸，共12个氨基酸。腺病毒11型共两个蛋白片段，分别是第136～160位氨基酸，共25个氨基酸；第174～186位氨基酸，共13个氨基酸。腺病毒14型共四个蛋白片段，分别是第136～160位氨基酸，共25个氨基酸；第174～196位氨基酸，共23个氨基酸；
第268～286位氨基酸，共19个氨基酸；第415～450位氨基酸，共36个氨基酸。腺病毒55型共两个蛋白片段，分别是第136～158位氨基酸，共23个氨基酸；第172～184位氨基酸，共13个氨基酸。蛋白片段之间用两个甘氨酸和一个丝氨酸连接，串联成一个多抗原表位嵌合蛋白，全长363个氨基酸。选用原核生物偏爱的密码子，将嵌合蛋白翻译成相应的核苷酸序列，化学合成全长基因序列。利用基因工程技术表达纯化该嵌合蛋白。该嵌合蛋白可用于疫苗及HAdV抗体或抗原的检测，及用于免疫制备抗HAdV单抗和多抗等。
[0009] 人腺病毒（HAdV）嵌合蛋白及其制备、应用是采取以下步骤实施的：
[0010] 1.五种类型腺病毒抗原表位的筛选及嵌合蛋白基因片段的化学合成：
[0011] 利用ANTHEWIN等软件分析人腺病毒3型、7型、11型、14型和55型六邻体蛋白的氨基酸序列，分别筛选出各型别腺病毒六邻体蛋白中具有强抗原性的蛋白片段。蛋白片段之间用两个甘氨酸和一个丝氨酸连接，串联成一个多抗原表位嵌合蛋白。选用原核生物偏爱的密码子，将嵌合蛋白翻译成相应的核苷酸序列。在嵌合蛋白基因片段的5'端增加了NdeI酶切位点（下画线部分），在3'端增加了终止密码子（TAA）和EcoRI酶切位点（下画线部分）。使合成的基因片段易于克隆至质粒pET-28a(+)内的NdeI和EcoRI酶切位点内。化学合成该嵌合蛋白的全长基因序列。
[0012] 筛选的腺病毒3型抗原表位氨基酸序列：
[0013] 第136～151位aa：
[0014]
[0015] 第164～187位aa：
[0016]
[0017] 第265～284位aa：
[0018]
[0019] 第422～437位aa：
[0020]
[0021] 筛选的腺病毒7型抗原表位氨基酸序列：
[0022] 第136～148位aa：
[0023]
[0024] 第161～181位aa：
[0025]
[0026] 第258～276位aa：
[0027]
[0028] 第415～426位aa：
[0029]
[0030] 筛选的腺病毒11型抗原表位氨基酸序列：
[0031] 第136～160位aa：
[0032]
[0033] 第174～186位aa：
[0034]
[0035] 筛选的腺病毒14型抗原表位氨基酸序列：
[0036] 第136～160位aa：
[0037]
[0038] 第174～196位aa：
[0039]
[0040] 第268～286位aa：
[0041]
[0042] 第415～450位aa：
[0043]
[0044] 筛选的腺病毒55型抗原表位氨基酸序列：
[0045] 第136～158位aa：
[0046]
[0047] 第172～184位aa：
[0048]
[0049] 腺病毒3型抗原表位氨基酸序列：
[0050] Ile Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn Thr Gly Gly Ser
[0051] Lys Glu Gly Leu Gln Ile Gly Lys Asp Ile Thr Thr Thr Glu Gly Glu Glu Lys Pro
[0052] Ile Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu Ala
[0053] Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser Ile Lys Val Lys Thr Asp Asp
[0054] Thr Asn Gly Trp Glu Lys Asp Ala Asn
[0055] 腺病毒7型抗原表位氨基酸序列：
[0056] Ile Val Thr Thr Gly Glu Asp Asn Ala Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly
[0057] Leu Glu Ile Gly Lys Asp Ile Thr Ala Asp Asn Lys Pro Ile Tyr Ala Asp Lys Gly
[0058] Gly Ser Asp Gly Arg Glu Ala Ala Asp Ala Phe Ser Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr
[0059] Glu Asn Gly Gly Ser Ile Lys Pro Arg Asp Thr Ala Trp Glu Lys Asp Thr[0060] 腺病毒11型抗原表位氨基酸序列：
[0061] Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Thr Thr Gly Glu Glu His Val Thr Glu Glu Glu Thr
[0062] Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro Val Gly Leu Glu Val
[0063] Ser Asp Glu
[0064] 腺病毒14型抗原表位氨基酸序列：
[0065] Leu Asp Lys Gly Val Glu Thr Thr Glu Glu Arg Gln Asn Glu Asp Gly Glu Asn Asp
[0066] Glu Lys Ala Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Asp Gly Leu Pro Ile Gly Leu Glu Val
[0067] Pro Ala Glu Gly Asp Pro Lys Pro Ile Tyr Ala Asn Lys Gly Gly Ser Asp Leu Arg
[0068] Ser Gln Lys Gln Gly Leu Lys Pro Lys Ile Val Met Tyr Ala Glu Asn Gly Gly Ser
[0069] Ile Gly Pro Arg Thr Asp Ser Tyr Lys Glu Ile Gln Leu Asn Gly Asp Gln Ala Trp
[0070] Lys Asp Val Asn Pro Asn Gly Ile Ser Glu Leu Val Lys Gly Asn Pro Phe[0071] 腺病毒55型抗原表位氨基酸序列：
[0072] Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Gly Glu Glu Arg Val Thr Glu Glu Glu Asn Asn Thr
[0073] Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro Ile Gly Leu Lys Val Ser Asp
[0074] Glu
[0075] 嵌合蛋白氨基酸序列：
[0076] Ile Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn Thr Gly Gly Ser
[0077] Lys Glu Gly Leu Gln Ile Gly Lys Asp Ile Thr Thr Thr Glu Gly Glu Glu Lys Pro
[0078] Ile Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu Ala
[0079] Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser Ile Lys Val Lys Thr Asp Asp
[0080] Thr Asn Gly Trp Glu Lys Asp Ala Asn Gly Gly Ser Ile Val Thr Thr Gly Glu Asp
[0081] Asn Ala Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Glu Ile Gly Lys Asp Ile
[0082] Thr Ala Asp Asn Lys Pro Ile Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Glu Ala
[0083] Ala Asp Ala Phe Ser Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser Ile Lys
[0084] Pro Arg Asp Thr Ala Trp Glu Lys Asp Thr Gly Gly Ser Ile Ala Glu Gly Val Lys
[0085] Asn Thr Thr Gly Glu Glu His Val Thr Glu Glu Glu Thr Asn Thr Thr Thr Tyr Thr
[0086] Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro Val Gly Leu Glu Val Ser Asp Glu Gly Gly Ser
[0087] Leu Asp Lys Gly Val Glu Thr Thr Glu Glu Arg Gln Asn Glu Asp Gly Glu Asn Asp
[0088] Glu Lys Ala Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Asp Gly Leu Pro Ile Gly Leu Glu Val
[0089] Pro Ala Glu Gly Asp Pro Lys Pro Ile Tyr Ala Asn Lys Gly Gly Ser Asp Leu Arg
[0090] Ser Gln Lys Gln Gly Leu Lys Pro Lys Ile Val Met Tyr Ala Glu Asn Gly Gly Ser
[0091] Ile Gly Pro Arg Thr Asp Ser Tyr Lys Glu Ile Gln Leu Asn Gly Asp Gln Ala Trp
[0092] Lys Asp Val Asn Pro Asn Gly Ile Ser Glu Leu Val Lys Gly Asn Pro Phe Gly Gly
[0093] Ser Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Gly Glu Glu Arg Val Thr Glu Glu Glu Asn Asn
[0094] Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro Ile Gly Leu Lys Val Ser
[0095] Asp Glu
[0096] 化学合成的嵌合蛋白的DNA序列（1104bp）
[0097]
[0098] 2．表达HAdV抗原表位嵌合蛋白重组质粒的构建:
[0099] 提取质粒pET-28a（＋）（美国Novagen公司产品）,用 NdeI和EcoRI双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段, 溶于去离子水内。用NdeI和EcoR I双酶切化学合成的HAdV抗原表位嵌合蛋白基因片段，电泳回收后, 溶于去离子水内。取上述酶切后DNA片段，插入到载体pET-28a（＋）内的NdeI和EcoR I位点之间，表达含有五种类型腺病毒抗原表位的嵌合蛋白。
[0100] 3．重组质粒的筛选与鉴定:
[0101] 将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含卡那霉素(60μg／mL)LB平板，置37℃过夜。次日随机挑取转化菌落和对照菌(质粒pET-28a转化菌)，提取质粒，用NdeI和EcoRI双酶切验证，1.0%的琼脂糖凝胶电泳结果表明，切下1104bp的目的基因片段。同时，将含有该基因片段的质粒进行DNA序列分析，序列分析证实重组质粒含有连接在一起的五种类型腺病毒抗原表位基因片段，序列完全正确：
[0102] ATT GTT ACG ACG AAC GGT GAT AAT GCT GTT ACG ACG ACG ACG AAT ACG GGC GGC TCC AAA GAA GGT CTG CAA ATC GGC AAA GAC ATC ACC ACG ACC GAA GGC GAA GAA AAA CCG ATC TAC GCA GAT AAA GGC GGT AGT GAT GGT CGC GAT GCA GTT GCT GGT GCC CTG GCA CCG GAA ATT GTC CTG TAT ACC GAA AAC GGC GGT AGC ATC AAA GTT AAA ACC GAT GAC ACG AAC GGC TGG GAA AAA GAT GCG AAT GGC GGT AGC ATC GTC ACG ACC GGT GAA GAC AAC GCC ACG ACC TAT ACC GGC GGT TCT AAA GAA GGC CTG GAA ATT GGT AAA GAT ATC ACC GCA GAC AAT AAA CCG ATT TAC GCT GAT AAA GGC GGT AGC GAC GGT CGT GAA GCG GCC GAT GCG TTT TCT CCG GAA ATT GTG CTG TAT ACC GAA AAT GGC GGT TCA ATC AAA CCG CGC GAT ACC GCA TGG GAA AAA GAC ACG GGC GGT TCG ATT GCT GAA GGC GTG AAA AAC ACG ACC GGT GAA GAA CAT GTT ACC GAA GAA GAA ACG AAT ACG ACC ACG TAC ACC GGC GGT TCT AAA GAA GGC TTA CCG GTG GGT CTG GAA GTT AGT GAT GAA GGC GGT TCC CTG GAC AAA GGC GTT GAA ACC ACG GAA GAA CGT CAG AAC GAA GAT GGT GAA AAT GAC GAA AAA GCC ACC TAT ACG GGC GGT AGC AAA GAT GGT CTG CCG ATT GGC CTG GAA GTG CCG GCC GAA GGC GAT CCG AAA CCG ATT TAT GCC AAC AAA GGC GGT AGC GAT CTG CGT TCT CAG AAA CAA GGT CTG AAA CCG AAA ATT GTT ATG TAT GCA GAA AAC GGC GGT TCA ATC GGC CCG CGC ACC GAT TCG TAC AAA GAA ATT CAG CTG AAT GGT GAT CAA GCT TGG AAA GAC GTC AAC CCG AAT GGC ATC AGT GAA CTG GTG AAA GGT AAC CCG TTC GGC GGT TCC ATT GCC GAA GGC GTC AAA AAT GGT GAA GAA CGC GTG ACC GAA GAA GAA AAC AAT ACG ACG ACG TAC ACG GGC GGT AGC AAA GAA GGT CTG CCG ATT GGT CTG AAA GTC TCC GAT GAA TAA
[0103] 构建的重组质粒表达含有五种类型腺病毒抗原表位的嵌合蛋白，全长363个氨基酸，在其N端为腺病毒3型抗原表位蛋白片段，依次串联7型、11型、14型抗原表位蛋白片段，C端为腺病毒55型抗原表位蛋白片段，各片段长度依次为3型长85个氨基酸，7型长74个氨基酸，11型长41个氨基酸，14型长112个氨基酸，55型长39个氨基酸，片段之间由两个甘氨酸和一个丝氨酸连接,其氨基酸序列如下：
[0104] Ile Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn Thr Gly Gly Ser
[0105] Lys Glu Gly Leu Gln Ile Gly Lys Asp Ile Thr Thr Thr Glu Gly Glu Glu Lys Pro
[0106] Ile Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu Ala
[0107] Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser Ile Lys Val Lys Thr Asp Asp
[0108] Thr Asn Gly Trp Glu Lys Asp Ala Asn Gly Gly Ser Ile Val Thr Thr Gly Glu Asp
[0109] Asn Ala Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Glu Ile Gly Lys Asp Ile
[0110] Thr Ala Asp Asn Lys Pro Ile Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Glu Ala
[0111] Ala Asp Ala Phe Ser Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser Ile Lys
[0112] Pro Arg Asp Thr Ala Trp Glu Lys Asp Thr Gly Gly Ser Ile Ala Glu Gly Val Lys
[0113] Asn Thr Thr Gly Glu Glu His Val Thr Glu Glu Glu Thr Asn Thr Thr Thr Tyr Thr
[0114] Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro Val Gly Leu Glu Val Ser Asp Glu Gly Gly Ser
[0115] Leu Asp Lys Gly Val Glu Thr Thr Glu Glu Arg Gln Asn Glu Asp Gly Glu Asn Asp
[0116] Glu Lys Ala Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Asp Gly Leu Pro Ile Gly Leu Glu Val
[0117] Pro Ala Glu Gly Asp Pro Lys Pro Ile Tyr Ala Asn Lys Gly Gly Ser Asp Leu Arg
[0118] Ser Gln Lys Gln Gly Leu Lys Pro Lys Ile Val Met Tyr Ala Glu Asn Gly Gly Ser
[0119] Ile Gly Pro Arg Thr Asp Ser Tyr Lys Glu Ile Gln Leu Asn Gly Asp Gln Ala Trp
[0120] Lys Asp Val Asn Pro Asn Gly Ile Ser Glu Leu Val Lys Gly Asn Pro Phe Gly Gly
[0121] Ser Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Gly Glu Glu Arg Val Thr Glu Glu Glu Asn Asn
[0122] Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro Ile Gly Leu Lys Val Ser
[0123] Asp Glu
[0124] 4．表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定:
[0125] 将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含3mL LB培养基(含卡那毒素60μg／mL)的试管内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.5mmol/L,继续振荡培养诱导6h， 离心收集菌体进行SDS-PAGE检测,重组子表达相对分子量为55 kD的HAdV嵌合蛋白，而对照菌BL21(DE3)无此蛋白带。
[0126] 5．腺病毒抗原表位嵌合蛋白的纯化:
[0127] 1）腺病毒抗原表位嵌合蛋白工程菌的超声裂解
[0128] 将诱导表达嵌合蛋白的工程菌离心(8000 rpm、10 min、4℃)收菌，菌体重悬于原培养液1／10体积的细菌裂解液(20 mmol/L PB pH7.4、5% 甘油)内，冰浴超声破菌，离心收集上清。
[0129] 2）腺病毒抗原表位嵌合蛋白的硫酸胺分级沉淀
[0130] 精确量出上清体积，向上清内加入适量饱和硫酸胺溶液，边加边搅拌，使硫酸胺的终浓度为25％，置冰浴内过夜。离心收集上清，加入适量固体硫酸胺粉末，边加边搅拌，使硫酸胺的终浓度为50％，置冰浴内过夜。次日离心收集沉淀。用200mL平衡液（50mM Tris-HCl，pH 7.5）悬浮沉淀，装入透析袋内，对1000mL平衡液透析过夜,换液4次。离心收集上清，直接上DEAE-Separose FF阴离子柱纯化。
[0131] 3）DEAE-Separose FF阴离子柱纯化
[0132] 用平衡液（50Mm Tris-HCl，pH 7.5）冲洗平衡DEAE-Separose FF阴离子柱，然后将上步透析好的上清直接上柱，流速约100 mL/h。上样结束后用平衡液充分洗柱，再依次用含100、200、300、400、500、1000 mmol/L NaCl的平衡液洗脱蛋白，收集各洗脱峰蛋白，用12％ SDS－PAGE电泳检测各峰蛋白，确定哪个洗脱峰含表达的腺病毒抗原表位嵌合蛋白。300 mmol/L NaCl洗脱蛋白峰即为腺病毒抗原表位嵌合蛋白。
[0133] 6. 将表达的腺病毒抗原表位嵌合蛋白，用于疫苗、HAdV抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗HAdV单抗和多抗等。
[0134] 7．将五种型别腺病毒六邻体蛋白的强抗原性蛋白片段连接，以融合蛋白的形式进行表达、制备。
[0135] 8．通过基因重组技术，利用酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备腺病毒抗原表位嵌合蛋白。
[0136] 英文缩写说明：HAdV(Human adenovirus):人腺病毒; EDTA: 四甲基乙二胺；IPTG：异丙基硫代半乳糖苷 ； DTT：二硫苏糖醇； SDS：十二烷基磺酸纳；PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳； PB：磷酸盐缓冲液； kD：千道尔顿。
[0137] 本发明与现有技术相比具有的优点
[0138] 我们表达的腺病毒抗原表位嵌合蛋白，有较多优点:
[0139] 1．将五种型别腺病毒抗原表位蛋白片段融合表达，比分别使用单独的蛋白片段更方便、经济。用嵌合蛋白作抗原检测抗HAdV抗体时，不再需要分别制备这些蛋白片段，也不需要调整这些抗原的使用比例，因此应用方便且成本较低。
[0140] 2．目前所用的腺病毒疫苗主要是灭活疫苗及减毒活疫苗，但腺病毒对动物有致癌性，危险大，因此开发新型不含DNA的核壳成分疫苗显得迫在眉睫。我们利用基因工程技术表达制备含有多种腺病毒六邻体抗原表位的嵌合蛋白，为研制基因工程疫苗奠定基础。基因工程疫苗具有安全、成本低的优点。
[0141] 3．表达的含有五种类型腺病毒抗原表位的嵌合蛋白以可溶性形式存在，易于纯化，且不需要复性处理。
附图说明
[0142] 以下将结合附图对本发明作进一步说明：
[0143] 图1是分子生物学软件对腺病毒3型六邻体蛋白抗原表位进行分析的结果。结果显示，在腺病毒3型六邻体蛋白N端含有4个强的亲水性抗原表位：136～151aa、164～187aa、265～284aa、422～437aa，即图内箭头标示的位置。
[0144] 图2是分子生物学软件对腺病毒7型六邻体蛋白抗原表位进行分析的结果。结果显示，在腺病毒7型六邻体蛋白N端含有4个强的亲水性抗原表位：136～148aa、161～181aa，258～276aa、415～426aa，即图内箭头标示的位置。
[0145] 图3是分子生物学软件对腺病毒11型六邻体蛋白抗原表位进行分析的结果。结果显示，在腺病毒11型六邻体蛋白N端含有2个强的亲水性抗原表位：136～160aa、174～186aa，即图内箭头标示的位置。
[0146] 图4是分子生物学软件对腺病毒14型六邻体蛋白抗原表位进行分析的结果。结果显示，在腺病毒14型六邻体蛋白N端含有4个强的亲水性抗原表位：136～160aa、174～196aa、268～286aa、415～450aa，即图内箭头标示的位置。
[0147] 图5是分子生物学软件对腺病毒55型六邻体蛋白抗原表位进行分析的结果。结果显示，在腺病毒3型六邻体蛋白N端含有2个强的亲水性抗原表位：136～158aa、172～184aa，即图内箭头标示的位置。
[0148] 图6是表达五种型别腺病毒抗原表位嵌合蛋白的重组质粒构建流程图。
[0149] 图7是表达腺病毒抗原表位嵌合蛋白重组菌的SDS-PAGE分析结果。将构建的重组质粒转化到大肠杆菌中，挑单菌落后筛选高产菌株的SDS-PAGE电泳图。M：蛋白marker；阴：含pET-28a（+）质粒的阴性对照菌；1-5：腺病毒抗原表位嵌合蛋白重组菌，五个重组子均表达相对分子量为55kDa的嵌合蛋白，即图中箭头标示的位置。
[0150] 图8是表达腺病毒抗原表位嵌合蛋白纯化后的SDS-PAGE分析结果。M：蛋白Marker；1：纯化后的腺病毒抗原表位嵌合蛋白，浓度为0.5mg/mL，相对分子量55kDa；2：浓度为
0.5mg/mL的 BSA。
具体实施方式
[0151] 本发明实施方式的详细说明：
[0152] 腺病毒六邻体蛋白抗原表位的分析、基因合成及表达
[0153] 通过计算机分析腺病毒3型、7型、11型、14型及55型六邻体蛋白的氨基酸序列，分别筛选出其中具有强抗原性的蛋白片段。腺病毒3型共筛选出四个蛋白片段，腺病毒7型共筛选出四个蛋白片段，腺病毒11型共两个蛋白片段，腺病毒14型共四个蛋白片段，腺病毒55型共两个蛋白片段。蛋白片段之间用两个甘氨酸和一个丝氨酸连接，串联成一个多抗原表位嵌合蛋白。选用原核生物偏爱的密码子，将嵌合蛋白翻译成相应的核苷酸序列。化学合成该嵌合蛋白的全长基因序列，并将其克隆至质粒pET-28a(+)内的NdeI／EcoRI位点，表达腺病毒抗原表位嵌合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选获得了高效表达腺病毒抗原表位嵌合蛋白的工程菌，表达的HAdV嵌合蛋白占菌体蛋白总量的60%。
[0154] 材料与方法
[0155] 1. 菌种与质粒：宿主菌BL21(DE3)及表达载体pET-28a(+)为美国Novagen公司产品。
[0156] 2. 分子生物学试剂：限制性内切酶NdeI、EcoRI、及T4 DNA连接酶为TaKaRa公司产品。质粒纯化试剂盒及从琼脂糖凝胶内回收DNA片段的试剂盒为TaKaRa公司产品。DTT及IPTG为TaKaRa公司产品。其它试剂为进口或国产分析纯试剂。
[0157] 3. 基因片段的合成： 由大连TaKaRa公司帮助合成。
[0158] 4. 基因克隆方法：DNA的酶切、连接、电泳；质粒的提取、转化； 蛋白的SDS-PAGE分析等一般分子克隆方法按常规方法进行。其它试剂盒按说明书进行操作。
[0159] 5. DNA序列分析：用TaKaRa公司质粒纯化试剂盒纯化质粒，用DNA全自动测序仪测序。
[0160] 结果
[0161] 1．HAdV六邻体蛋白抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成：
[0162] 利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析腺病毒3型、7型、11型、14型及55型六邻体蛋白的氨基酸序列，发现均有多个片段含有较强的抗原决定簇。腺病毒3型共筛选出四个蛋白片段（图1），分别是第136～151位aa，共16个氨基酸；第164～187位氨基酸，共24个氨基酸；第265～284位氨基酸，共20个氨基酸；第422～437位氨基酸，共16个氨基酸。腺病毒7型共筛选出四个蛋白片段（图2），分别是第136～148位氨基酸，共13个氨基酸；第161～181位氨基酸，共21个氨基酸；第258～276位氨基酸，共19个氨基酸；第415～426位氨基酸，共12个氨基酸。腺病毒11型共两个蛋白片段（图3），分别是第136～160位氨基酸，共25个氨基酸；第174～186位氨基酸，共13个氨基酸。腺病毒14型共四个蛋白片段（图4），分别是第136～160位氨基酸，共25个氨基酸；第174～196位氨基酸，共23个氨基酸；第268～286位氨基酸，共19个氨基酸；第415～450位氨基酸，共36个氨基酸。腺病毒55型共两个蛋白片段（图5），分别是第136～158位氨基酸，共23个氨基酸；第172～184位氨基酸，共13个氨基酸。蛋白片段之间用两个甘氨酸和一个丝氨酸连接，串联成一个多抗原表位嵌合蛋白。选用原核生物偏爱的密码子，将嵌合蛋白翻译成相应的核苷酸序列。在嵌合蛋白基因序列的5'端增加了NdeI酶切位点，在3'端增加了终止密码子（TAA）和EcoRI酶切位点。化学合成该嵌合蛋白的全长基因序列。
[0163] 筛选的腺病毒3型抗原表位氨基酸序列：
[0164] 第136～151位aa：
[0165] Ile Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn Thr[0166] 第164～187位aa：
[0167] Lys Glu Gly Leu Gln Ile Gly Lys Asp Ile Thr Thr Thr Glu Gly Glu Glu Lys Pro
[0168] Ile Tyr Ala Asp Lys
[0169] 第265～284位aa：
[0170] Asp Gly Arg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu Ala Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu
[0171] Asn
[0172] 第422～437位aa：
[0173] Ile Lys Val Lys Thr Asp Asp Thr Asn Gly Trp Glu Lys Asp Ala Asn[0174] 筛选的腺病毒7型抗原表位氨基酸序列：
[0175] 第136～148位aa：
[0176] Ile Val Thr Thr Gly Glu Asp Asn Ala Thr Thr Tyr Thr
[0177] 第161～181位aa：
[0178] Lys Glu Gly Leu Glu Ile Gly Lys Asp Ile Thr Ala Asp Asn Lys Pro Ile Tyr AlaAsp Lys
[0179] 第258～276位aa：
[0180] Asp Gly Arg Glu Ala Ala Asp Ala Phe Ser Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn
[0181] 第415～426位aa：
[0182] Ile Lys Pro Arg Asp Thr Ala Trp Glu Lys Asp Thr
[0183] 筛选的腺病毒11型抗原表位氨基酸序列：
[0184] 第136～160位aa：
[0185] Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Thr Thr Gly Glu Glu His Val Thr Glu Glu Glu Thr
[0186] Asn Thr Thr Thr Tyr Thr
[0187] 第174～186位aa：
[0188] Lys Glu Gly Leu Pro Val Gly Leu Glu Val Ser Asp Glu
[0189] 筛选的腺病毒14型抗原表位氨基酸序列：
[0190] 第136～160位aa：
[0191] Leu Asp Lys Gly Val Glu Thr Thr Glu Glu Arg Gln Asn Glu Asp Gly Glu Asn Asp
[0192] Glu Lys Ala Thr Tyr Thr
[0193] 第174～196位aa：
[0194] Lys Asp Gly Leu Pro Ile Gly Leu Glu Val Pro Ala Glu Gly Asp Pro Lys Pro Ile
[0195] Tyr Ala Asn Lys
[0196] 第268～286位aa：
[0197] Asp Leu Arg Ser Gln Lys Gln Gly Leu Lys Pro Lys Ile Val Met Tyr Ala Glu Asn
[0198] 第415～450位aa：
[0199] Ile Gly Pro Arg Thr Asp Ser Tyr Lys Glu Ile Gln Leu Asn Gly Asp Gln Ala Trp
[0200] Lys Asp Val Asn Pro Asn Gly Ile Ser Glu Leu Val Lys Gly Asn Pro Phe[0201] 筛选的腺病毒55型抗原表位氨基酸序列：
[0202] 第136～158位aa：
[0203] Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Gly Glu Glu Arg Val Thr Glu Glu Glu Asn Asn Thr
[0204] Thr Thr Tyr Thr
[0205] 第172～184位aa：
[0206] Lys Glu Gly Leu Pro Ile Gly Leu Lys Val Ser Asp Glu
[0207] 腺病毒3型抗原表位氨基酸序列：
[0208] Ile Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn Thr Gly Gly Ser
[0209] Lys Glu Gly Leu Gln Ile Gly Lys Asp Ile Thr Thr Thr Glu Gly Glu Glu Lys Pro
[0210] Ile Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu Ala
[0211] Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser Ile Lys Val Lys Thr Asp Asp
[0212] Thr Asn Gly Trp Glu Lys Asp Ala Asn
[0213] 腺病毒7型抗原表位氨基酸序列：
[0214] Ile Val Thr Thr Gly Glu Asp Asn Ala Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly
[0215] Leu Glu Ile Gly Lys Asp Ile Thr Ala Asp Asn Lys Pro Ile Tyr Ala Asp Lys Gly
[0216] Gly Ser Asp Gly Arg Glu Ala Ala Asp Ala Phe Ser Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr
[0217] Glu Asn Gly Gly Ser Ile Lys Pro Arg Asp Thr Ala Trp Glu Lys Asp Thr[0218] 腺病毒11型抗原表位氨基酸序列：
[0219] Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Thr Thr Gly Glu Glu His Val Thr Glu Glu Glu Thr
[0220] Asn Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro Val Gly Leu Glu Val
[0221] Ser Asp Glu
[0222] 腺病毒14型抗原表位氨基酸序列：
[0223] Leu Asp Lys Gly Val Glu Thr Thr Glu Glu Arg Gln Asn Glu Asp Gly Glu Asn Asp
[0224] Glu Lys Ala Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Asp Gly Leu Pro Ile Gly Leu Glu Val
[0225] Pro Ala Glu Gly Asp Pro Lys Pro Ile Tyr Ala Asn Lys Gly Gly Ser Asp Leu Arg
[0226] Ser Gln Lys Gln Gly Leu Lys Pro Lys Ile Val Met Tyr Ala Glu Asn Gly Gly Ser
[0227] Ile Gly Pro Arg Thr Asp Ser Tyr Lys Glu Ile Gln Leu Asn Gly Asp Gln Ala Trp
[0228] Lys Asp Val Asn Pro Asn Gly Ile Ser Glu Leu Val Lys Gly Asn Pro Phe[0229] 腺病毒55型抗原表位氨基酸序列：
[0230] Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Gly Glu Glu Arg Val Thr Glu Glu Glu Asn Asn Thr
[0231] Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro Ile Gly Leu Lys Val Ser Asp
[0232] Glu
[0233] 嵌合蛋白氨基酸序列：
[0234] Ile Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn Thr Gly Gly Ser
[0235] Lys Glu Gly Leu Gln Ile Gly Lys Asp Ile Thr Thr Thr Glu Gly Glu Glu Lys Pro
[0236] Ile Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu Ala
[0237] Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser Ile Lys Val Lys Thr Asp Asp
[0238] Thr Asn Gly Trp Glu Lys Asp Ala Asn Gly Gly Ser Ile Val Thr Thr Gly Glu Asp
[0239] Asn Ala Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Glu Ile Gly Lys Asp Ile
[0240] Thr Ala Asp Asn Lys Pro Ile Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Glu Ala
[0241] Ala Asp Ala Phe Ser Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser Ile Lys
[0242] Pro Arg Asp Thr Ala Trp Glu Lys Asp Thr Gly Gly Ser Ile Ala Glu Gly Val Lys
[0243] Asn Thr Thr Gly Glu Glu His Val Thr Glu Glu Glu Thr Asn Thr Thr Thr Tyr Thr
[0244] Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro Val Gly Leu Glu Val Ser Asp Glu Gly Gly Ser
[0245] Leu Asp Lys Gly Val Glu Thr Thr Glu Glu Arg Gln Asn Glu Asp Gly Glu Asn Asp
[0246] Glu Lys Ala Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Asp Gly Leu Pro Ile Gly Leu Glu Val
[0247] Pro Ala Glu Gly Asp Pro Lys Pro Ile Tyr Ala Asn Lys Gly Gly Ser Asp Leu Arg
[0248] Ser Gln Lys Gln Gly Leu Lys Pro Lys Ile Val Met Tyr Ala Glu Asn Gly Gly Ser
[0249] Ile Gly Pro Arg Thr Asp Ser Tyr Lys Glu Ile Gln Leu Asn Gly Asp Gln Ala Trp
[0250] Lys Asp Val Asn Pro Asn Gly Ile Ser Glu Leu Val Lys Gly Asn Pro Phe Gly Gly
[0251] Ser Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Gly Glu Glu Arg Val Thr Glu Glu Glu Asn Asn
[0252] Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro Ile Gly Leu Lys Val Ser
[0253] Asp Glu
[0254] 化学合成的嵌合蛋白的DNA序列（1104bp）
[0255]
[0256] 2． HAdV抗原表位嵌合蛋白重组质粒的构建:
[0257] 提取质粒pET28a（＋）（美国Novagen公司产品），用NdeI和EcoRI双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段, 溶于去离子水内。用NdeI和EcoR I双酶切化学合成的HAdV抗原表位嵌合蛋白基因片段，电泳回收后, 溶于去离子水内。取上述酶切后DNA片段，插入到载体pET28a（＋）内的NdeI和EcoR I位点之间，表达含有五种型别腺病毒抗原表位的嵌合蛋白。构建流程见图6。
[0258] 3．重组质粒的筛选与鉴定:
[0259] 将上步连接的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，将转化产物涂布含卡那霉素(60μg／mL)LB平板，置37℃过夜。次日随机挑选5个转化子菌落，分别接种到含4 mL液体LB培养基（含卡那霉素60μg／mL）的试管内，置37℃振荡培养6h，取菌液1mL，离心收菌。分别用50μL去离子水悬浮菌体，沸水煮5min,离心（4℃，12000rpm ）5min, 取上清（内有质粒）1μL用作PCR模板,用嵌合蛋白基因片段5’端的引物（5’- CATATGATTGTTACGACGAACGGTGATAAT-3’）和3’端的引物（5’- GAATTCTTATT
[0260] CATCGGAGACTTT-3’）组成引物对，PCR扩增含嵌合蛋白基因片段的阳性重组质粒，应扩增出长1104bp的基因片段。PCR 反应浓度为：质粒模板1μL、上下游引物各1μL、10x Buffer 5.0μL、 2.5 mmol/L dNTP 4.0μL、Taq DNA 聚合酶0.5μL (2.5 U)、去离子水37.5μL,总体积50μL。扩增条件为：94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 60秒，30个循环；最后72℃延伸7分钟。 取PCR扩增产物5μL,用1.2％的Agarose凝胶检测, 结果，8个转化子均扩增出1104bp的目的基因片段。证实，均含有五种型别腺病毒抗原表位基因片段的串联基因。
[0261] 提取转化子的质粒，测定质粒内的五种型别腺病毒抗原表位基因片段的串联基因序列，DNA序列分析证实，重组质粒含有五种型别腺病毒抗原表位基因片段，序列完全正确：
[0262]
[0263] 构建的重组质粒表达含有五种型别腺病毒抗原表位的嵌合蛋白，全长363个氨基酸，在其N端为腺病毒3型抗原表位蛋白片段，依次串联7型、11型、14型抗原表位蛋白片段，C端为腺病毒55型抗原表位蛋白片段，各片段长度依次为3型长85个氨基酸，7型长74个氨基酸，11型长41个氨基酸，14型长112个氨基酸，55型长39个氨基酸，片段之间由两个甘氨酸和一个丝氨酸连接,其氨基酸序列如下：
[0264] Ile Val Thr Thr Asn Gly Asp Asn Ala Val Thr Thr Thr Thr Asn Thr Gly Gly Ser
[0265] Lys Glu Gly Leu Gln Ile Gly Lys Asp Ile Thr Thr Thr Glu Gly Glu Glu Lys Pro
[0266] Ile Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Asp Ala Val Ala Gly Ala Leu Ala
[0267] Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser Ile Lys Val Lys Thr Asp Asp
[0268] Thr Asn Gly Trp Glu Lys Asp Ala Asn Gly Gly Ser Ile Val Thr Thr Gly Glu Asp
[0269] Asn Ala Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Glu Ile Gly Lys Asp Ile
[0270] Thr Ala Asp Asn Lys Pro Ile Tyr Ala Asp Lys Gly Gly Ser Asp Gly Arg Glu Ala
[0271] Ala Asp Ala Phe Ser Pro Glu Ile Val Leu Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Ser Ile Lys
[0272] Pro Arg Asp Thr Ala Trp Glu Lys Asp Thr Gly Gly Ser Ile Ala Glu Gly Val Lys
[0273] Asn Thr Thr Gly Glu Glu His Val Thr Glu Glu Glu Thr Asn Thr Thr Thr Tyr Thr
[0274] Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro Val Gly Leu Glu Val Ser Asp Glu Gly Gly Ser
[0275] Leu Asp Lys Gly Val Glu Thr Thr Glu Glu Arg Gln Asn Glu Asp Gly Glu Asn Asp
[0276] Glu Lys Ala Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Asp Gly Leu Pro Ile Gly Leu Glu Val
[0277] Pro Ala Glu Gly Asp Pro Lys Pro Ile Tyr Ala Asn Lys Gly Gly Ser Asp Leu Arg
[0278] Ser Gln Lys Gln Gly Leu Lys Pro Lys Ile Val Met Tyr Ala Glu Asn Gly Gly Ser
[0279] Ile Gly Pro Arg Thr Asp Ser Tyr Lys Glu Ile Gln Leu Asn Gly Asp Gln Ala Trp
[0280] Lys Asp Val Asn Pro Asn Gly Ile Ser Glu Leu Val Lys Gly Asn Pro Phe Gly Gly
[0281] Ser Ile Ala Glu Gly Val Lys Asn Gly Glu Glu Arg Val Thr Glu Glu Glu Asn Asn
[0282] Thr Thr Thr Tyr Thr Gly Gly Ser Lys Glu Gly Leu Pro Ile Gly Leu Lys Val Ser
[0283] Asp Glu
[0284] 4．表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定:
[0285] 将上述转化子接种至含3mL LB培养基(含卡那毒素60μg／mL)的试管内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.5mmol/L,继续振荡培养诱导6h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测, 5个转化子表达相对分子量为55 kD的腺病毒抗原表位嵌合蛋白（图7）。
[0286] 腺病毒抗原表位嵌合蛋白的纯化
[0287] 根据腺病毒抗原表位嵌合蛋白的氨基酸序列，分析其理化特性，确定适当的纯化方法。经计算机分析，腺病毒抗原表位嵌合蛋白的等电点为pH4.365, 因此我们决定在pH为7.5的50Mm Tris-HCl缓冲液内，用DEAE-Separose FF阴离子柱纯化。具体步骤如下：
[0288] 材料和方法
[0289] 1.主要试剂:
[0290] DEAE-Separose FF阴离子凝胶为Pharmacia公司产品，IPTG、DTT为TaTaRa公司产品。其它试剂为国产或进口分析纯试剂。
[0291] 2. 腺病毒抗原表位嵌合蛋白工程菌的诱导表达及超声裂解
[0292] 从接种有1号工程菌的LB平板上，用牙签挑单菌落，接种到含200mL LB液体培养基的三角烧瓶内，加卡那霉素至终浓度60µg/mL,置37℃摇床内培养过夜。次日，将菌液接种到4个分别含200mL LB液体培养基的三角烧瓶，每瓶接种菌液50mL,置37℃摇床内振荡培养1小时，然后加IPTG至终浓度0.1mmol/L, 诱导表达4小时。
[0293] 将诱导表达嵌合蛋白的1000mL工程菌离心(8000 rpm、30 min、4℃)收菌，菌体重悬于100mL的细菌裂解液(20 mmol/L PB pH7.4、10 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、5% 甘油)内，冰浴超声破菌10 min，离心(8000 rpm、30 min、4℃) 收集上清。
[0294] 3．腺病毒抗原表位嵌合蛋白的硫酸胺分级沉淀
[0295] 精确量出上清体积，向上清内加入适量饱和硫酸胺溶液，边加边搅拌，使硫酸胺的终浓度为25％，置冰浴内过夜。次日离心(12000 rpm、20 min、4℃)收集上清，加入适量固体硫酸胺粉末，边加边搅拌，使硫酸胺的终浓度为50％，置冰浴内过夜。次日离心(12000 rpm、20 min、4℃)收集沉淀。用200mL平衡液（50mM Tris-HCl，pH 7.5）悬浮沉淀，装入透析袋内，对1000mL平衡液透析过夜,换液4次。离心(12000 rpm、20 min、4℃)收集上清，直接上DEAE-Separose FF阴离子柱纯化。
[0296] 4．DEAE-Separose FF阴离子柱纯化
[0297] 用平衡液（50mM Tris-HCl，pH 7.5）冲洗平衡DEAE-Separose FF阴离子柱，然后将上步透析好的上清直接上柱， 上样流速100 mL/h。上样结束后用平衡液充分洗柱，再依次用含100、200、300、400、500、1000 mmol/L NaCl的溶液洗脱蛋白，收集各洗脱峰蛋白，用12％ SDS－PAGE电泳检测各峰蛋白，确定哪个洗脱峰含表达的腺病毒抗原表位嵌合蛋白。
[0298] 结果
[0299] 将不同浓度NaCl从DEAE-Separose FF柱上洗脱的蛋白进行SDS-PAGE分析，由电泳结果可知，腺病毒抗原表位嵌合蛋白存在于300 mmol/L NaCl洗脱蛋白峰中。
[0300] 将300 mmol/L NaCl洗脱蛋白峰通过透析浓缩处理，SDS-PAGE测定嵌合蛋白浓度，可知纯化所得的嵌合蛋白浓度为0.5mg/mL（图8）。
[0301] 腺病毒抗原表位嵌合蛋白的鉴定及应用
[0302] 将纯化的腺病毒抗原表位嵌合蛋白用作免疫原，免疫BALB/c小鼠，制备抗血清。通过间接ELISA实验方法，利用五种型别腺病毒抗原表位蛋白对嵌合蛋白抗血清进行检测，以鉴定腺病毒抗原表位嵌合蛋白的免疫原性。实验结果显示，该嵌合蛋白具有很好的免疫原性，可用作腺病毒疫苗的研究。
[0303] 材料和方法
[0304] 1. 腺病毒3型、7型、11型、14型和55型的抗原表位蛋白：由本实验室制备保存。
[0305] 2. 酶联反应材料:酶联板为深圳产96孔板，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG购自Sigma公司。其它材料为酶联反应的常规材料。
[0306] 3. 嵌合蛋白抗血清制备：将嵌合蛋白与弗氏完全佐剂等体积充分混合乳化后，腹腔注射免疫小鼠。之后每隔两周，将嵌合蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化后，进行加强免疫。共免疫4次。第4次免疫后两周，眼眶取血，制备抗血清。
[0307] 4. 嵌合蛋白免疫原性检测：采用间接ELISA法对嵌合蛋白免疫原性进行检测。基本步骤为：用CBS缓冲液（pH9.6）分别稀释五种型别腺病毒抗原表位蛋白至终浓度为2μg/mL，包被96孔酶标板，每孔100μL，4℃孵育过夜；之后用1‰ PBST充分洗板5次，10%的小牛血清（FBS）作为封闭液，每孔加150μL，37℃封闭2h；1‰ PBST 充分洗板5次，嵌合蛋白抗血清按如下比例梯度稀释（稀释液为10%的小牛血清）1:10000，1:20000，1:40000，1:80000，1:160000，1:320000，1:640000，1:1280000，100μL/孔，37℃孵育2h，阴性血清按1:10000稀释作为对照；1‰ PBST充分洗板5次；加1：5000稀释（稀释液为10%的小牛血清）的羊抗鼠IgG，
100μL/孔，37℃孵育1h；1‰ PBST 充分洗板5次，加入TMB显色液，50μL /孔，37℃，避光反应
10min；加入1mol/L 的HCl，50µL/孔，终止反应；酶标仪测定各孔A450值，若P/N>2.1，即可判定结果阳性。
[0308] 结果
[0309] 1.间接ELISA法检测腺病毒抗原表位嵌合蛋白免疫原性
[0310] 将纯化的腺病毒3型、7型、11型、14型和55型抗原表位蛋白用CBS缓冲液稀释包被酶标板，检测用腺病毒抗原表位嵌合蛋白免疫小鼠得到的抗血清。结果显示，腺病毒3型蛋白检测嵌合蛋白血清抗体效价为1:320000；腺病毒7型蛋白检测嵌合蛋白血清抗体效价为1:640000；腺病毒11型蛋白检测嵌合蛋白血清抗体效价为1:640000；腺病毒14型蛋白检测嵌合蛋白血清抗体效价为1:1280000；腺病毒55型蛋白检测嵌合蛋白血清抗体效价为1:
640000。说明腺病毒抗原表位嵌合蛋白免疫机体后，能够有效的刺激机体产生针对各型别腺病毒抗原表位的抗体，具有较好的免疫原性，为进一步研制腺病毒疫苗奠定基础。
[0311] 人腺病毒(HAdV)抗原表位嵌合蛋白序列表见附件文档：核苷酸或氨基酸序列表计算机可读载体。
