一种DNA分子克隆方法转让专利
申请号 : CN201610190015.8
文献号 : CN105821067B
文献日 : 2019-08-13
发明人 : 孟尔 , 张东裔 , 张辉 , 刘长军 , 鲍邵衡 , 吴磊 , 朱凌云 , 柳珑
申请人 : 中国人民解放军国防科学技术大学
摘要 :
以长引物和PCR为基础的分子克隆技术具有操作简单、效率高、成本低的优点。随着高保真DNA聚合酶的出现，基于PCR的分子克隆方法越来越广泛地被使用。本发明涉及一种嵌合体构建和片段插入的分子克隆策略,首次命名为MP克隆(mega primer cloning)。该方法包括以下几步：1)长引物的PCR扩增。2)长引物参与的第二轮PCR扩增。3)PCR产物DpnI消化并转化到大肠杆菌感受态中。PCR产物的纯化可以显著的提高MP克隆的效率。实验证明，这种方法是一种简单有效的分子克隆工具。
权利要求 :
1.一种DNA分子克隆方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)进行嵌合体构建的引物设计：
构建基因1和基因2的嵌合体时：设以下2组引物：F1、R1、F2、R2，各引物全长在60bp以内，其中F1和R1对应扩增的目的基因为基因1，F2和R2对应的目的基因为基因2；F1和R2的3’端分别与各自的目的基因同源，F1和R2的5’端分别与目的载体同源；F2和R1的3’端分别与各自的目的基因同源，F2的5端与基因1有部分同源，R1的5端与基因2有部分同源，F2和R1完全反向互补；F1、R1、F2、R2的Tm值为50—80℃；当构建两个以上基因的嵌合体时，也同时遵守以上原则；
(2)酶链聚合反应：
在第一轮PCR中，基因1由F1和R1扩增，得到长引物M1和M2，基因2由F2和R2扩增，得到长引物M3和M4；切胶回收第一轮扩增产物M1、M2、M3和M4；在第二轮PCR中，以第一轮PCR产物M1、M2、M3、M4作为长引物，以目的载体为模版进行扩增；将第二轮PCR产物纯化后，用DpnI酶消化以去除模板；
(3)转化：将DpnI酶消化后的第二轮PCR产物转化受感态大肠杆菌并涂于含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上培养；
(4)挑选平板上长出的菌落，进行菌落PCR，电泳检测是否得到目的基因1和2。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述第一轮PCR和第二轮PCR的条件如下：PCR体系为：1×缓冲液，20pmol引物，0.4mM dNTP，1mM MgSO4，1U DNA聚合酶和1ng-
50ng模版DNA；反应条件：94℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火10s，68℃延伸，共30个循环。
说明书 :
一种DNA分子克隆方法
技术领域
[0001] 本发明属于分子克隆技术领域，具体涉及一种DNA分子克隆方法。
背景技术
[0002] 无缝克隆和基因融合已经成为蛋白质工程、蛋白质功能研究、启动子和外显子研究以及基因工程的重要工具。随着二代测序的发展，为了研究细胞和新蛋白质的生化功能，高通量融合DNA技术对于蛋白质工程和杂交蛋白的表达尤其重要。随着高保真DNA聚合酶和PCR技术的提高，很多基于大引物和PCR的无缝克隆方法陆续涌现，进而提高了基因工程的效率。比如，enzyme free克隆使用了一种兼容有尾和无尾的引物来扩增DNA片段，有粘性末端的载体可以直接转化进入大肠杆菌，但是步骤相对繁琐。一个更直接有效的将一个片段克隆到目的载体的方法叫做无限制(RF)克隆或者重叠延伸(overlap extension)克隆。与快速定点突变类似，RF克隆不需要引进无关的序列(比如限制性酶切点和特定的重组序列)就能引入一个完整的基因。RF克隆主要的限制在于线形扩增造成产量较低。另外，DNA片段插入超过1kb时效率较低，并且通常需要进一步PCR条件优化。为了提高基于大引物和PCR的克隆效率,其他研究人员也做了很多努力。通过引入一个额外的引物达到指数扩增，指数大引物PCR(EMP)和逆向融合PCR克隆(IFPC)明显提高了插入物的长度限制，但是这两种方法的最终PCR产物往往需要磷酸化和连接，这样增加了操作步骤和成本。总之，目前已报道的各类无缝克隆方法中尚无一种高效率的，既适用于长片段基因整合，同时也能够用于多片段同时整合，又只需较少引物对的方法。
发明内容
[0003] 本发明旨在提供一种低成本、高效率、节省时间的基于PCR技术的分子克隆方法，来满足高通量基因组功能研究、蛋白功能研究和改造、蛋白质的表达。具体来说主要用于较长的单基因整合(1kb-4kb均有不错效果)，也能够同时整合多达4个基因片段(尤其适合2个基因片段的整合，且单个片段长度可以是3.5kb)。
[0004] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0005] 所述DNA分子克隆方法包括如下步骤：
[0006] (1)进行嵌合体构建的引物设计：
[0007] 以构建基因1(target1)和基因2(target2)的嵌合体为例(图3)，设以下2组引物：F1、R1、F2、R2，各引物全长在60bp以内，其中F1和R1对应扩增的目的基因为基因1，F2和R2对应的目的基因为基因2；F1和R2的3’端分别与各自的目的基因同源，F1和R2的5’端分别与目的载体同源(目的载体可以是任意质粒载体<空载长度不超过8kb>，只要满足同源部分的序列没有在载体上重复出现即可)；F2和R1的3’端分别与各自的目的基因同源，F2和R1的5’端有部分序列同源，F2和R1完全反向互补；F1、R1、F2、R2的Tm值为50—80℃，优选70℃；多基因整合也遵循以上原则(图4)。
[0008] (2)酶链聚合反应：
[0009] 在第一轮PCR中，基因1由F1和R1扩增，得到长引物M1和M2，基因2由F2和R2扩增，得到长引物M3和M4；切胶回收第一轮扩增产物M1、M2、M3和M4；在第二轮PCR中，以第一轮PCR产物M1、M2、M3、M4作为长引物，以目的载体为模版进行扩增；将第二轮PCR产物纯化后，用DpnI酶消化以去除模板；
[0010] (3)转化：将DpnI酶消化后的第二轮PCR产物转化大肠杆菌并涂于含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上培养；
[0011] (4)挑选平板上长出的菌落，进行菌落PCR，电泳检测是否得到目的基因1和2。
[0012] 其中，步骤(2)所述第一轮PCR和第二轮PCR的条件如下：PCR体系为：1×缓冲液，20pmol引物，0.4mM dNTP，1mM MgSO4，1U DNA聚合酶和1ng-50ng模版DNA；反应条件：94℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火10s，68℃延伸(1.5kb/min)，共30个循环。
[0013] 步骤(3)所述的转化如下：自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌，插入冰中溶解约15min，轻轻混匀。吸取50μl移入1.5ml EP管，并立刻将细菌放回-70℃冰箱。50μl感受态细胞和5μl DNA产物轻轻混匀，静置冰上30min。于42℃水浴中热休克细菌90s，迅速移入冰中，静置2min，加入900μl LB培养液，放入37℃恒温箱摇床，225rpm摇晃培养1h。取50μl涂于含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上，待干燥后，倒置，存放于37℃的培养箱中过夜。次日，检查各培养皿中是否出现菌落。
[0014] 所述步骤(4)具体如下：制备PCR混合液(市售)。常温下随机挑选转化平板上的转化子，即用灭菌的牙签或枪头挑取单个菌落。然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的PCR管中轻轻震荡下，让菌落入管中。将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中，按常规条件扩增。电泳检测是否得到目的片段。
[0015] 本发明同样适合于同时构建含有3-4个基因的嵌合体，这些基因片段可以是长度一样，也可以是不同长度的片段(尝试的最长基因片段是500bp，最短嵌合体片段是100bp)。本发明也适合只将一个基因片段插入目的载体(尤其对于长度在1kb-4kb的基因成功率极高)，但是F2和R1选自目的基因的中间位置，所述中间位置是指排除目的基因前后200bp后的位置(图1，A)。
[0016] 在发明所述一种构建嵌合体和一般片段插入的克隆方法，我们命名为MP克隆。MP克隆是一种无缝的、连接/酶切不依赖的克隆方式、操作简单、成本低。MP克隆的一个缺点就是在延伸的过程中可能会引入突变(这个缺点是现行所有基于PCR方法的无缝克隆的通病)。然而，随着高保真酶的发展进步，这些问题是可以得到很好的解决。MP克隆，作为一种有效而简单的克隆方法，可以被用来作为一种高通量克隆工具以满足日益增长的对基因组研究和蛋白质改造的研究需求。
[0017] 与现有技术相比，本发明提出了一种新的大引物介导的克隆策略，该策略能够既满足较长的单个基因片段的克隆需要，也能满足多个基因片段嵌合体的构建(对两个基因嵌合体的构建尤为有效)。这种克隆方法需要两个连续的PCR步骤：大引物扩增和环形延伸，DpnI的消化和转化。整个工作在一天之内就能完成。尤其是，第二次PCR产物的纯化能大大提高克隆效率。
附图说明
[0018] 图1为通过MP克隆进行片段插入的图；(A)MP克隆和RF克隆的比较；(B)两种克隆方法PCR效率比较。从左往右，分别是泳道1-8。泳道1：DNA分子量标记。对于MP克隆，目的基因分解为两部分并通过两组引物扩增(泳道2和泳道3)；这些片段作为长引物进行第二轮PCR(在泳道4，用了10ng模板，在泳道7，用了100ng模板)；对于RF克隆，目的基因是用F1和R2扩增。在第二轮PCR中作为长引物扩增(泳道6使用10ng模板，泳道10使用了100ng模板)；(C)菌落PCR筛选阳性克隆。
[0019] 图2为第二轮PCR产物不同处理方式对克隆效率的影响。PCR产物三种处理方式：直接用DpnI消化(PCR products)，稀释后消化(Diluted)，纯化PCR产物后消化(Purified)。以每组平板最终的克隆数来估计克隆效率。结果来自三组独立实验的mean±SEM。**P<0.01vs Purified。
[0020] 图3为MP克隆(A)双基因嵌合体构建原理阐述(左)及实验流程(右)；目的基因用灰色表示target1(实线)和target2(虚线)。M代表长引物(mega primer)。(B)pGADT7-2000嵌合体的构建。从左往右，依次是泳道1-6。泳道1和泳道2：第一轮PCR产物(M1&M2，M3&M4)。泳道3：第二轮PCR。泳道4：DNA分子量标记；目的片段通过胶回收(泳道5)并通过NdeI/XhoI酶鉴定(泳道6)；(C)pGADT7-2000嵌合体图示；(D)酶切验证。N示阴性对照，即未被酶切的质粒。
[0021] 图4为MP克隆的四基因嵌合体构建示意图。
具体实施方式
[0022] 实施例1
[0023] MP克隆进行单一DNA片段插入
[0024] MP克隆可以用来进行通常的克隆如DNA片段插入(图1)。引物F1和R2来自目的基因的两端。引物R1和F2来自目的基因的中间部分(所述中间位置是指排除目的基因前后200bp后的位置)，反相互补，Tm值50℃-70℃。与RF克隆相比，MP克隆需要额外的两个引物(R1和F2)，在MP克隆中，目的基因被分为两个部分，被用于接下来的PCR反应。通过文献报道及本实验室的实际结果，RF克隆对于构建不长于1kb的片段十分有效，然而对于更长的片段，这种基于重叠延伸的克隆方法效率降低，这是由于以下2个原因：首先，由于RF克隆是一个线性扩增(非指数扩增)的过程，扩增的目的片段本身数量就少，有时是不能在琼脂胶上检测到。其次，对于RF克隆来说，更长的片段不能有效的退火结合到目的载体上。这是因为F1和R2之间的很长的非互补区(环状区)构成了一个阻碍(图1，A右)。为了将一段1485bp的片段(SEQ ID NO.1)插入pET-40载体中，我们分别使用了RF克隆和MP克隆，并进行了比较。结果显示，对于MP克隆来说，即使使用10ng的模板，目的条带(长度大约是7600bp)也可以清晰检测到，而对于RF克隆，即便使用100ng模板，也无法检测到目的条带。在同样的感受态效率6
(10/μg)下，通过MP克隆，我们最终在LB平板上可以得到近千个克隆。而RF克隆仅得到15个克隆。随机选择了24个克隆进行菌落PCR鉴定(MP克隆组)，全部为阳性结果。进一步将这些阳性结果进行DNA测序，测序表明均是目的质粒。我们所建立的MP克隆具有更高的效率，更加适合构建长片段。MP克隆时，涉及到的长引物为M1(SEQ ID NO.2)、M2(SEQ ID NO.3)、M3(SEQ ID NO.4)、M4(SEQ ID NO.5)、M5(SEQ ID NO.6)、M6(SEQ ID NO.7)；
(10/μg)下，通过MP克隆，我们最终在LB平板上可以得到近千个克隆。而RF克隆仅得到15个克隆。随机选择了24个克隆进行菌落PCR鉴定(MP克隆组)，全部为阳性结果。进一步将这些阳性结果进行DNA测序，测序表明均是目的质粒。我们所建立的MP克隆具有更高的效率，更加适合构建长片段。MP克隆时，涉及到的长引物为M1(SEQ ID NO.2)、M2(SEQ ID NO.3)、M3(SEQ ID NO.4)、M4(SEQ ID NO.5)、M5(SEQ ID NO.6)、M6(SEQ ID NO.7)；
[0025] 为了去除模板，第二轮PCR的产物需要用DpnI酶消化。值得注意的是，PCR产物在用DpnI酶消化之前进行纯化，能显著地提高最终的克隆数(图2)。而非纯化的PCR产物直接用DpnI得到的克隆数要少得多。PCR产物的稀释再进行消化也能在一定程度上提高克隆效率。片段插入引物设计见表1。
[0026] 表1
[0027]
[0028] 序列中下划线部分与目的载体同源，其余部分均与目的基因同源，中间相邻的引物(R1和F2)完全反向互补。
[0029] MP克隆进行两个DNA片段插入
[0030] 嵌合体构建是研究蛋白结构和功能关系以及药物研发的非常有用的工具。已经有报道介绍了几种方法用来构建嵌合体。然而，这些方法或者需要昂贵的重组酶或者需要繁杂的步骤。例如HTP克隆依赖于Gateway克隆系统。该系统利用价格不菲的克隆酶(Invitrogen)将带有attP1和attP2重组位点的片段整合到载体。基于多个模版的顺序PCR方法需要多个步骤，将片段拼接，通过多组酶切构建到目标载体。而本发明的MP方法，可以同时整合多个基因入同一载体，而不是顺序转化。
[0031] 图3阐述了MP克隆进行两个DNA片段同时插入的机制，图中的箭头表示引物延伸方向。如图，为了构建目标基因1(Target 1)和目标基因2(Target 2)的嵌合体，需要两对引物。在第一轮PCR(1st PCR)中，目标基因1由引物F1和R1扩增，而目标基因2由引物F2和R2扩增。引物F1和引物R2的5’端与受体质粒同源，3’端与目的基因同源。引物F2和R1 3’端与目的基因同源，5’有10—30bp的序列与对方基因同源。两端基因通过扩增之后，采用胶回收将目的片段富集。这些片段被定义为大引物(M1，M2，M3，M4。其中M1与M2，M3与M4完全反向互补)，被用来进行第二轮的酶链聚合反应。在第二轮PCR(2nd PCR)中，我们推测发生了两步反应。第一步，M1和M4退火结合到目标载体上，并呈指数扩增，得到带有同源末端的线性重组质粒(产物i)，同时，M2和M3互相退火延伸，拼接为另一对大引物(M5和M6)。第二步，M5和M6退火结合到产物i并延伸成为完整的带有两个缺口的重组质粒。经过变性退火之后，一共得到四种产物(i、ii、iii、iv)，可以转化到大肠杆菌感受态细胞中。在这些产物中，产物i是可以认为是不规则的DNA分子(非环状结构)，这种克隆效率是比较低的。而产物ii、iii、iv则可以形成比较稳定的带有环状结构的含有缺口的质粒，可以高效的转化到大肠杆菌中并被修复。因为在第二轮PCR中的第一步是一个指数扩增的过程，作为模版的载体量可以控制在很低(1ng-10ng)，所以背景可以控制在一个很低的水平。
[0032] 为了验证这个方法，将两个不同的长度为1000bp的片段(Target 1和Target 2)插入到pGADT7(7988bp)的NdeI和XhoI位点之间，来构建pGADT7-2000嵌合体(SEQ IDNO.12)(图3，C)。构建完成时，质粒总长度为9996bp。对于，我们随机挑了17个克隆,提取质粒并用NdeI/XhoI进行酶切验证。结果表明，所有的克隆都是阳性的。消化结果从电泳胶上观察，
2000bp和7000bp左右的片段被切了下来，符合预期结果(图3，D)。嵌合体的序列进一步通过测序证实无误。结果表明，所有的克隆都是正确的，并没有发生突变。需要注意的是，在第二轮PCR中，长引物的摩尔量最好一致。涉及到的长引物为M1(SEQ ID NO.13)、M2(SEQ ID NO.14)、M3(SEQ ID NO.15)、M4(SEQ ID NO.16)、M5(SEQ ID NO.17)、M6(SEQ ID NO.18)。
2000bp和7000bp左右的片段被切了下来，符合预期结果(图3，D)。嵌合体的序列进一步通过测序证实无误。结果表明，所有的克隆都是正确的，并没有发生突变。需要注意的是，在第二轮PCR中，长引物的摩尔量最好一致。涉及到的长引物为M1(SEQ ID NO.13)、M2(SEQ ID NO.14)、M3(SEQ ID NO.15)、M4(SEQ ID NO.16)、M5(SEQ ID NO.17)、M6(SEQ ID NO.18)。
[0033] 采用MP克隆同时插入2个基因片段，我们最长构建了总插入长度为5947bp(3456bp+2491bp)的嵌合体以及最短插入总长度为1000bp(500bp+500bp)的嵌合体。随着长度的增加，克隆效率有所降低。克隆效率可以通过应用具有更高的延伸效率和保真性的聚合酶来改进。其他的条件包括引物长度、PCR循环数、退火温度、长引物使用量是非常灵活的，优化这些条件可以提高大片段的构建效率。嵌合体构建引物如表2所示。
[0034] 表2
[0035]
[0036] 最两端的引物序列中斜体加下划线部分与目的载体同源，其余部分均与目的基因同源。具有方框标记的序列是中间引物对相互重叠的部分。
[0037] MP克隆进行三个以上DNA片段插入
[0038] MP克隆同样可以用于多个片段的拼接(图4)。最两侧引物设计原则与上述一致，为了简化引物设计，中间引物在相邻两个基因各取25bp，全长为50bp，相邻的两条引物完全反向互补(50bp重叠)。四个片段扩增下来之后，分别将四个片段胶回收。然后将4个片段(等摩尔质量)作为长引物与目的载体加入一管PCR中进行反应。具体步骤参考以上。
[0039] 采用MP克隆，我们将4个不同长度的片段(100bp，200bp，300bp)同时构建到pCDNA-3.1载体，将4个200bp的片段同时构建到pGADT7载体，将4个500bp的片段同时构建到pGADT7载体(引物见表3)
[0040] 表3
[0041]
[0042] 序列中下划线部分与目的载体同源，其余部分均与目的基因同源，中间相邻的引物完全反向互补,分为两部分，各取25bp，由空格隔开，分别来自相邻的两个片段。