一种利用酶催化制备富含EPA和DHA甘油酯的方法

摘要

本发明属于油脂深加工、改性技术领域，具体公开了一种利用酶催化制备富含EPA和DHA甘油酯的方法。本发明以富含EPA和DHA的鱼油为原料，利用脂肪酶高效选择性催化鱼油水解，并通过严格控制酶添加量、pH、水油比、温度、时间等水解条件，通过分子蒸馏分离提纯，获得富集了EPA和DHA的甘油酯。为提高原料利用率，本发明还通过尿素包裹法回收分子蒸馏所得游离脂肪酸产物中的EPA和DHA，使之乙酯化后与分子蒸馏所得已富集了EPA和DHA的甘油酯进行进酯交换反应，还进一步提高了甘油酯中的甘三酯成分以及EPA和DHA成分。本发明方法所获得的甘三酯型鱼油中的EPA和DHA可分别提高到25％和15％以上。

权利要求

1.一种利用酶催化制备富含EPA和DHA甘油酯的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将一定量的鱼油、缓冲溶液和酶加入反应容器中，充入惰性气体保护,在搅拌或震荡下加热反应一段时间；反应结束，将所得混合物离心后分液，上层为油相，下层为水相；所述缓冲液和鱼油的体积质量比为0.5:1–3:1；酶的添加量为鱼油质量的0.1–0.5‰；所述缓冲溶液为0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液，缓冲溶液的pH值为5–9；所述酶为脂肪酶或磷脂酶；

所述反应温度为25–50℃；所述反应时间为8–24h；所述搅拌或震荡的转速为200r/min；

(2)将步骤(1)所得上层油相进行分子蒸馏，收集所得重相和轻相；

(3)取一定量的尿素、乙醇以及步骤(2)分子蒸馏所得轻相，在均匀搅拌下，于65℃加热回流1h，然后冷却至室温；将混合物在低温条件下静置一段时间；然后进行过滤，收集滤液，真空旋转蒸发得到浅黄色固状物，用石油醚萃取固状物数次，得到富集了游离EPA和DHA的混合脂肪酸；

(4)将一定量步骤(3)得到的富集了游离EPA和DHA的混合脂肪酸、无水乙醇和脂肪酶加入到反应容器中；在搅拌、惰性气体保护以及40℃的条件下反应12h；反应后旋蒸，过滤，得到富含EPA和DHA的乙酯；

(5)将一定量的步骤(2)所得重相、步骤(4)所得富含EPA和DHA的脂肪酸乙酯、以及脂肪酶加入到反应容器中，并充入惰性气体保护，在搅拌、60℃和抽真空的条件下反应6h，反应结束后，过滤；再通过分子蒸馏分离产物，收集所得重相，即为富集了EPA和DHA的甘油三酯型鱼油。

2.根据权利要求1所述的一种利用酶催化制备富含EPA和DHA甘油酯的方法，其特征在于，步骤(2)所述分子蒸馏的具体步骤为：将步骤(1)所得上层油相加入到二级分子蒸馏装置的进料罐中；通过第一级分子蒸馏，在90℃下对油相进行脱水、脱气；设定第二级分子蒸馏真空度0.1Pa、刮膜转速300r/min、进料量流速1.0mL/min，在140–190℃下分离油相，收集所得重相和轻相。

3.根据权利要求1所述的一种利用酶催化制备富含EPA和DHA甘油酯的方法，其特征在于，步骤(3)所述尿素和乙醇的质量比为1:6–1:2；尿素与轻相质量比为1:1–3:1。

4.根据权利要求1所述的一种利用酶催化制备富含EPA和DHA甘油酯的方法，其特征在于，步骤(3)所述低温条件为-15–15℃；所述在低温下的静置时间为0.5–3h。

5.根据权利要求1所述的一种利用酶催化制备富含EPA和DHA甘油酯的方法，其特征在于，步骤(4)所述富集了游离EPA和DHA的混合脂肪酸与无水乙醇的质量比为1:1–4:1；所述脂肪酶为诺维信435固定化脂肪酶或诺维信固定化脂肪酶TL IM，脂肪酶的添加量为富集了游离EPA和DHA的混合脂肪酸质量的3％。

6.根据权利要求1所述的一种利用酶催化制备富含EPA和DHA甘油酯的方法，其特征在于，步骤(5)所述甘油酯和富含EPA和DHA的脂肪酸乙酯的质量比为1:7.2，所述脂肪酶为诺维信435固定化脂肪酶或诺维信固定化脂肪酶TL IM，脂肪酶的添加量为甘油酯和富含EPA和DHA的脂肪酸乙酯总质量的2％。

7.根据权利要求1所述的一种利用酶催化制备富含EPA和DHA甘油酯的方法，其特征在于，步骤(5)所述分子蒸馏的具体步骤为：将产物加入到二级分子蒸馏装置的进料罐中；通过第一级分子蒸馏，在90℃下对油相进行脱水、脱气；设定第二级分子蒸馏真空度0.1Pa、刮膜转速300r/min、进料量流速1.0mL/min，在140–190℃下分离油相，收集所得重相和轻相。

说明书

一种利用酶催化制备富含EPA和DHA甘油酯的方法

技术领域

[0001] 本发明属于油脂深加工、改性技术领域，具体涉及一种利用酶催化制备富含EPA和DHA甘油酯的方法。

背景技术

[0002] 二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)属于多不饱和脂肪酸，是海产动植物的特征性脂肪酸。作为人体不能自身合成的必需脂肪酸，它们具有预防及治疗动脉粥样硬化、冠心病、癌症、哮喘、脂肪肝、阿尔茨海默症等多种疾病、促进婴幼儿中枢神经系统与感官器官的正常发育等保健功能。目前市场上的鱼油甘油酯中的EPA和DHA的含量普遍偏低，仅能分别达到18％和12％左右，已不能满足人们的保健及药用需求。因此，提高EPA和DHA在甘油酯中的含量，可以提高鱼油保健功效，具有重大的经济意义。

[0003] 为提高EPA和DHA的含量，传统上多采用化学法从鱼油制备含有脂肪酸的乙醇酯，然后利用尿素包埋以及分子蒸馏，获得富含EPA和DHA的乙酯型鱼油产品。但已有研究指出乙酯型鱼油在人体中的消化和吸收均较为困难，且可能有安全隐患。此外，在化学法制备过程中，往往需要用到较为极端的反应条件(通常是高温、高压、不适当的pH值)。在这些条件下，往往会造成一系列副反应发生，如双键的氧化、移位、移位，以及全顺式构型异构化等，导致产品质量差。此外由于依赖色谱法进行产物分离提纯，会有能耗大、操作成本高等缺点，因而难以满足工业化大规模生产要求。

[0004] 相较传统化学法而言，酶催化能够选择性地水解和改变在甘油骨架上的脂肪酸分布，并能克服传统化学方法的缺陷，具有绿色、安全、经济、反应专一、副产物少等优点。因此近来人们开始研究利用脂肪酶制备富含EPA和DHA的甘油酯型鱼油。目前已有的酶法制备甘油酯型鱼油的手段主要包括酯合成、酯交换、水解三种，各有优缺点。酯合成法采用甘油和游离脂肪酸为底物，游离脂肪酸需事先制备，造成了生产成本高，加之脂肪酸不易与甘油混合，甘油三酯产品得率往往偏低。酯交换法有醇解、酸解和酯-酯交换法三种，需分别使用醇、游离脂肪酸和酯(通常是甲、乙酯型鱼油)作为原料，有成本较高、工艺复杂等问题。相较而言，水解法直接使用鱼油和水做原料，成本低廉，绿色安全，但其对酶的作用点有选择性要求。此外，且水解反应常将要保留的EPA和DHA也部分水解下来，故还需要严格控制水解程度。

[0005] 鱼油产品的分离提纯通常采用分子蒸馏的方法。分子蒸馏是在高真空下进行液–液分离的高效分离技术，具有蒸馏温度和压强低、各组分受热时间短等优点，故能避免天然物质在蒸馏过程中分解，非常适用于分离提纯易氧化变性、高温变性、高沸点的鱼油。

[0006] 脂肪酸的分离，通常采用尿素包合法。该法工艺简单，易于操作，形成的包合物非常稳定，且和结晶法相比，其产品的过滤分离不需在很低的温度下进行，具有生产成本低、适于大规模生产等优点，是简单而有效的富集EPA和DHA的方法。

[0007] 中国发明专利申请公开号CN1478875公开了一种公开了采用AgNO3水法对鱼油的乙酯化产品进行分离提纯而获得高含量的DHA、EPA方法。该法利用银离子(Ag+)与不饱和双键形成络合物的特性，使乙酯化鱼油中含不饱和双键的DHA和EPA与之生成络合物并分离出来。然而使用银离子作为络合剂，不仅成本高昂，而且银离子对生物体具有毒害作用，不宜用于食品工业。

[0008] 中国发明专利申请公开号CN101348807公开了一种从鱼油中富集n-3多不饱和脂肪酸甘油酯的方法。该发明用化学水解法水解鱼油,并通过分离纯化获得高纯度EPA及DHA，再以甘油和纯化的EPA或DHA为原料，利用脂肪酶在有机相中分别催化合成EPA甘油酯或DHA甘油酯产品。该发明虽然效果较好，然而使用化学法水解，易发生副反应而导致EPA和DHA损失。

[0009] 中国发明专利申请公开号CN103509651A公开了一种从鱼油精炼副产物中提取富集乙酯型鱼油的方法。该法以鱼油精炼副产物的皂脚和固脂为原料，以浓盐酸催化乙酯工艺回收皂脚、碱催化乙酯工艺回收固脂，再经两次三级分子蒸馏和一次尿素包合工艺，富集得到高含量的EPA和DHA乙酯型鱼油。该法以浓盐酸作为催化剂，对反应器皿有防腐蚀的要求，且易发生副反应导致EPA和DHA损失。该法需要两次三级分子蒸馏工艺提纯，工艺繁琐，大大增加了成本，且乙酯型鱼油有潜在的安全隐患。

[0010] 石红旗等在《中国海洋药物》2001年第82期发表了《脂肪酶催化水解法浓缩鱼油DHA甘油酯的研究》。该文采用国产假丝酵母脂肪酶在乳化剂的辅助下对鱼油进行选择性水解，制得了富含EPA和DHA的产品，两者总含量为47.9％。然而该法需要额外添加乳化剂辅助水解。且该法水解所得游离脂肪酸副产物中仍然含有一定量的游离EPA和DHA，但文中并未提及对其回收利用，这就造成了副产物的浪费。

[0011] 杨博等在《中国油脂》2005年30卷8期、潘志杰等在《农业机械》2012年分别发表了题目均为《脂肪酶催化鱼油醇解富集EPA和DHA的研究》的文章。两文均采用脂肪酶对鱼油进行部分醇解，将其他脂肪酸通过醇解移除，从而在甘油骨架上实现EPA和DHA的富集。宋诗军在其硕士论文《酶法合成EPA、DHA甘油三酯的研究》中同样以脂肪酶实现鱼油的部分醇解，制得富集了EPA和DHA的混合甘油酯，并进一步利用偏甘油脂肪酶选择性水解混合甘油酯中的甘油二酯，从而实现混合甘油酯的纯化。邵佩霞在其硕士论文《富含多不饱和脂肪酸甘油酯的酶法制备》中通过乙醇对鱼油进行近乎完全的醇解，并对乙酯化的鱼油进行分子蒸馏以富集EPA和DHA的乙酯，然后再将EPA和DHA的乙酯与甘油进行酯交换反应从而得到富含EPA和DHA的混合甘油酯。然而所有这些方法均属于醇解法。与水解法相比，使用乙醇比使用水的成本显然更高，且乙醇属于易燃易挥发溶剂，对生产安全不利。此外，醇解鱼油所得脂肪酸乙酯副产物中仍然含有一定量以乙酯形式存在的EPA和DHA，但所有这些文献中均未提及对其回收利用，造成了副产物的浪费。

发明内容

[0012] 为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种利用酶催化制备富含EPA和DHA甘油酯的方法。

[0013] 本发明目的通过以下技术方案实现：

[0014] 一种利用酶催化制备富含EPA和DHA甘油酯的方法，包括以下步骤：

[0015] (1)将一定量的鱼油、缓冲溶液和酶加入反应容器中，充入惰性气体保护鱼油不被氧化；在搅拌或震荡下加热反应一段时间；反应结束，将所得混合物离心后分液。上层为油相，即为富含EPA和DHA的甘油酯以及游离脂肪酸的混合物。下层为水相，其中含有酶或固定化酶，可供本步骤重复利用。

[0016] (2)将步骤(1)所得上层油相进行分子蒸馏，收集所得重相和轻相。重相主要是富含EPA和DHA的混合甘油酯，轻相主要是以饱和脂肪酸为主的游离脂肪酸。

[0017] (3)取一定量的尿素、乙醇以及步骤(2)分子蒸馏所得轻相(脂肪酸)，在均匀搅拌下，于65℃加热回流1h，然后冷却至室温；将混合物在低温条件下静置一段时间，使尿素分子充分包裹脂肪酸分子；然后进行过滤，收集滤液，通过真空旋转蒸发除去乙醇得到浅黄色固状物，用石油醚萃取固状物数次；收集石油醚溶液蒸发除去溶剂，得到富集了游离EPA和DHA的混合脂肪酸。

[0018] (4)将一定量步骤(3)得到的富集了游离EPA和DHA的混合脂肪酸、无水乙醇和脂肪酶加入到反应容器中；在搅拌、惰性气体保护以及40℃的条件下反应12h；反应后通过旋转蒸发仪除去乙醇和水，再过滤掉脂肪酶，得到富含EPA和DHA的乙酯，过滤所得酶可为本步骤重复使用。

[0019] (5)将一定量的步骤(2)所得甘油酯(即重相)、步骤(4)所得富含EPA和DHA的脂肪酸乙酯、以及脂肪酶加入到反应容器中，并充入惰性气体保护，在搅拌、60℃和抽真空的条件下反应6h，反应结束后，过滤收集脂肪酶，该酶可为本步骤重复使用；再通过分子蒸馏分离产物，收集所得重相，即为富集了EPA和DHA的甘油三酯型鱼油。

[0020] 其中：

[0021] 步骤(1)所述缓冲液和鱼油的体积质量比为0.5:1–3:1(g/mL)，优选1:1–1.5:1(g/mL)；酶的添加量为鱼油质量的0.1–0.5‰，优选0.2‰。

[0022] 步骤(1)所述鱼油为富含EPA和DHA的鱼油，优选海鱼鱼油；所述缓冲溶液为0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液，溶液的pH值为5–9，优选pH为6的磷酸钾缓冲溶液；所述酶为脂肪酶或磷脂酶。

[0023] 所述的酶选自：丹麦诺维信公司的435固定化脂肪酶(Lipozyme 435)、固定化脂肪酶RM IM(Lipozyme RM IM)、固定化脂肪酶TL IM(Lipozyme TL IM)、磷脂酶，广州纽克利生物科技有限公司的脂肪酶系列产品CALB、RML，日本天野生物酶制剂有限公司(Amano Enzyme)的脂肪酶系列产品Lipase AY“Amano”400SD、脂肪酶MER、Lipase AY“Amano”30SD-K、Lipase DF“Amano”15、Lipase A“Amano”12-K；优选为日本天野生物酶制剂有限公司的Lipase AY“Amano”400SD。

[0024] 步骤(1)所述反应温度为25–50℃，优选35℃；所述反应时间为8–24h，优选10h；所述搅拌或震荡的转速为200r/min。

[0025] 步骤(2)所述分子蒸馏的具体步骤为：将步骤(1)所得上层油相加入到二级分子蒸馏装置的进料罐中；通过第一级分子蒸馏，在90℃下对油相进行脱水、脱气；设定第二级分子蒸馏真空度0.1Pa、刮膜转速300r/min、进料量流速1.0mL/min，在一定温度下分离油相，收集所得重相和轻相；所述第二级分子蒸馏的温度为140–190℃，优选150–160℃。

[0026] 步骤(3)所述用于包裹脂肪酸的尿素和乙醇的质量比为1:6–1:2，优选1:3；尿素与轻相(游离脂肪酸)质量比为1:1–3:1，优选2.5:1。

[0027] 步骤(3)所述低温条件为-15–15℃，优选5℃；所述在低温下的静置时间为0.5–3h，优选1.5h。

[0028] 步骤(4)所述富集了游离EPA和DHA的混合脂肪酸与无水乙醇的质量比为1:1–4:1，优选10:3(约3.3:1)，所述脂肪酶为诺维信435固定化脂肪酶(Lipozyme 435)或诺维信固定化脂肪酶TL IM(Lipozyme TL IM)，脂肪酶的添加量为富集了游离EPA和DHA的混合脂肪酸质量的3％。

[0029] 步骤(5)所述甘油酯和富含EPA和DHA的脂肪酸乙酯的质量比为1:7.2，即甘油酯游离羟基与乙酯的摩尔比为1:1，，所述脂肪酶为诺维信435固定化脂肪酶(Lipozyme 435)或诺维信固定化脂肪酶TL IM(Lipozyme TL IM)，脂肪酶的添加量为甘油酯和富含EPA和DHA的脂肪酸乙酯总质量的2％。

[0030] 步骤(5)所述分子蒸馏的具体步骤为：将产物加入到二级分子蒸馏装置的进料罐中；通过第一级分子蒸馏，在90℃下对油相进行脱水、脱气；设定第二级分子蒸馏真空度0.1Pa、刮膜转速300r/min、进料量流速1.0mL/min，在一定温度下分离油相，收集所得重相和轻相；第二级分子蒸馏的温度为140–190℃，优选150–160℃。

[0031] 与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

[0032] (1)本发明的关键在于利用了脂肪酶催化水解的选择性达到在甘油酯上富集EPA和DHA，即由于二者的空间位阻较大，不易被酶从甘油骨架上水解下来，并且通过严格控制反应程度，最大程度地将EPA和DHA保留在甘油酯分子上。

[0033] (2)本发明中以酶催化水解富集EPA和DHA，与醇解和酯交换等其他可用于富集EPA和DHA的酶反应相比，是以水作为反应物，具有廉价安全的优点。此外，水解法有利于保留酶的活性和回收利用。

[0034] (3)本发明中的水解、酯化、酯交换反应均采用酶作为催化剂，与传统化学反应方式相比，具有绿色、环保、条件温和、反应选择性高、副产物少等优点，并避免了EPA和DHA在反应过程中因氧化等副反应损失，且不需要使用防腐蚀的反应装置，有利于节省生产设备的投入。

[0035] (4)本发明为提高原料中EPA和DHA的利用率，在生产流程中增加了对两者的回收利用步骤。即利用尿素包合法提取水解反应所得游离脂肪酸副产物中的少量EPA和DHA，并通过乙酯化和酯交换对两者进行回收利用，具有反应效率高的优点，同时还提高了甘油酯中的甘油三酯含量以及EPA和DHA的含量。

附图说明

[0036] 图1是本发明中利用1,3位选择性脂肪酶催化鱼油选择性水解富集EPA和DHA的反应原理示意图。

[0037] 图2为本发明所述制备富集EPA和DHA的甘油三酯的工艺流程图。

[0038] 图3是本发明所述鱼油经水解和分子蒸馏后所得重相(混合甘油酯中间产品)的甘油酯组成分析气相色谱图。

[0039] 图4是本发明所述鱼油经水解和分子蒸馏后所得重相(混合甘油酯中间产品)的脂肪酸组成分析气相色谱图。

[0040] 图5是本发明所述鱼油水解并经分子蒸馏后所得轻相(游离脂肪酸副产品)的脂肪酸组成分析气相色谱图。

[0041] 图6是本发明所述甘油三酯型鱼油终产品的甘油酯组成分析气相色谱图。

[0042] 图7是本发明所述甘油三酯型鱼油终产品的脂肪酸组成分析气相色谱图。

具体实施方式

[0043] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0044] 实施例1

[0045] 一种利用酶催化制备富含EPA和DHA甘油酯的方法，工艺流程如图2所示，包括以下步骤：

[0046] (1)将30.0g挪亚圣诺生物有限公司的精制鱼油、30.0mL磷酸钾缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝6)和6.0mg日本天野酶制剂有限公司的Lipase AY“Amano”400SD加入到100mL的锥形瓶中，并向烧瓶中充入氮气以排除空气，封口。将锥形瓶放入摇床中，设定震荡速率为200r/min，摇床温度为35℃，维持反应10h。反应结束，将所得混合物离心分液。所得上层油相为富含EPA和DHA的甘油酯以及游离脂肪酸的混合物，下层为含有脂肪酶的水相。

[0047] (2)共积累200g前述步骤(1)所得上层油相，将其加入到二级分子蒸馏装置的进料罐中。通过第一级分子蒸馏，在90℃下对油相进行脱水、脱气；设定第二级分子蒸馏真空度0.1Pa、刮膜转速300r/min、进料量流速1.0mL/min，在150℃下分离油相，收集蒸馏所得重相和轻相。重相为富含EPA和DHA的混合甘油酯，质量为112g，对应产率为56.0％；重相中含有
70.7％甘油三酯，28.3％甘油二酯，0.85％甘油单酯，0.41％游离脂肪酸(图3)；重相所含脂肪酸中，EPA占25.3％，DHA占21.1％(图4)。分子蒸馏所得轻相主要是以饱和脂肪酸为主的游离脂肪酸，质量为79.2g，对应产率为39.6％，其中EPA含量为11.4％，DHA含量为2.01％(图5)。

[0048] (3)取125g尿素、375g体积浓度为95％的乙醇，以及50g分子蒸馏所得轻相(游离脂肪酸)，加入到1L圆底烧瓶中，在均匀搅拌下，于65℃加热回流1h，然后冷却至室温。将混合物在5℃下静置1.5h，使尿素分子充分包裹脂肪酸分子。然后进行过滤并收集滤液。用旋转蒸发仪除去滤液中的乙醇，得到浅黄色固状物。用50.0mL石油醚萃取固状物，重复萃取步骤3次，收集所得石油醚溶液。用旋转蒸发仪除去石油醚，即得到富集了EPA和DHA的混合脂肪酸，质量为8.3g，收率为16.6％，其中含有48.7％EPA和11.8％DHA。

[0049] (4)多次重复前述步骤(1)～(3)，收集所得混合脂肪酸。取25.0g该混合脂肪酸，7.5g无水乙醇，和0.75g丹麦诺维信公司的Lipozyme 435固定化脂肪酶加入到反应容器中。
在磁力搅拌、充氮气保护和40℃的条件下反应12h。反应后通过旋转蒸发仪除去乙醇和反应生成的水，再过滤掉Lipozyme435固定化脂肪酶，过滤所得酶可为本步骤重复使用。得到富含EPA和DHA的乙酯，其中的EPA乙酯含量为47.8％，DHA乙酯含量为11.4％。

[0050] (5)将144g从步骤(2)累积所得的富含EPA和DHA的混合甘油酯、20g步骤(4)所得富含EPA和DHA的脂肪酸乙酯，以及1.64g丹麦诺维信公司的Lipozyme 435固定化脂肪酶到反应容器中，并充入氮气保护。在磁力搅拌、60℃和抽真空的条件下反应6h。反应结束后，过滤收集脂肪酶。该酶可为本步骤重复使用。通过如步骤(2)所述的分子蒸馏条件分离产物，收集所得重相，即为富集了EPA和DHA的甘油三酯型鱼油产品，质量为145g，产率为88.4％；其中的甘油三酯含量为97.6％，甘油二酯含量为2.43％(图6)；甘油酯产品的脂肪酸组成中，EPA占25.6％，DHA占17.4％(图7)。

[0051] 即经过上述工艺流程后，鱼油脂肪酸组成中的EPA和DHA含量，从原料中的18％和12％分别提高到产品中的25.6％和17.4％，两者之和从30％提高到43％。

[0052] 甘油酯组成的检测：将30.0mg样品溶于2.0mL正己烷中，通过0.45μm的滤膜对溶液过滤。检测条件为：采用安捷伦气相色谱仪，使用DB-1ht毛细管柱(15m×0.25mm i.d.,0.1μm)，氮气作为载气，恒定柱压23.12psi，分流比20:1，进样量为1μm。进样口和检测口温度为380℃，空气和氢气流速分别为300mL/min和30mL/min，尾吹氮气流速为22.41mL/min。柱箱升温程序：初温100℃，在该温度下保持1min，然后以50℃/min速率升至160℃；第二阶段以5℃/min的速率升至190℃，保持2min，第三阶段以50℃/min的速率升至320℃；保持2min，第四阶段先以50℃/min升至380℃，保持5min。步骤(5)制得的富集了EPA和DHA的甘油三酯型鱼油产品和步骤(2)得到的混合甘油酯都是用此方法测。

[0053] 脂肪酸组成的检测：首先依照国家标准GB/T 17376-2008(动植物油脂脂肪酸甲酯制备)所规定的方法对样品进行甲酯化，然后依照GB/T 17377-2008(动植物油脂脂肪酸甲脂的气相色谱分析)中的方法检测甲酯化样品中脂肪酸的组成。

[0054] 实施例2

[0055] 本实施实例除以下技术特征外同实施例1：

[0056] 步骤(1)中所用缓冲溶液为0.1mol/L的磷酸钾溶液(pH 7)，所用缓冲溶液体积为45mL；酶添加量为15mg；反应温度为50℃，反应时间为8h。

[0057] 步骤(2)中所用第二级分子蒸馏的温度为140℃。分子蒸馏后，所得重相质量为106.6g，对应产率为53.3％；重相中含有69.0％甘油三酯，30.0％甘油二酯，0.80％甘油单酯，0.21％游离脂肪酸；重相所含脂肪酸中，EPA占25.0％，DHA占20.2％。分子蒸馏所得轻相主要是以饱和脂肪酸为主的游离脂肪酸，质量为81.2g，对应产率为40.6％，其中EPA含量为
12.4％，DHA含量为1.95％。

[0058] 步骤(3)中所用95％乙醇(体积浓度为95％的乙醇)的质量为250g，轻相质量为125g(重复两次步骤(1)后积累可得)；静置温度为-15℃，静置时间为0.5h。所得富集EPA和DHA的混合脂肪酸质量为20.2g，收率为16.2％，其中含有50.2％EPA和10.6％DHA。

[0059] 步骤(4)中所用无水乙醇用量为25g，所用酶为诺维信固定化脂肪酶TL IM。反应后得到乙酯中的EPA乙酯含量为49.2％，DHA乙酯含量为10.1％。

[0060] 步骤(5)中所用酶为诺维信固定化脂肪酶TL IM。经分子蒸馏后得到甘油三酯型鱼油产品，质量为142g，产率为86.6％，其中的甘油三酯含量为96.4％，甘油二酯含量为2.79％；甘油酯的脂肪酸组成中，EPA占25.0％，DHA占17.1％。

[0061] 实施例3

[0062] 本实施实例除以下技术特征外同实施例1：

[0063] 步骤(1)中所用缓冲溶液为0.1mol/L的磷酸钾溶液(pH 6.5)，所用缓冲溶液体积为90mL；酶添加量为3.0mg；反应温度为25℃，反应时间为24h。

[0064] 步骤(2)中所用第二级分子蒸馏的温度为160℃。分子蒸馏后，所得重相质量为100.1g，对应产率为50.1％；重相中含有64.5％甘油三酯，34.0％甘油二酯，1.20％甘油单酯，0.24％游离脂肪酸；重相所含脂肪酸中，EPA占23.2％，DHA占20.1％。分子蒸馏所得轻相主要是以饱和脂肪酸为主的游离脂肪酸，质量为85.2g，其中EPA含量为13.3％，DHA含量为
2.53％。

[0065] 步骤(3)中所用95％乙醇(体积浓度为95％的乙醇)的质量为750g，轻相质量为31.25g；静置温度为15℃，静置时间为3h。所得富集EPA和DHA的混合脂肪酸质量为4.06g，收率为14.7％，其中含有46.1％EPA和10.1％DHA。

[0066] 步骤(4)中所用无水乙醇用量为6.25g。反应后得到乙酯中的EPA乙酯含量为46.0％，DHA乙酯含量为10.0％。

[0067] 步骤(5)中所用酶为诺维信固定化脂肪酶TL IM。经分子蒸馏后得到甘油三酯型鱼油产品，质量为139g，产率为84.7％，其中的甘油三酯含量为93.1％，甘油二酯含量为5.81％；甘油酯的脂肪酸组成中，EPA占23.9％，DHA占16.9％。

[0068] 实施例4

[0069] 本实施实例除以下技术特征外同实施例1：

[0070] 步骤(1)中所用缓冲溶液为0.1mol/L的磷酸钾溶液(pH 9)，所用缓冲溶液体积为15mL；酶添加量为9.0mg；反应温度为30℃，反应时间为20h。

[0071] 步骤(2)中所用第二级分子蒸馏的温度为190℃。分子蒸馏后，所得重相质量为99.5g，对应产率为49.8％；重相中含有60.0％甘油三酯，35.1％甘油二酯，3.50％甘油单酯，2.42％游离脂肪酸；重相所含脂肪酸中，EPA占22.3％，DHA占18.2％。分子蒸馏所得轻相主要是以饱和脂肪酸为主的游离脂肪酸，质量为79.5g，对应产率为39.8％，其中EPA含量为
13.0％，DHA含量为2.17％。

[0072] 步骤(3)中所用95％乙醇(体积浓度为95％的乙醇)的质量为500g，轻相质量为62.5g；静置温度为0℃，静置时间为2h。所得富集EPA和DHA的混合脂肪酸质量为7.9g，收率为12.6％，其中含有40.2％EPA和10.3％DHA。

[0073] 步骤(4)中所用无水乙醇用量为12.5g，所用酶为诺维信435固定化脂肪酶。反应后得到乙酯中的EPA乙酯含量为49.2％，DHA乙酯含量为10.1％。

[0074] 步骤(5)中所用酶为诺维信435固定化脂肪酶。经分子蒸馏后得到甘油三酯型鱼油产品，质量为134g，产率为81.7％，其中的甘油三酯含量为90.2％，甘油二酯含量为7.10％；甘油酯的脂肪酸组成中，EPA占25.0％，DHA占16.5％。

[0075] 实施例5

[0076] 本实施实例除以步骤(1)中所用缓冲溶液为0.1mol/L的磷酸钾溶液(pH 5)，步骤(1)所用酶来自于实例1中所回收的脂肪酶，步骤(4)和步骤(5)所用酶分别为实例1中对应步骤所回收的诺维信435固定化脂肪酶，其他技术特征外同实施例1。最后得到产品的甘油三酯含量为89.7％，甘油二酯含量为8.10％；甘油酯的脂肪酸组成中，EPA占25.2％，DHA占17.3％。

[0077] 实施例6

[0078] 本实施实例除以步骤(1)中所用缓冲溶液为0.1mol/L磷酸钠溶液(pH 6)，步骤(1)中所用酶为诺维信磷脂酶，其他技术特征外同实施例1。最后得到产品的甘油三酯含量为84.2％，甘油二酯含量为10.3％；甘油酯的脂肪酸组成中，EPA占23.4％，DHA占16.8％。

[0079] 实施例7

[0080] 本实施实例除以步骤(1)中所用酶为广州纽克利生物科技有限公司的脂肪酶CALB，其他技术特征外同实施例1。最后得到产品的甘油三酯含量为86.8％，甘油二酯含量为11.8％；甘油酯的脂肪酸组成中，EPA占22.6％，DHA占15.8％。

[0081] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。