肝豆状核变性ATP7B多位点突变检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种肝豆状核变性ATP7B多位点突变检测试剂盒，该试剂盒包括分别针对ATP7B的三个突变位点p.R778L,p.P992L和p.V1106I进行非标记探针HRM检测用的引物对及探针，以及标准品。本发明所述试剂盒操作简单，可快速、灵敏、准确的检测待测血液样品中ATP7B基因中p.R778L,p.P992L和p.V1106I三个位点的突变情况。

权利要求

1.一种肝豆状核变性ATP7B多位点突变检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括分别针对ATP7B的三个突变位点p.R778L,p.P992L和p.V1106I进行非标记探针HRM检测用的引物对及探针，以及标准品；其中，序列表中序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：2所示的引物对和序列SEQ ID NO：3所示的探针用于检测突变位点p.R778L；序列SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：5所示的引物对和序列SEQ ID NO：6所示的探针用于检测突变位点p.P992L；序列SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：8所示的引物对和序列SEQ ID NO：9所示的探针用于检测突变位点p.V1106I。

2.根据权利要求1所述的一种肝豆状核变性ATP7B多位点突变检测试剂盒，其特征在于，所述探针的3’端为氨基修饰。

3.根据权利要求1所述的一种肝豆状核变性ATP7B多位点突变检测试剂盒，其特征在于，所述标准品为分别包含三个突变位点p.R778L,p.P992L和p.V1106I的野生型基因序列的质粒载体和分别包含所述三个突变位点的突变型基因序列的质粒载体。

4.根据权利要求3所述的一种肝豆状核变性ATP7B多位点突变检测试剂盒，其特征在于，所述三个突变位点p.R778L,p.P992L和p.V1106I的野生型基因序列分别为序列表中所示的SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；所述三个突变位点的突变型基因序列分别为序列表中所示的SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15。

5.根据权利要求1-4任一所述的一种肝豆状核变性ATP7B多位点突变检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括完成HRM检测所需的试剂和酶。

说明书

肝豆状核变性ATP7B多位点突变检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种检测肝豆状核变性(Wilson病)ATP7B热点突变位点的新方法，即应用非标记探针高分辨溶解曲线(HRM)技术检测ATP7B多位点突变，属于医学检验检测领域。

背景技术

[0002] Wilson病(WD)是一种单基因常染色体隐性遗传性铜代谢障碍疾病，世界范围发病率约为1/10,000-30,000，其中中国是高发区。该病是由于ATP7B基因突变导致铜转运P型ATP酶缺失，从而引起血浆铜蓝蛋白降低及铜在体内器官的沉积等一系列临床表现。WD是目前少数可治疗的遗传性疾病，患者如果能在发病早期或症状前期即被确诊并得到及时治疗，大多预后良好，反之病情逐渐加重甚至危及生命。因此，早期诊断及时治疗是改善本病预后的关键。由于本病的遗传特性，早期进行基因诊断对于该病的及早治疗起着决定性的作用。

[0003] 目前，国内外已报道的检测WD突变的方法有：直接测序法，聚合酶链反应限制性片段长度多态性技术(PCR-SSCP)，聚合酶链反应限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)，高效液相色谱(DHPLC)技术等，这些技术有的操作步骤繁琐，检测周期长，灵敏度低，有的易于造成交叉污染，出现假阳性结果。HRM技术是今年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可迅速检测出核酸片段中的单碱基的突变。目前已有将HRM方法应用于肝豆状核变性ATP7B部分突变位点检测的报道，但分辨率和重复性还有待进一步探讨，因此，还难以应用于临床检测。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种肝豆状核变性ATP7B多位点突变检测试剂盒。该试剂盒操作简便，分辨率且重复性好，可以快速检测肝豆状核变性ATP7B多位点突变。

[0005] 本发明的另一个目的是提供该检测试剂盒的使用方法。

[0006] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

[0007] 本发明提供了一种肝豆状核变性ATP7B多位点突变检测试剂盒，该试剂盒包括分别针对ATP7B的三个突变位点p.R778L,p.P992L和p.V1106I进行非标记探针HRM检测用的引物对及探针，以及标准品。其中p.R778L位于ATP7B基因外显子8上，是中国人群突变频率最多的位点，在Wilson患者中高达25％左右，其次外显子13上的p.P992L突变频率占15％，也是热点突变位点之一。根据我们实验室对中国人群Wilson患者ATP7B基因基因突变谱的最新研究显示，除了上述两个已知的热点突变位点，外显子15上的p.V1106I的突变频率高达7.5％(以前有报道，非热点突变)，可能是一个新的热点突变位点(数据未发表)，因此p.R778L,p.P992L和p.V1106I三个位点的联合检测可覆盖近50％的患者。所述引物对及探针序列具体如表1所示：

[0008] 表1引物及探针序列

[0009]

[0010] 上表中所示的探针序列的3’端为氨基修饰(AmMo)。

[0011] 所述标准品为分别包含上述三个突变位点的野生型基因序列的质粒载体和分别包含上述三个突变位点的突变型基因序列的质粒载体。其中，三个突变位点的野生型基因序列分别为序列表中所示的SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；所述三个突变位点的突变型基因序列分别为序列表中所示的SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15。上述三个突变位点的野生型基因序列和突变型基因序列可以采用全基因合成方法获得，然后分别连接到质粒载体上，本发明对质粒载体不做限定，例如本领域常用的T载体。

[0012] 进一步地，本发明所述检测试剂盒还包括完成HRM检测所需的试剂和酶，例如使用商业化购买的试剂2×HRM master mix、25mM MgCl2和ddH2O，均购自Roche公司。

[0013] 本发明还提供了一种肝豆状核变性ATP7B多位点突变检测试剂盒的使用方法，该方法包括如下步骤：

[0014] (1)提取血液总DNA，可以使用DNA提取试剂盒(购自Qiagen公司)，也可以使用现有技术中已知的提取DNA的方法进行提取；

[0015] (2)进行HRM反应，其反应体系如表2所示；

[0016] 表2反应体系

[0017]名称 加样量μL
2×HRM master mix 10
MgCl2(25mM) 2
正义引物(1.25mM) 0.8
反义引物(2.5mM) 4
探针(10mM) 1
DNA/标准品 2
用ddH2O补足反应体积 20

[0018] 反应条件：95℃15min然后95℃for 15sec,60℃20sec，72℃30sec，共65个循环，并且以4.8℃/s的升温速度升高到95℃，以2.5℃/s的降温速度降低到46℃，以4.8℃/s的升温速度升高到72℃；然后72℃1min；然后以4.8℃/s的升温速度升温到95℃，然后以2.5℃/s的降温速度降低到55℃。溶解曲线通过在以4.8℃/s的升温速度从55℃升高到95℃的过程中，每摄氏度获取25次荧光信号获得。

[0019] (3)结果判定，对于不同位点的野生型和突变型以及杂合型，有不同的探针溶解曲线Tm值，见表3。

[0020] 表3不同基因型的探针Tm值

[0021]

[0022]

[0023] 本发明具有如下优点：本发明针对多个突变位点设计引物及非标记探针，p.R778L,p.P992L和p.V1106I三个位点的联合检测可覆盖近50％的患者。此外，非标记探针由于减少了结合的碱基数目，因此，放大了野生型和突变型的Tm值差异(ΔTm值为4℃以上)，从而弥补了单纯HRM方法分辨率和重复性不佳的缺点，而同时兼备了传统HRM方法速度快、操作简便，且对样品无污染等优点，使得本方法在应用于临床检测方面更具优势。

附图说明

[0024] 图1为用于检测ATP7B 778位点的标准品的非标记探针HRM结果图。

[0025] 图2为用于检测ATP7B 992位点的标准品的非标记探针HRM结果图。

[0026] 图3为用于检测ATP7B 1106位点的标准品的非标记探针HRM结果图。

[0027] 图4为检测临床样本ATP7B 778位点的非标记探针HRM结果图。

[0028] 图5为检测临床样本ATP7B 992位点的非标记探针HRM结果图。

[0029] 图6为检测临床样本ATP7B 1106位点的非标记探针HRM结果图。

具体实施方式

[0030] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0031] 实施例1检测ATP7B基因p.R778L,p.P992L和p.V1106I三个突变位点的引物和非标记探针的设计

[0032] 从GenBank获得ATP7B基因的序列，利用NCBI引物在线设计软件Primer-BLAST设计特异性扩增引物。所述引物扩增的产物必须包含各个拟检测的突变位点，并且突变位点应稍靠近扩增产物的5’端。探针为涵盖拟检测突变位点碱基的30个左右核苷酸的核酸序列，所述核酸序列的GC含量应尽量低于45％，并将序列的3’端进行氨基修饰，以避免延伸。按此原则，通过筛选、检验最终确定了可以有效检测ATP7B的p.R778L,p.P992L和p.V1106I三个突变位点的三组引物对和非标记探针，其序列如表1所示。所有引物和探针由梓熙生物技术公司合成。

[0033] 实施例2检测ATP7B基因p.R778L,p.P992L和p.V1106I三个突变位点的的非标记探针HRM检测试剂盒的组成

[0034] 检测试剂盒包括实施例1设计的分别针对ATP7B的三个突变位点p.R778L,p.P992L和p.V1106I进行非标记探针HRM检测用的引物对及探针，以及标准品。具体地，引物和探针如表1所示。所述标准品为分别包含上述三个突变位点的野生型基因序列的质粒载体和分别包含上述三个突变位点的突变型基因序列的质粒载体。其中，三个突变位点的野生型基因序列分别为序列表中所示的SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12；所述三个突变位点的突变型基因序列分别为序列表中所示的SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15。上述引物和探针分装，标准品也分装。

[0035] 所述检测试剂盒还包括还包括完成HRM反应所需的试剂和酶，例如使用商业化购买的试剂2×HRM master mix、25mM MgCl2和ddH2O，均购自Roche公司。

[0036] 实施例3非标记探针HRM检测ATP7B基因p.R778L,p.P992L和p.V1106I三个突变位点的重复性实验

[0037] 具体过程包括以下步骤：

[0038] 一、实验样品

[0039] 构建的标准品

[0040] 二、重复性检测试验

[0041] 1.组内重复性

[0042] 按照前述实验体系和实验步骤，在一次实验中重复进行三次检测，不同基因型的Tm值和ΔTm值见下表。

[0043] 2.组间重复性

[0044] 按照前述实验体系和实验步骤，连续进行五次检测，不同基因型的Tm值和ΔTm值见表4。

[0045] 表4非标记探针HRM检测的重复性

[0046]

[0047]

[0048] 实施例4临床样本检测

[0049] 按照前述实验体系和实验步骤，进行了临床样本的验证性实验，并与金标准测序结果进行了对比，结果见下表5：

[0050] 表5

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