一种香菇423-9菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用

摘要

本发明涉及一种香菇423‑9菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用，其序列如SEQ ID NO.1所示。获得方法包括：(1)基因组DNA的提取；(2)PCR扩增反应；(3)琼脂糖凝胶电泳检测。用于鉴别香菇423‑9菌株。本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的香菇菌株中具有423‑9菌株的专一性。

权利要求

1.一种香菇423-9菌株的特异性分子标记的获得方法，包括如下步骤：(1)提取香菇423-9菌株的基因组DNA，香菇423-9菌株的保藏号为CGMCC NO.11915；提取方法具体为：将香菇423-9菌株转接到马铃薯葡萄糖培养基中，25-26℃下避光摇瓶培养，

4-5d后收集菌丝装入无菌容器中，-70℃冷冻保存备用；用改进的CTAB法提取基因组DNA，-

20℃贮藏备用；

(2)进行PCR扩增反应；其中，引物序列为：

LEpyrF-F1150：CGCTTTATCTTTTATCTCGTGCTCAT；

LEpyrF-R1150：GAACGGTGTAGTAAGACAGGTAGTCA；

(3)琼脂糖凝胶电泳检测，得到长度为1067bp的条带，即为香菇423-9菌株的特异性分子标记，其序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种香菇423-9菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(2)中的PCR扩增反应的扩增体系为50μL，包含：TaKaRa ExTaq 0.5μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，模板DNA 1μL，引物各1μL，双蒸水37.5μL。

3.根据权利要求1所述的一种香菇423-9菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(2)中的PCR扩增反应的反应程序为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃75s；30～35个循环；72℃10min；4℃保藏。

4.根据权利要求1所述的一种香菇423-9菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(3)中琼脂糖凝胶电泳检测具体为：取PCR扩增产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，然后在凝胶成像仪上拍照。

5.根据权利要求1所述的方法获得的香菇423-9菌株的特异性分子标记在鉴别香菇

423-9菌株上的应用。

说明书

一种香菇423-9菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于菌株分子标记领域，特别涉及一种香菇423-9菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用。

背景技术

[0002] 香菇[Lentinula edodes(Berk.)Pegler]又名花菇、香蕈、冬菇、香菰，属于伞菌目口蘑科金钱菌族微香菇属。香菇是仅次于双孢蘑菇的世界第二大类食用菌。中国是香菇的发源地，有近千年的栽培历史。香菇因其营养价值和保健价值以及独特的风味成为深受大众喜爱的食药用菌，在民间素有“山珍之王”之称，是高蛋白、低脂肪的营养保健食品。

[0003] 香菇的栽培和生产的发展在很大程度上必须依赖菌种，它是香菇生产的前提和关键。而菌种的选育只有依靠长期的积累才能有所收获，但是由于香菇是无性繁殖，其菌种生产工艺具有可复制性，使得容易被仿冒，导致国内菌种同物异名、同名异物的现象普遍存在。这给菇农和生产厂家带来极大的损失，影响他们栽培和生产的积极性，对整个香菇产业的发展产生伤害。要想真正保护品种产权就必须先建立成熟的品种鉴定技术。另外，随着工厂化生产的推广，对栽培菌种的要求越来越高，需要更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证生产。

[0004] 针对目前对于香菇菌种存在的问题，急需加强菌株鉴定技术的研究，建立方便快捷有效的菌株鉴定体系。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种香菇423-9菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用，该方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的香菇菌株中具有423-9菌株的专一性。

[0006] 本发明的一种香菇423-9菌株(CGMCC NO.11915)的特异性分子标记，其序列如SEQ ID NO.1所示。

[0007] 具体如下：

[0008] TCGCTTTATCTTTTATCTCGTGCTCATTCCGTTTTCATTACTTGATAGGCATCCCATAAAATCCGCCATACGGTGCGCAATTGCGATTGCGAATAACGGCGATAACGACTGATCGACCTCCTCCACCATGTCTCCCGAACTTCTCGAGCAAACCTCCCAATCTTCGTTGAAGCAATACCAAATTGAGCTGATTGACAAAGCCATGTCATGTGGAGCACTGAAATTTGGTTCTTTCACTTTGAAATCTGGACGGTGAGTATCAATTCCATGATGGGGAAGCACAACCAAGATTGGATTTGATTAAGAATCGTCATGAGACGACTTTGGTCTGCTTCCTTTATCTTAAACTCATCGTTACCCCCCTATATCTTAGCATCTCTCCATACTTCCTCAACGCCGGTCTGCTCAGCACAGGTCCGATTCTTGCCGTTCTATCTGAAGCCTTCGCCGCTACCATCGTCGCTGCCCAACAACCCACATCCTCAGGAAATACCCCCATACCACCATTCGACGTCCTTTTCGGACCAGCATACAAAGGCATCGCGTTTGCTGCTACAACCGCAAAGAAATAAAAGCACACGGCGAAGGCGGGTCTCTCGTCGGATCCTCCGTATCTGGCAAAAAAGTTGTTATCCTGGACGACGTGATGACTGCAGGCACAGCAGTGCGAGAGGCGATCGATATCGTTAAAAAGGAAGGAGGTGAGGTTGTTGGTGTTATTCAGCTTTTGGATCGAGAAGAGGTTGGGCAAGATGGAGTAAGTAGCACAGTTGATGAGGTGGAAGGAATTATTGGGAAAGGCAGAGTTCGGTCGATTTTGAGGATGCGCGACCTCATTGCATGGTTAGAGAGCAAGGGAATGGGAAAGGAGTTGGAGGATATGAATGAGTATAGAAATAAGTATGGCTTAAAGATCTAATTCGAGTGATTTCCCAAAATGCCATGGTTCGTACATATGTACACATTTACAAAAGACTATAGTTGTTTCTGTATGCATCCACCAACCAACACAAATAATACATATCAACTTCATTTGAGTTTGACTACCTGTCTTACTACACCGTTCA。

[0009] 本发明的一种香菇423-9菌株的特异性分子标记的获得方法，包括：

[0010] (1)提取香菇423-9菌株的基因组DNA；

[0011] (2)进行PCR扩增反应；其中，引物序列为：

[0012] LEpyrF-F1150：CGCTTTATCTTTTATCTCGTGCTCAT；

[0013] LEpyrF-R1150：GAACGGTGTAGTAAGACAGGTAGTCA；(引物序列基于香菇423-9菌株的pyrF基因的突变位点而设计)

[0014] (3)琼脂糖凝胶电泳检测。

[0015] 所述步骤(1)中的香菇423-9菌株的基因组DNA的提取方法具体为：将香菇423-9菌株转接到马铃薯葡萄糖培养基中，25-26℃下避光摇瓶培养，4-5d后收集菌丝装入无菌容器中，-70℃冷冻保存备用；用改进的CTAB法提取基因组DNA，-20℃贮藏备用。

[0016] 所述改进的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法具体为：将液氮冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45～60min，间或轻摇混匀；12000rpm、4℃离心10min，取上清液；在上述上清液中加入体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；在上述离心管中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心
10min，取上清液移入新的离心管中；在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液)的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；将得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸钠洗涤2～3次，每次8000rpm，室温离心5min；加入预冷的
95vol％乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；加入
100μL10×TE(Tris/EDTA)缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；加入1μL10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。

[0017] 所述步骤(2)中的PCR扩增反应的扩增体系为50μL，包含：TaKaRa ExTaq 0.5μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，模板DNA 1μL，引物各1μL，双蒸水37.5μL。

[0018] 所述步骤(2)中的PCR扩增反应的反应程序为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃75s；30～35个循环；72℃10min；4℃保藏。

[0019] 所述步骤(3)中琼脂糖凝胶电泳检测具体为：取PCR扩增产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，然后在凝胶成像仪上拍照。

[0020] 本发明的一种香菇423-9菌株的特异性分子标记的应用，用于鉴别香菇423-9菌株。

[0021] 本发明原理：根据香菇423-9菌株的pyrF基因突变，分析突变序列的特异性和稳定性，建立以突变基因为分子标记的快速鉴别423-9菌株的分子生物学方法。采用特异性引物对香菇菌株进行PCR扩增，香菇423-9菌株扩增出的DNA片段长度为1067bp的条带，其它香菇菌株扩增出的DNA片段长度为1150bp。

[0022] 有益效果

[0023] (1)本发明方法简单，成本低，对香菇菌株pyrF基因进行PCR扩增，将得到的带型与423-9菌株的条带进行对照，与该条带一致即为423-9菌株；

[0024] (2)本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点；常规拮抗试验需要2周左右，出菇试验至少3个月的时间；本发明仅需4天，并且在收集的香菇菌株中具有423-9菌株的专一性，具有良好的应用前景。

附图说明

[0025] 图1为香菇不同菌株pyrF基因的PCR检测；其中，M：DL2000marker；1：L135；2：L808；3：庆科20；4：423-9；5：ddH2O。

具体实施方式

[0026] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0027] 实施例1

[0028] 1.材料：试验所使用的香菇菌株423-9(CGMCC NO.11915)由中国普通微生物菌株保藏管理中心保藏。香菇L135、L808、庆科20菌株由中国农业微生物保藏中心食用菌分中心保藏。

[0029] 2.PCR引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

[0030] 表1扩增pyrF基因的PCR引物

[0031]扩增的基因名称 引物名称 引物序列(5'-3')
pyrF LEpyrF-F1150 CGCTTTATCTTTTATCTCGTGCTCAT
  LEpyrF-R1150 GAACGGTGTAGTAAGACAGGTAGTCA

[0032] 3.培养基：马铃薯葡萄糖培养基(PD培养基)：马铃薯20g、葡萄糖20g，加水至1L，灭菌后使用。

[0033] 4.菌丝培养：将香菇菌株转接到马铃薯葡萄糖培养基中，25℃下避光摇瓶培养，4d后收集菌丝。

[0034] 5.用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取香菇菌株基因组DNA：

[0035] (1)将液氮冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液，于65℃保温45～60min，间或轻摇混匀；

[0036] (2)12000rpm、4℃离心10min，取上清液；

[0037] (3)在上述上清液中加入体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入离心管中；

[0038] (4)在上述离心管中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入新的离心管中；

[0039] (5)在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液)的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4℃离心10min，去上清；

[0040] (6)将得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸钠洗涤2～3次，每次8000rpm，室温离心5min；

[0041] (7)加入预冷的95vol％乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干；

[0042] (8)加入100μL10×TE(Tris/EDTA)缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；

[0043] (9)加入1μL10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；

[0044] (10)将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。

[0045] 6.PCR克隆相关基因：

[0046] PCR扩增体系为50μL，包含：TaKaRa ExTaq(5U/μL)0.5μL，10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)5μL，dNTP Mixture(2.5mmol/L)4μL，模板DNA(100ng/μL)1μL，引物各1μL(见表1)，双蒸水(ddH2O)37.5μL。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃75s；30～35个循环；72℃10min；4℃保藏。

[0047] 提取香菇菌株基因组DNA后对pyrF基因进行PCR扩增，PCR结果显示香菇菌株423-9扩增出的目的片段的长度与其他香菇菌株相比有83bp的缺失，即可确定该菌株为423-9菌株。如图1箭头标注所示。

[0048] 7.琼脂糖凝胶电泳检测具体为：

[0049] 取上述步骤中的PCR扩增产物5μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，然后在凝胶成像仪上拍照。