HQO作为监测活细胞中线粒体自噬过程荧光探针的应用

摘要

本发明公开了HQO作为监测活细胞中线粒体自噬过程荧光探针的应用。HQO的结构式如式Ⅰ所示，具体提供了在作为或制备具有下述1)‑3)中任一项功能的荧光探针中的应用，1)特异性标记活细胞中的线粒体自噬溶酶体；2)同时标记活细胞中线粒体和线粒体自噬溶酶体；3)监测活细胞中线粒体自噬过程。克服了现有技术中需要同时使用两种荧光染料分别染色线粒体和溶酶体来监测活细胞中线粒体自噬过程的缺陷。

权利要求

1.式Ⅰ所示化合物在作为或制备具有下述1)-3)中任一项功能的荧光探针中的应用，

1)特异性标记活细胞中的线粒体自噬溶酶体；

2)同时标记活细胞中线粒体和线粒体自噬溶酶体；

3)监测活细胞中线粒体自噬过程；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述活细胞为癌细胞。

3.式Ⅰ所示化合物的试剂盒在作为或制备具有下述1)-3)中任一项功能的荧光探针中的应用，

1)特异性标记活细胞中的线粒体自噬溶酶体；

2)同时标记活细胞中线粒体和线粒体自噬溶酶体；

3)监测活细胞中线粒体自噬过程；

所述试剂盒包括式Ⅰ所示化合物和溶剂；式Ⅰ所示化合物的浓度为0.01～100mM；所述溶剂为PBS缓冲液、细胞培养基或二甲基亚砜；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述活细胞为癌细胞。

说明书

HQO作为监测活细胞中线粒体自噬过程荧光探针的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及HQO作为监测活细胞中线粒体自噬过程荧光探针的应用。

背景技术

[0002] 线粒体是细胞内的发电站也是活性氧产生的主要部位，除了供给细胞能量之外也参与了很多其他的代谢过程，如钙离子的存储，通信及细胞分化，生长，凋亡和死亡。细胞内活性氧(ROS)量的增加会导致线粒体的氧化性损伤，同时，线粒体损伤的集聚又与细胞老化，癌症和神经变性疾病有关。因此，保持线粒体的健康数量对细胞存活是必不可少的。损伤的线粒体或者过量的线粒体会通过自我吞噬过程被有选择性的淘汰，以此保持线粒体的质量和数量。溶酶体是酸性的细胞器(pH 4.5-5.5)，负责废物的处理，它们能分解各种细胞废物，包括蛋白，核酸，糖类，脂类和细胞碎片。线粒体自噬是自我吞噬的一种，以此去除细胞内机能失调的线粒体并且依靠溶酶体方式进行成分循环。在线粒体自噬过程中，受损伤的线粒体被选择性的隔绝成自噬线粒体，然后自噬线粒体与附近的溶酶体融合，形成自噬溶酶体(包被线粒体的自吞噬泡)，在自噬溶酶体内线粒体的成分被分解。监测活细胞线粒体自噬发生过程的探针将为线粒体代谢提供深刻的见解，也将为筛选线粒体自噬抑制或者促进剂提供有力的工具。

[0003] 大部分监测自噬过程的方法都是通过抗体或者荧光蛋白标记技术检测蛋白标志物。虽然这些方法能在分子层面检测线粒体自噬过程，但很少有蛋白标志物能高特定性反映线粒体自噬过程。此外，基于抗体的检测很难在活细胞内实施。线粒体或者溶酶体小分子荧光探针一起被用于探测线粒体自噬，如lysoTracker Red(LTR)and MitoTracker Green(MTG)16。基于荧光小分子的监测方法简单，但是监测时需要同时使用两种荧光染料分别染色线粒体和溶酶体。且溶酶体参与细胞内的吞噬作用，细胞内吞作用和自噬过程，溶酶体探针可以染色所有溶酶体，而不只是染色线粒体的自噬溶酶体。目前，并没有同时用于检测线粒体和溶酶体的荧光探针，也没有可检测包被线粒体的自噬溶酶体的荧光探针。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供HQO作为监测线粒体自噬过程荧光探针的应用，HQO在559nm激光激发的条件下，可以特定的定位在生理学pH的线粒体。当损伤的线粒体和溶酶体融合的时候，由于新产生的自噬溶酶体的pH降低，使得HQO质子化，导致分子的激发波长红移，可以在635nm-710nm激光的激发下定位在自噬溶酶体。

[0005] 本发明提供的HQO(2,6-Bi(2-(3,3-dimethyl-1-propylindolin-2-ylidene)ethylidene)-cyclohexanone)在作为或制备具有下述1)-3)中任一项功能的荧光探针中的应用，

[0006] 1)特异性标记活细胞中的线粒体自噬溶酶体；

[0007] 2)同时标记活细胞中线粒体和线粒体自噬溶酶体；

[0008] 3)监测活细胞中线粒体自噬过程；

[0009] 其中，HQO的结构式如式Ⅰ所示：

[0010]

[0011] 上述的应用中，所述活细胞可为癌细胞，具体可为乳腺癌细胞MCF-7、肺癌细胞A549、宫颈癌细胞HeLa或结肠癌细胞LoVo。

[0012] 本发明进一步提供了式Ⅰ所示的HQO的试剂盒在作为或制备具有下述1)-3)中任一项功能的荧光探针中的应用，

[0013] 1)特异性标记活细胞中的线粒体自噬溶酶体；

[0014] 2)同时标记活细胞中线粒体和线粒体自噬溶酶体；

[0015] 3)监测活细胞中线粒体自噬过程；

[0016] 所述试剂盒包括式Ⅰ所示化合物和溶剂；式Ⅰ所示化合物的浓度可为0.01～100mM(如1mM)；所述溶剂可为PBS缓冲液、细胞培养基(如1640和/DMEM)或二甲基亚砜。

[0017] 上述的应用中，所述活细胞可为癌细胞，具体可为乳腺癌细胞MCF-7、肺癌细胞A549、宫颈癌细胞HeLa或结肠癌细胞LoVo。

[0018] 本发明具有如下有益效果：

[0019] 本发明克服了现有技术中需要同时使用两种荧光染料分别染色线粒体和溶酶体来监测活细胞中线粒体自噬过程的缺陷，采用式Ⅰ所示HQO可特异性的只染色源自损伤线粒体的自噬溶酶体，且可同时定位活细胞中线粒体和线粒体自噬溶酶体，从而应用于监测活细胞中线粒体自噬过程。

附图说明

[0020] 图1为采用IR780合成HQO的线路图。

[0021] 图2(a)为HQO在不同酸性环境中的吸收光谱谱图，图2(b)为对应的结构变化图。

[0022] 图3为HQO在DMSO中的核磁滴定氢谱。

[0023] 图4为用HQO、Mito Tracker Green和LysoBlue染色MCF-7细胞后在激光共聚焦显微镜下观察到的照片，其中，图4(a)为10μM Mito Tracker Green和100μM HQO染色MCF-7细胞分别在488nm,559nm和635nm下激发后的荧光照片；图4(b)为用10μM LysoBlue和100μM HQO染色MCF-7细胞分别在405nm,559nm和635nm下激发的荧光照片。

[0024] 图5为用HQO、Mito Tracker Green和LysoBlue染色A549细胞后在激光共聚焦显微镜下观察到的照片，其中，图5(a)为10μM Mito Tracker Green和100μM HQO染色A549细胞分别在488nm,559nm和635nm下激发后的荧光照片；图5(b)为用10μM LysoBlue和100μM HQO染色A549细胞分别在405nm,559nm和635nm下激发的荧光照片。

[0025] 图6为用HQO、Mito Tracker Green和LysoBlue染色LoVo细胞后在激光共聚焦显微镜下观察到的照片，其中，图6(a)为10μM Mito Tracker Green和100μM HQO染色LoVo细胞分别在488nm,559nm和635nm下激发的荧光照片；图6(b)为用10μM LysoBlue和100μM HQO染色LoVo细胞分别在405nm,559nm和635nm下激发的荧光照片。

[0026] 图7为用LysoBlue、Mito Tracker Green和HQO对MCF-7细胞三色染色后在激光共聚焦显微镜下观察到的照片，其中，图7(a)为10μM LysoBlue,Mito Tracker Green和HQO染色MCF-7细胞分别在405nm,488nm和559nm下激发的荧光照片；图7(b)为10μM LysoBlue,Mito Tracker Green和HQO染色MCF-7细胞分别在405nm,488nm和635nm下激发的荧光照片。

[0027] 图8为HQO与LysoBlue分别在无血清培养基及全培养基中与MCF-7细胞共同孵育不同时间的荧光照片。

[0028] 图9为HQO与莲心碱或雷帕霉素在全培养基中与MCF-7细胞共同孵育不同时间的荧光照片，由左向右依次为HQO、HQO和雷帕霉素、HQO和莲心碱、先与雷帕霉素孵育24h然后与HQO孵育、先与莲心碱孵育24h然后与HQO孵育。

[0029] 图10为HQO在无血清培养基1640中与HeLa细胞共同孵育不同时间的实时共聚焦成像照片。

[0030] 图11为HQO在无血清培养基DMEM中与MCF-7细胞共同孵育不同时间的实时共聚焦成像照片。

[0031] 图12为不同浓度的HQO处理24小时后的细胞存活率(MCF-7细胞)。

具体实施方式

[0032] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0033] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0034] 实施例1、荧光探针HQO监测线粒体自噬过程

[0035] 一、HQO的合成

[0036] 如图1所示，按照如下步骤合成HQO：

[0037] 在50mL圆底烧瓶中加入IR780 500mg(百灵威科技有限公司)与140mg醋酸钠及5mLDMF加热至80℃反应5小时，旋转蒸发仪旋干溶剂，然后使用高效液相色谱纯化产物(具体可参照文献“Kim,Y.M.；Choi,Y.D.；Weissleder,R.；Tung,C.H.,Membrane permeable esterase-activated fluorescent imaging probe.Bioorg Med Chem Lett 2007,17(18),5054-5057”中公开的方法进行纯化)。产率为70％。结构验证数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO):δ(ppm)7.88(d,J＝13.2Hz,2H),7.28(d,J＝7.2Hz,2H),7.14(d,J＝7.6Hz,
2H),6.86(m,4H),5.44(d,J＝13.2Hz,2H),3.69(t,J＝7.2Hz,4H),3.12(d,J＝5.2,1H),
2.47(d,J＝11.2,3H),1.66(m,2H),1.61(m,4H),1.52(s,12H),0.88(t,J＝7.6,6H)；13C NMR(75MHz,DMSO):δ(ppm)184.9,162.2,144.5,139.2,132.4,128.3,126.2,122.2,120.8,
107.8,92.6,46.4,43.5,28.7,25.8,19.7,11.8.ESI HRMS exact mass calcd.for C36H45N2O([M+H]+)requires m/z 521.35345,found m/z 521.35264.

[0038] 二、HQO在酸性环境中的结构转变

[0039] 将上述步骤一中制备得到的HQO溶解于DMSO中，配制得到浓度为1mM的母液。

[0040] 配制不同酸性环境下的HQO，分别为11.5μM的HQO溶液(DMSO，无HCl)、11.5μM的HQO溶液(DMSO，10mM HCl)和11.5μM的HQO溶液(DMSO，500mM HCl)。

[0041] 在较弱酸性条件下，HQO可于环境中与质子作用，行成一种醇式结构HQOH+，这种结构与先前的结构有不同的最大吸收波长，可由吸收光谱的变化进行区分。在极酸环境下，由于溶液中含有大量的H+，HQOH+结构会结合氢离子形成含有两个电荷的 结构转变如图2(b)所示。吸收光谱如图2(a)所示，其基本构型(酮式结构)的吸收光谱在可见光区域(λmax＝475 and 515nm)，其酸式结构(烯醇式结构，HQOH+)的吸收光谱处于近红外区域(λmax＝710nm)。

[0042] HQO在DMSO的核磁滴定氢谱(图3)中显示出随着盐酸的加入烯烃及芳环的不断质子化过程，直至HQO与盐酸的比例为1:2(摩尔比)时核磁图谱便不再发生变化，证明了HQO的双质子化论点。

[0043] 三、HQO的细胞定位实验

[0044] 采用HQO、Mito Tracker Green(线粒体探针)和LysoBlue(溶酶体探针)进行细胞定位。其中，HQO在559nm激光的激发下是红色荧光，在635nm激光的激发下是红色荧光；Mito Tracker Green购自凯基生物，呈绿色荧光，激发波长488nm；LysoBlue购自凯基生物，呈蓝色荧光，激发波长405nm。

[0045] (1)配制工作液

[0046] 将HQO母液加入无血清培养基中分别配制10μM和100μM的HQO工作液。

[0047] 将Mito Tracker Green(线粒体探针)溶解于DMSO中，配制得到浓度为1mM的母液。将母液加入无血清培养基中配制浓度为10μM的Mito Tracker Green工作液。

[0048] 将LysoBlue(溶酶体探针)溶解于无血清培养基中，配制得到浓度为1mM的母液。将母液加入无血清培养基中配制LysoBlue浓度为10μM的工作液。

[0049] (2)染色和细胞成像

[0050] MCF-7(荷尔蒙依赖性乳腺癌)，HeLa(宫颈癌细胞)和A549(非小细胞肺癌细胞)细胞购自中国科学院上海生物科学中心细胞库，LoVo(人结肠癌细胞)购自中山大学第三附属医院，MCF-7细胞在DMEM细胞培养基中培养，A549,HeLa及LoVo细胞在1640细胞培养基中培养，培养基中都含10％胎牛血清和1％青链霉素孵育。细胞在培养箱中37℃，5％CO2条件下常规培养。细胞在成像前置于直径为20mm的玻璃基底细胞培养皿(MatTek Co.)培养24h。

[0051] 细胞在成像前置于直径为20mm的玻璃基底细胞培养皿(MatTek Co.)培养24h。成像过程，首先将染料与细胞在培养基中孵育0.5h(37℃)，接着细胞用PBS缓冲液(pH＝7.4)洗三次，以去除游离的探针分子，随后加入1mL无血清的培养基待成像用。荧光成像是用100倍的油镜观察的，成像所获得的照片是用Olympus FV10-ASW 1.6 viewer软件处理。激发波长是405nm，488nm，559nm和635nm，荧光信号收集1通道425-475nm和2通道500-545nm，3通道570-625nm和4通道的655-755nm的荧光强度。

[0052] 1)MCF-7细胞

[0053] A、采用10μM Mito Tracker Green工作液和100μM HQO工作液染色MCF-7细胞，激光共聚焦拍照，激发波长分别为488nm,559nm和635nm，实验结果如图4(a)所示。

[0054] B、采用10μM LysoBlue工作液和100μM HQO工作液染色MCF-7细胞，激光共聚焦拍照，激发波长分别为405nm,559nm和635nm，实验结果如图4(b)所示。

[0055] 2)A549细胞

[0056] 同MCF-7细胞，实验结果如图5所示。

[0057] 3)LoVo细胞

[0058] 同MCF-7细胞，实验结果如图6所示。

[0059] 4)MCF-7细胞三色染色

[0060] A、采用10μM LysoBlue工作液、Mito Tracker Green工作液和HQO工作液染色MCF-7细胞，激光共聚焦拍照，激发波长分别为405nm,488nm和559nm，实验结果如图7(a)所示。

[0061] B、采用10μM LysoBlue工作液、Mito Tracker Green工作液和HQO工作液染色MCF-7细胞，激光共聚焦拍照，激发波长分别为405nm,488nm和635nm，实验结果如图7(b)所示。

[0062] 由图4、图5、图6和图7可以看出，当使用559nm激光激发时，HQO与线粒体探针可以很好的重合，表明HQO定位在线粒体；当使用635nm激光激发时，HQOH+(HQO形成HQOH+)荧光图像定位在溶酶体区域以内。说明HQO可以进入活细胞并且定位在线粒体；而被染色的溶酶体是自噬溶酶体，由线粒体破损而来。HQOH+定位的荧光区域是线粒体密度较大的区域，是较多破损的线粒体或过量的线粒体所在的区域，导致了线粒体自噬。这些现象在三种实验细胞(MCF-7,A549和LoVo)中得到证明。HQOH+和HQO(635nm/559nm)的荧光强度比值(图4)表明在线粒体自噬体与溶酶体融合后自噬溶酶体的不同pH。

[0063] 四、饥饿条件下的线粒体自噬情况

[0064] 众所周知，培养的细胞在饥饿环境可诱导线粒体自噬。为了进一步研究HQO是否能监测自噬过程，本发明将HQO与LysoBlue分别溶解在无血清培养基及全培养基中与MCF-7细胞共同孵育不同的时间(HQO 10μM，LysoBlue 10μM)，然后激光共聚焦拍照(如图8所示)。

[0065] 图8中叠加图片显示HQOH+在细胞中的荧光从5min到1h随时间不断增强，同时HQO和LysoBlue的荧光并没有多大变化。HQOH+在细胞中的荧光，无血清培养基的增长要远远强于全培养基的，这表明饥饿条件可引发线粒体自噬。此外，HQOH+在细胞中的荧光染色的区域在LysoBlue染色区域之内。同时，LysoBlue在孵育5min之后染色的溶酶体即可被观测到，但是HQOH+染色的区域的荧光却很微弱。这些结果可进一步证明HQOH+不能染色所有的溶酶体，但是能染色源自损伤线粒体的自噬溶酶体。

[0066] 五、抑制促进线粒体自噬实验

[0067] 将线粒体自噬抑制剂莲心碱(Liensinine)或者线粒体自噬促进剂雷帕霉素(Rapamycin)分别与MFC-7细胞孵育，然后再与HQO在全培养基中孵育以观测线粒体自噬过程(HQO 10μM,liensinine 20μM,rapamycin 100nM)。激光共聚焦结果(图9)显示出，在雷帕霉素处理的细胞，我们可以很明显的观测到HQOH+的荧光，而在经莲心碱处理过的细胞中，我们并没有观测到HQOH+的荧光。这些结果证明HQOH+并不能染色所有的溶酶体，只能染色由线粒体损伤而来的自噬溶酶体。

[0068] 六、实时共聚焦成像监测自噬过程实验

[0069] 为了进一步证明HQO与细胞的相互作用，本发明在无血清的培养基中进行了实时成像实验，如图10所示与HeLa细胞的共同孵育(HQO 20μM，激发波长559nm和635nm)，图11所示与MCF-7细胞的共同孵育(HQO 20μM，激发波长559nm和635nm)。由图10和图11可以看出，在五分钟左右HQO即可进入细胞并定位在线粒体部位，并且HQO的荧光随着时间的增减逐渐+增强；直到30分钟左右才观测到明显的HQOH的红色荧光，并且荧光随时间的增加而逐渐增强，这表明了线粒体自噬在无血清条件下的进程；在孵育三小时时，所有HQO染色的区域都显示红色荧光了，并且在四小时时观测到细胞的收缩变小，表明了细胞损伤或者死亡。因此，HQO可用于监测活细胞中线粒体自噬过程。

[0070] 七、HQO的细胞毒性实验

[0071] 本发明使用CCK-8方法及MCF-7细胞测定HQO的细胞毒性，具体步骤如下：

[0072] MCF-7细胞以每孔5×103个细胞种在96孔板中，每孔100μL。培养过夜贴壁后，加入不同浓度的HQO母液到相应的孔中，使其终浓度分别为1μM,10μM,20μM,30μM,50μM,70μM,100μM，每个浓度平行做三个样品，以加入1μL的DMSO溶液组作为空白对照，继续培养24h。然后去除培养基，用pH 7.4的PBS缓冲液洗两遍，每孔加入100μL 10％CCK-8试剂，在37℃环境孵育0.5–1h。利用多功能酶标仪测定450nm波长的吸收值，按公式(1)计算得到细胞存活率。

[0073] 细胞存活率＝Ax-A0/Ac-A0×100％      (1)

[0074] 公式(1)中，Ac表示未加染料细胞组在450nm处的吸收值，Ax表示加染料处理细胞组在450nm处的吸收值；A0指不含细胞的空白培养基组450nm的吸收值。

[0075] 实验结果如图12所示，不同浓度的HQO分别与MCF-7细胞孵育24小时，即使在浓度增加到100μM也没有表现出明显的细胞毒性，表明HQO有作为荧光探针监测活细胞动力学过程的潜力。