本发明公开了一种基于HCR信号放大的无标记电致发光生物传感器及检测转录因子的方法，与现有技术相比，本发明利用转录因子对特定序列DNA的识别，实现目标DNA从三链中分离，脱附下来的目标链引发杂交链式反应，通过Ru(phen)32+(1,10‑邻二氮菲钌)可以插入双链作为信号进行检测，制备出无标记电致发光生物传感器，实现了对转录因子的灵敏性，特异性，稳定性的检测。
1.一种基于HCR信号放大的无标记电致发光生物传感器，其特征在于，无标记电致发光生物传感器的制备方法包括以下步骤：a、将单链DNA-1缓冲溶液、单链DNA-2缓冲溶液混合在Tris-HCl杂交缓冲液中，加热，使其互补配对成双链DNA，冷却至室温；
b、取得到的双链DNA、目标DNA缓冲溶液和硝酸银溶液混合在磷酸缓冲液中，混合，加入转录因子培养，得到混合溶液；
c、将巯基化DNA滴在处理后的金电极上，室温培育一夜，清洗后，去除非特异性绑定的巯基化DNA，将制备的修饰电极浸入步骤b中所得的混合溶液中吸收，然后，在含有辅助DNA-
1和辅助DNA-2的混合溶液中培育，最后，滴Ru(phen)32+溶液在修饰电极上，培育，得到基于HCR信号放大的无标记电致发光生物传感器；
所述巯基化DNA序列为：5’-SH-GAAAGGG-3’； 目标DNA序列为：5’-TTTTTTTTCCCTTTC-
3’； 单链DNA-1序列为：5’-TTTTTTTTCCCTTTCAGGGGAGTA-3’；单链DNA-2序列为：5’-AAAAAAAAGGGAAAGTCCCCTCAT-3’；辅助DNA-1序列为：5’-AAAAAAAAGTACTATTTTTTTT-3’；辅助DNA-2序列为：5’-TTTTTTTTTCGTACAAAAAAAA-3’。
2.根据权利要求1所述的基于HCR信号放大的无标记电致发光生物传感器，其特征在于，步骤a具体为：将单链DNA-1缓冲溶液、单链DNA-2缓冲溶液稀释至浓度为5μM，各取5μL，混合在10μL浓度为0.01M 的Tris-HCl杂交缓冲液中，在95℃加热5min，单链DNA-1和单链DNA-2通过碱基互补配对成双链DNA，然后冷却至室温。
3.根据权利要求1所述的基于HCR信号放大的无标记电致发光生物传感器，其特征在于，步骤b具体为：取2μL步骤b制备的双链DNA、10μL 2.5μM目标DNA缓冲溶液，2μL 500μM的硝酸银溶液混合在10 mM 磷酸缓冲液中，37℃下混合30分钟，然后加入10μL的转录因子，37℃下培育10min，终体积为50μL；得到混合溶液。
4.根据权利要求1所述的基于HCR信号放大的无标记电致发光生物传感器，其特征在于，步骤c具体为：滴10μL浓度为2μM的巯基化DNA缓冲溶液在处理后的金电极上，室温培育一夜，然后，电极表面用去离子水清洗，放在1 mM 6-巯基己-1-醇中2小时，以去除非特异性绑定的巯基化DNA，然后用10 mM pH为 7.4磷酸洗液清洗后，修饰电极浸入步骤b中所得的混合溶液中吸收1小时，再次用10 mM pH为 7.4的磷酸洗液清洗，氮气干燥，然后，将5μL浓度为1μM辅助DNA-1缓冲溶液和5μL浓度为1μM的辅助DNA-2混合，修饰电极在其中培育2小时，然后，滴10μL 2 mM的Ru(phen)32+溶液在修饰电极上培育7小时，得到基于HCR信号放大的无标记电致发光生物传感器。
5.一种检测转录因子的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）、将单链DNA-1缓冲溶液、单链DNA-2缓冲溶液混合在Tris-HCl杂交缓冲液中，加热，使其互补配对成双链DNA，冷却至室温；
（2）、取得到的双链DNA、目标DNA缓冲溶液和硝酸银溶液混合在磷酸缓冲液中，混合，分别加入浓度为0、50、100、200、300、600、1000、2000pM的转录因子培养，分别得到混合溶液；
（3）、将巯基化DNA滴在处理后的金电极上，室温培育一夜，清洗后，去除非特异性绑定的巯基化DNA，将制备的修饰电极浸入步骤（2）中所得的混合溶液中吸收，然后，在含有辅助DNA-1和辅助DNA-2的混合溶液中培育，最后，滴Ru(phen)32+溶液滴在修饰电极上，培育；利用电致化学发光分析仪检测制备的修饰电极的发光强度；构建转录因子浓度与发光强度的线性关系；
（4）根据待检测转录因子的发光强度及所得到的线性关系，得到待检测转录因子的浓度；
所述巯基化DNA序列为：5’-SH-GAAAGGG-3’； 目标DNA序列为：5’-TTTTTTTTCCCTTTC-
3’； 单链DNA-1序列为：5’-TTTTTTTTCCCTTTCAGGGGAGTA-3’；单链DNA-2序列为：5’-AAAAAAAAGGGAAAGTCCCCTCAT-3’；辅助DNA-1序列为：5’-AAAAAAAAGTACTATTTTTTTT-3’；辅助DNA-2序列为：5’-TTTTTTTTTCGTACAAAAAAAA-3’。
一种基于HCR信号放大的无标记电致发光生物传感器及检测
转录因子的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于HCR信号放大的无标记电致发光生物传感器及检测转录因子的方法。
背景技术
[0002] 真核生物转录起始十分复杂，往往需要多种蛋白因子的协助，转录因子(Transcription factors，TFs)与RNA聚合酶II形成转录起始复合体，共同参与转录起始的过程。根据转录因子的作用特点可分为二类；第一类为普遍转录因子，它们与RNA聚合酶II共同组成转录起始复合体时，转录才能在正确的位置开始。除TFII D以外，还发现TFII A，TFII F，TFII E，TFII H等，它们在转录起始复合体组装的不同阶段起作用。第二类转录因子为组织细胞特异性转录因子，这些TF是在特异的组织细胞或是受到一些类固醇激素\生长因子或其它刺激后，开始表达某些特异蛋白质分子时，才需要的一类转录因子。
[0003] TFs(转录因子)是一种管理蛋白质，通过绑定特定的DNA序列，在调节各种重要的细胞过程中，例如：基因复制，基因转录，细胞分裂以及DNA修复起着非常重要的作用。
[0004] 然而，TFs(转录因子)的误调节及突变可能会导致各种疾病，例如，癌症，糖尿病，先天性心脏病，自身免疫病以及发展性综合征。
[0005] 如何实现快速、准确的检测转录因子成为现在研究的热点之一。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于，提供一种基于HCR信号放大的无标记电致发光生物传感器及检测转录因子的方法，利用转录因子对特定序列DNA的识别，实现目标DNA从三链中分离，脱附下来的目标链引发杂交链式反应，通过Ru(phen)32+(1，10-邻二氮菲钌)可以插入双链作为信号进行检测，制备出无标记电致发光生物传感器，实现了对转录因子的灵敏性，特异性，稳定性的检测。
[0007] 一种基于HCR信号放大的无标记电致发光生物传感器，其制备方法包括以下步骤：
[0008] a、将单链DNA-1缓冲溶液、单链DNA-2缓冲溶液混合在Tris-HCl杂交缓冲液中，加热，使其互补配对成双链DNA，冷却至室温；
[0009] b、取得到的双链DNA、目标DNA缓冲溶液和硝酸银溶液混合在磷酸缓冲液中，混合，加入转录因子培养，得到混合溶液；
[0010] c、将探针DNA滴在处理后的金电极上，室温培育一夜，清洗后，去除非特异性绑定的巯基DNA，将制备的修饰电极浸入步骤b中所得的混合溶液中吸收，然后，在含有辅助DNA-1和辅助DNA-2的混合溶液中培育，最后，滴Ru(phen)32+溶液在修饰电极上，培育，得到基于HCR信号放大的无标记电致发光生物传感器。
[0011] 在步骤a之前，首先将购买的DNA探针、目标DNA、单链DNA-1、单链DNA-2、辅助DNA-1、辅助DNA-2分别溶解在Tris-HCl缓冲溶液中，得到浓度均为100μM的DNA探针缓冲溶液、目标DNA缓冲溶液、单链DNA-1缓冲溶液、单链DNA-2缓冲溶液、辅助DNA-1缓冲溶液、辅助DNA-2缓冲溶液，并在4℃下保存备用；后续使用时根据需要稀释；所述Tris-HCl缓冲溶液，具体为：0.01M pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液。
[0012] 进一步的，巯基化DNA(SH-CP)序列为：5’-SH-GAAAGGG-3’；
[0013] 目标DNA序列为：5’-TTTTTTTTCCCTTTC-3’；
[0014] 单链DNA-1序列为：5’-TTTTTTTTCCCTTTCAGGGGAGTA-3’；
[0015] 单链DNA-2序列为：5’-AAAAAAAAGGGAAAGTCCCCTCAT-3’；
[0016] 辅助DNA-1序列为：5’-AAAAAAAAGTACTATTTTTTTT-3’；
[0017] 辅助DNA-2序列为：5’-TTTTTTTTTCGTACAAAAAAAA-3’。
[0018] 步骤a具体为：将单链DNA-1缓冲溶液、单链DNA-2缓冲溶液稀释至浓度为5μM，各取5μL，混合在10μL浓度为0.01M的Tris-HCl杂交缓冲液中，在95℃加热5min，单链DNA-1和单链DNA-2通过碱基互补配对成双链DNA，然后冷却至室温；所述的Tris-HCl杂交缓冲液为：pH为7.4，含有100mM NaCl和1mM EDTA。
[0019] 步骤b具体为：取2μL步骤b制备的双链DNA、10μL 2.5μM目标DNA缓冲溶液，2μL 500μM的硝酸银溶液混合在10mM磷酸缓冲液中，37℃下混合30分钟，然后加入10μL的转录因子，37℃下培育10min，终体积为50μL；得到混合溶液；
[0020] 步骤b中所述磷酸缓冲液pH为7.4，含有200mM亚硝酸钠；
[0021] 步骤c处理后的电极具体为：将金电极先浸入食人鱼洗液30分钟，然后用去离子水彻底清洗，再依次用直径0.3和0.5mm的铝粉进行抛光处理，再依次用去离子水、乙醇溶液、超纯水超声清洗5分钟，之后，再将电极浸入0.5M的硫酸溶液中进行电化学清洗，扫描电压为0.2-1.6V，直至出现稳定的伏安图，最后在氮气中干燥，得到处理后的电极；所述食人鱼洗液为体积比3∶1的浓硫酸与过氧化氢混合溶液。
[0022] 步骤c具体为：滴10μL浓度为2μM的DNA探针缓冲溶液在处理后的金电极上，室温培育一夜，然后，电极表面用去离子水清洗，放在1mM 6-巯基己-1-醇中2小时，以去除非特异性绑定的巯基DNA，然后用10mM pH为7.4磷酸洗液清洗后，修饰电极浸入步骤b中所得的混合溶液中吸收1小时，再次用10mM pH为7.4的磷酸洗液清洗，氮气干燥，然后，将5μL浓度为1μM辅助DNA-1缓冲溶液和5μL浓度为1μM的辅助DNA-2混合，修饰电极在其中培育2小时，然后，滴10μL 2mM的Ru(phen)32+溶液在修饰电极上培育7小时，得到基于HCR信号放大的无标记电致发光生物传感器。
[0023] 一种检测转录因子的方法，包括以下步骤：
[0024] (1)、将单链DNA-1缓冲溶液、单链DNA-2缓冲溶液混合在Tris-HCl杂交缓冲液中，加热，使其互补配对成双链DNA，冷却至室温；
[0025] (2)、取得到的双链DNA、目标DNA缓冲溶液和硝酸银溶液混合在磷酸缓冲液中，混合，分别加入浓度为0、50、100、200、300、600、1000、2000pM的转录因子培养，分别得到混合溶液；
[0026] (3)、将探针DNA滴在处理后的金电极上，室温培育一夜，清洗后，去除非特异性绑定的巯基DNA，将制备的修饰电极浸入步骤(2)中所得的混合溶液中吸收，然后，在含有辅助DNA-1和辅助DNA-2的混合溶液中培育，最后，滴Ru(phen)32+溶液滴在修饰电极上，培育；利用电致化学发光分析仪检测制备的修饰电极的发光强度；构建转录因子浓度与发光强度的线性关系；
[0027] (4)根据待检测转录因子的发光强度及所得到的线性关系，得到待检测转录因子的浓度。
[0028] 步骤(1)具体为：ECL电致化学发光强度利用MPI-E型电致化学发光分析仪在0.1M磷酸缓冲液(pH 7.4，20mM三丙胺)扫描修饰电极，扫描电压从0到1.2V，扫速为0.1V/s，光电倍增管高压设置为400-600V，构建转录因子浓度与发光强度的线性关系；
[0029] 由于Ru(phen)32+(1，10-邻二氮菲钌)的信号强度与目标DNA浓度有关，也就与转录因子的浓度有关，随着NF-kB p50(转录因子)浓度的增加，ECL(电致化学发光)的峰强度即Ru(phen)32+(1，10-邻二氮菲钌)的信号强度会随之增加，因此，此传感器可实现对不同浓度的NF-kB p50(转录因子)进行检测。
[0030] 与现有技术相比，本生物传感器的制备方法，利用Ru(phen)32+(1，10-邻二氮菲钌)插入双链DNA作为信号分子，步骤简单，无标记。通过转录因子与双链DNA的特异性结合，使得目标DNA从三链脱附下来，将脱附下的目标DNA引发HCR杂交链式反应，实现更多的Ru(phen)32+(1，10-邻二氮菲钌)插入，从而使得ECL电致化学发光信号得到放大，构建ECL电致化学发光信号与转录因子NF-kB p50浓度的线性关系，ECL强度的测量是在5mL，浓度为0.1M含有20mM的三丙胺的磷酸缓冲液中进行。扫描电压以0.1V/s的扫速从0V扫到1.2V，光电倍增管电压设置至400-600V，所得线性关系为I＝1066.5+7.9200C(pM)，线性范围为0-2000pM，检测限为0.017nM，相关系数为0.9990。
[0031] 与现有技术相比，本发明具有对转录因子的检测具有灵敏度高，检测限低，选择性好，稳定性好的特点。
附图说明
[0032] 图1为基于HCR信号放大的无标记电致化学发光检测转录因子的生物传感器的制备示意图；
[0033] 图2A为有转录因子的传感器组装各步骤的循环伏安图；
[0034] 图2B为无转录因子的传感器组装各步骤的循环伏安图；
[0035] a为裸金电极；b为SH-CP修饰的金电极；c为Target DNA/SH-CP修饰的金电极；d为H1/H2/Target DNA/SH-CP修饰的金电极；
[0036] 图3A为有转录因子的传感器组装各步骤的阻抗图；
[0037] 图3B为无转录因子的传感器组装各步骤的阻抗图；
[0038] a为裸金电极；b为SH-CP/裸金电极；c为Target DNA/SH-CP/裸金电极；d为H1/H2/Target DNA/SH-CP/裸金电极；e为Ru(phen)32+/Target DNA/SH-CP/裸金电极；
[0039] 图4A为有转录因子传感器组装各步骤的循环伏安图；
[0040] 图4B为无转录因子传感器组装各步骤的循环伏安图；
[0041] a为裸金电极；b为裸金电极/TPrA；c为SH-CP/裸金电极/TPrA；d为Target DNA/SH-CP/裸金电极/TPrA；e为H1/H2/Target DNA/SH-CP/裸金电极/TPrA；f为Ru(phen)32+/H1/H2/Target DNA/SH-CP/裸金电极/TPrA
[0042] 图5为传感器可行性图；
[0043] a为裸金电极；b为SH-CP/裸金电极；c为Ru(phen)32+/Target DNA/SH-CP/裸金电极；d为Ru(phen)32+/H1/H2/Target DNA/SH-CP/裸金电极；
[0044] 图6A为基于HCR信号放大的无标记电致化学发光生物传感器对不同浓度转录因子的电致化学发光图；(电压-强度)
[0045] 图6B为基于HCR信号放大的无标记电致化学发光生物传感器对不同浓度转录因子的电致化学发光图；(时间-强度)
[0046] 图6C为转录因子的浓度和电信号强度的线性关系图；
[0047] 图7A基于HCR信号放大的无标记电致化学发光生物传感器的稳定性图；
[0048] 图7B基于HCR信号放大的无标记电致化学发光生物传感器的选择性图；a为对人凝血酶的信号强度；b为对人免疫球蛋白的信号强度；c为对牛血清蛋白的信号强度；d为NF-kB p50的信号强度
[0049] 图8为基于HCR信号放大的无标记电致化学发光生物传感器的实样检测图；a为未处理的核提取物加入NF-kB p50；b为TNF-α处理的核提取物；c为未处理的核提取物；d为不加核提取物。
具体实施方式
[0050] 本领域公知的以下简称对应为：巯基化DNA：SH-CP、目标DNA：Target DNA、单链DNA-1：sDNA-1、单链DNA-2：sDNA-2、辅助DNA-1：H1、辅助DNA-2：H2。
[0051] 实施例1
[0052] 一种检测转录因子的方法，包括以下步骤：
[0053] (1)将购买的所有DNA探针(巯基化DNA：SH-CP：5’-SH-GAAAGGG-3’；目标DNA：Target DNA：5’-TTTTTTTTCCCTTTC-3’；单链DNA-1：sDNA-1：5’-
TTTTTTTTCCCTTTCAGGGGAGTA-3’；单链DNA-2：sDNA-2：5’-AAAAAAAAGGGAAAGTCCCCTCAT-3’；
辅助DNA-1：H1：5’-AAAAAAAAGTACTATTTTTTTT-3’；辅助DNA-2：H2：5’-
TTTTTTTTTCGTACAAAAAAAA-3’)分别溶解在0.01M Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液)(pH 7.4)缓冲溶液中，其中，巯基化DNA所用缓冲液体积为119μL，目标DNA所用缓冲液体积为88μL，单链DNA-1所用缓冲液体积为46μL，单链DNA-2所用缓冲液体积为38μL，辅助DNA-1所用缓冲液体积为106μL，辅助DNA-2所用缓冲液体积为110μL，均得到100μM的原液，并在4℃下保存备用。
[0054] (2)、相应的互补配对的sDNA-1和sDNA-2各取5μL，浓度为5μM，混合在10μL，浓度为0.01M Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液)杂交缓冲液中(pH 7.4，100mM NaCl(氯化钠)，1mM EDTA(二乙胺四乙酸))，sDNA-1，sDNA-2终浓度均为1.25μM，将上述混合物在95℃加热5分钟，两条单链DNA通过碱基互补配对成dsDNA(双链DNA)，然后缓慢冷却至室温。
[0055] (3)、取2μL上述dsDNA(双链DNA)与10μL，2.5μM目标DNA、2μL 500μM的硝酸银溶液混合在10mM磷酸缓冲液中(pH 7.4，200mM亚硝酸钠)，37℃下混合30分钟，将10μL浓度分别为0，50，100，200，300，600，1000，2000pM的转录因子NF-kB p50分别加入上述体系中，37℃下培育10分钟；得到混合溶液；
[0056] (4)、将金电极先进入食人鱼洗液(浓硫酸与过氧化氢体积比3∶1混合溶液)30分钟，然后用去离子水彻底清洗，再依次用直径0.3和0.5mm的铝粉进行抛光处理，再依次用去离子水、乙醇溶液、超纯水超声清洗5分钟。之后，再将电极浸入0.5M的硫酸溶液中进行电化学清洗，扫描电压为0.2-1.6V，直至出现稳定的伏安图，最后在氮气中干燥，得到处理后的电极；
[0057] (5)、一滴10μL的SH-CP(巯基DNA)滴在处理后的电极上，室温培育一夜，然后电极表面用去离子水清洗，放在1mM MCH(6-巯基己-1-醇)中2小时以去除非特异性绑定的巯基DNA，用10mM磷酸洗液(pH 7.4)清洗后，修饰电极浸入步骤(3)得到的混合溶液中吸收1小时，得到的修饰电极再次用10mM的磷酸洗液(pH 7.4)清洗，氮气干燥，然后，在含有5μL浓度为1μM H1和5μL浓度为1μM H2的混合反应溶液中培育2小时，然后，一滴10μL 2mM的Ru2+
(phen)3 (1，10-邻二氮菲钌)溶液滴在修饰电极上培育7小时，最后，ECL强度利用MPI-E型电致化学发光分析仪在0.1M磷酸缓冲液(pH 7.4，20mM三丙胺)扫描修饰电极，扫描电压从0到1.2V，扫速为0.1V/s，光电倍增管高压设置为400-600V，得到转录因子浓度与发光强度的线性关系。
[0058] (6)重复步骤(1)-(5)，将步骤(3)中的浓度分别为0，50，100，200，300，600，1000，2000pM的转录因子NF-kB p50替换为相同体积待检测的转录因子，根据步骤(5)构建的线性关系，得到待检测的转录因子的浓度。
[0059] 实施例1以转录因子NF-kB p50为例，其他种类的转录因子检测，通过改变转录因子的识别序列，检测其他的转录因子。
[0060] 实施例2
[0061] 电致化学发光生物传感器的选择性分析实验
[0062] 重复实施例1中步骤(1)-(5)，将步骤(3)中的转录因子分别替换为相同体积的人凝血酶、人免疫球蛋白或牛血清蛋白，其他条件不变，得到的基于HCR信号放大的无标记电致化学发光生物传感器的选择性图，如图7B。
[0063] 实施例3实样检测
[0064] 重复实施例1中步骤(1)-(5)，将步骤(3)中的转录因子分别替换为a含有1nM的NF-kB p50的未处理的，浓度为50ng/μL的海拉细胞核提取物，b TNF-α处理的海拉细胞核提取物，c未处理的海拉细胞核提取物以及d，没有加入细胞核提取物，其他实验条件相同，得到基于HCR信号放大的无标记电致化学发光生物传感器的实样检测图，如图8。
