叶酸包裹去氢胆酸‑多钼氧簇‑芘杂化物及其制备方法

摘要

本发明公开了一种叶酸包裹去氢胆酸‑多钼氧簇‑芘杂化物及其制备方法，所述杂化物的分子式为(C24H33O4)[(OCH2)3CNH](MnMo6O18)[(OCH2)3CN](C17H10)·(C19H19N7O6)3，是将去氢胆酸与多钼氧簇回流反应后，再与芘甲醛回流反应，通过磺酸钾离子树脂柱后，溶于热水中滴入叶酸的热水溶液中制备得到。本发明通过多钼氧簇自身较强的细胞毒性及其与去氢胆酸、芘、叶酸基团之间的协同效应，显著提高了杂化物对肿瘤细胞的毒杀效率，降低了杂化物的给药量。

权利要求

1.一种叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物，其特征是所述杂化物的分子式为(C24H33O4)[(OCH2)3CNH](MnMo6O18)[(OCH2)3CN](C17H10)·(C19H19N7O6)3，结构式如式(Ⅲ)所示，其中：POM=MnMo6O18，Folate=C19H19N7O6。

2.权利要求1所述叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物的制备方法，其特征是按照下述步骤制备：

1)将去氢胆酸溶解在2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉的乙腈溶液中，加入分子式为[(C4H9)4N]3(MnMo6O18)[(OCH2)3CNH2]2的多钼氧簇，回流反应，得到如结构式(I)所示的去氢胆酸-多钼氧簇杂化物；

其中：POM=MnMo6O18，TBA=(C4H9)4N；

2)由去氢胆酸-多钼氧簇杂化物与芘甲醛在甲醇中进行回流反应，得到如结构式(Ⅱ)所示的去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物；

其中：POM=MnMo6O18，TBA=(C4H9)4N；

3)将去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物溶于乙腈，通过磺酸钾离子树脂柱，收集滤液并旋干，溶于热水后滴入叶酸的热水溶液中剧烈搅拌，降至室温后收集沉淀，得到如结构式(Ⅲ)所示的叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物。

3.根据权利要求2所述的叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物的制备方法，其特征是所述多钼氧簇的摩尔用量是去氢胆酸摩尔用量的5～10倍，芘甲醛的摩尔用量是去氢胆酸-多钼氧簇杂化物摩尔用量的1～5倍，叶酸的摩尔用量是去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物摩尔用量的3～4倍。

4.根据权利要求2或3所述的叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物的制备方法，其特征是所述2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉的摩尔用量是去氢胆酸摩尔用量的1～3倍。

5.根据权利要求2所述的叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物的制备方法，其特征是所述步骤1)中的回流反应时间为15～24h。

6.根据权利要求2或5所述的叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物的制备方法，其特征是先将去氢胆酸溶解在2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉的乙腈溶液中回流20～

50min，再加入多钼氧簇进行回流反应。

7.根据权利要求2所述的叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物的制备方法，其特征所述步骤2)中的回流反应时间为10～15h。

8.根据权利要求2所述的叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物的制备方法，其特征是所述磺酸钾的质量是去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物质量的50～200倍。

9.根据权利要求2所述的叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物的制备方法，其特征是所述去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物乙腈溶液通过磺酸钾离子树脂柱的时间为8～12h。

10.根据权利要求2所述的叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物的制备方法，其特征是所述步骤3)中剧烈搅拌的时间为20～40min。

说明书

叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种多钼氧簇杂化物，特别是涉及一种叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物，以及该杂化物的制备方法。

背景技术

[0002] 癌症是严重威胁人类健康和生命的疾病。目前癌症的治疗以化学治疗为主，而这种疗法具有两个最大的缺点：（1）目前市售抗肿瘤药物合成困难，故价格十分昂贵，药物的使用受到了极大的限制，也给患者带来了沉重的负担；（2）药物的给药量一般都比较大，其作用过程是通过血液将药物带到全身，在引起肿瘤细胞凋亡的同时，正常细胞也将受到破坏，故这种疗法也常被称为“胞毒疗法”。为此，过去的几十年里，发展廉价而有效的抗肿瘤药物，一直是生物学、医药学、化学等领域科研工作者持续关注的重点课题。

[0003] 多金属氧簇是由前过渡金属原子通过氧配位桥连接而成的一类单分子簇合物，其在医药、生物、材料、催化等领域均显示出诱人的应用前景。在生物、医学和药学领域，人们很早就知道多金属氧簇具有良好的抗肿瘤、抗病毒和抗细菌活性（Fischer J，Richard L，Weiss R，J.Am.Chem.Soc.，1976，98：3050）。随着时间的推移，最令人瞩目的则是多金属氧簇药物化学的进展，由于其作为无机药物具有诸多优点，如成本低廉，易于合成，具有较好的抗肿瘤、抗病毒、抗细菌活性，因而受到化学、生物、医学等领域众多学者广泛的关注，并得到深入的研究。

[0004] 到目前为止，由于作为抗肿瘤药物的多金属氧簇的给药量一般需要较多，因此严重困扰着其在临床方面的应用发展。在本发明人的前期工作中，通过共价键方式将一种含钼元素的多金属氧簇——多钼氧簇与多个生物配体相连接，制备出了结构确定的杂化物，希望利用多钼氧簇与生物配体之间的协同效应来增强其抗肿瘤功效，从而降低给药量。研究结果显示，不同生物配体改性的杂化物在一定程度上可以增强杀死肿瘤细胞的效果，而有望降低其给药量。但遗憾的是，增强的效果并不是很明显（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2013，23：1462）。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物，以提高其杀死肿瘤细胞的效果，以便减少其给药量。

[0006] 提供所述杂化物的制备方法，是本发明的另一发明目的。

[0007] 为实现上述目的，本发明以分子式为[(C4H9)4N]3(MnMo6O18)[(OCH2)3CNH2]2的多钼氧簇与去氢胆酸、芘甲醛和叶酸为原料，制备得到了一种叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物，所述杂化物的分子式为(C24H33O4)[(OCH2)3CNH](MnMo6O18)[(OCH2)3CN](C17H10)·(C19H19N7O6)3，其结构式如下式(Ⅲ)所示。

[0008]

[0009] 其中：POM=MnMo6O18，Folate=C19H19N7O6。

[0010] 进而，本发明提供了所述叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物的一种制备方法，具体方法为：

[0011] 1)将去氢胆酸溶解在2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉的乙腈溶液中，加入分子式为[(C4H9)4N]3(MnMo6O18)[(OCH2)3CNH2]2的多钼氧簇，回流反应，得到如结构式(I)所示的去氢胆酸-多钼氧簇杂化物；

[0012]

[0013] 其中：POM=MnMo6O18，TBA=(C4H9)4N；

[0014] 2)由去氢胆酸-多钼氧簇杂化物与芘甲醛在甲醇中进行回流反应，得到如结构式(Ⅱ)所示的去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物；

[0015]

[0016] 其中：POM=MnMo6O18，TBA=(C4H9)4N；

[0017] 3)将去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物溶于乙腈，通过磺酸钾离子树脂柱，收集滤液并旋干，溶于热水后滴入叶酸的热水溶液中剧烈搅拌，降至室温后收集沉淀，得到如结构式(Ⅲ)所示的叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物。

[0018] 本发明上述制备方法中各种原料的用量为：多钼氧簇的摩尔用量是去氢胆酸摩尔用量的5～10倍，芘甲醛的摩尔用量是去氢胆酸-多钼氧簇杂化物摩尔用量的1～5倍，叶酸的摩尔用量是去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物摩尔用量的3～4倍。

[0019] 进一步地，所述步骤1)中2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉的摩尔用量是去氢胆酸摩尔用量的1～3倍。

[0020] 本发明所述步骤1)中的回流反应时间为15～24h，反应结束后的产物除去乙腈后，在乙酸乙酯中沉淀，收集沉淀物，再次用乙腈溶解，在乙醚蒸汽中沉淀3～5天，干燥后得到去氢胆酸-多钼氧簇杂化物。

[0021] 优选地，所述步骤1）是先将去氢胆酸溶解在2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉的乙腈溶液中回流20～50min，再加入多钼氧簇进行回流反应。

[0022] 本发明所述步骤2)中的回流反应时间为10～15h，反应产物浓缩后，在甲苯中沉淀两次，干燥得到去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物。

[0023] 本发明所述步骤3)中，离子树脂柱中磺酸钾的质量是去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物质量的50～200倍。

[0024] 优选地，所述步骤3)中去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物乙腈溶液通过磺酸钾离子树脂柱的时间为8～12h。

[0025] 进一步地，所述步骤3)中剧烈搅拌的时间为20～40min。

[0026] 本发明上述制备方法的具体合成路线如下。

[0027]

[0028] 据报道，多钼氧簇自身具有较强的细胞毒性（Yanagie H，Ogata A, Mitsui S, et a1. Biomed. Pharmacother 2006, 60：349−352）。但遗憾的是，其作为无机药物很难直接被肿瘤细胞所吸收而大量杀死肿瘤细胞。本发明选取去氢胆酸、芘甲醛和叶酸对多钼氧簇进行功能化改性，其中，去氢胆酸是由动物胆汁中提取的胆酸经氢化制得，有利胆和促进胆汁分泌的作用，可刺激肝细胞分泌大量低比重、低黏度的胆汁，促进胆汁的引流而有利于胆道和胆囊内细菌、炎症性产物、毒素、胆砂和小结石排出，起着冲洗清洁胆道系统的作用。若将去氢胆酸连接到多钼氧簇表面，将有助于增强杂化物与细胞的相容性。芘基团对生物细胞有一定的粘附作用，若将其连接到多钼氧簇表面，有助于提高杂化物对肿瘤细胞的粘附作用，通过与去氢胆酸的协同效应，进一步增强肿瘤细胞对杂化物的吸收效率。叶酸也叫维生素B9，是一种水溶性维生素。是人体利用糖分和氨基酸时的必要物质，是机体细胞生长和繁殖所必需的物质。作为受体的叶酸对肿瘤细胞具有高度亲合性，而对绝大多数正常细胞作用较小，若将其修饰到多钼氧簇表面，有助于增强杂化物对肿瘤细胞的靶向性。

[0029] 本发明同时将去氢胆酸、芘甲醛、叶酸三种具有不同功能活性的分子改性修饰到多钼氧簇表面，首次制备出了叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物，其通过多钼氧簇外围叶酸对肿瘤细胞的靶向功能，将杂化物主要引入肿瘤细胞区域，继而通过芘基团对肿瘤细胞较好的粘附作用，使得杂化物可以粘附在肿瘤细胞表面，最后通过去氢胆酸与肿瘤细胞之间良好的相容性，提高肿瘤细胞对杂化物的吸收量。故而，本发明通过多钼氧簇自身较强的细胞毒性及其与去氢胆酸、芘、叶酸基团之间的协同效应，显著提高了杂化物对肿瘤细胞的毒杀效率，降低了杂化物的给药量。

[0030] 本发明叶酸包裹的去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物的制备方法工艺简便易行，反应过程条件温和、易于控制，产物提纯简单，便于实现工业化生产和推广应用。

附图说明

[0031] 图1为实施例1制备的去氢胆酸-多钼氧簇杂化物的FT-IR谱图。

[0032] 图2为实施例1制备的去氢胆酸-多钼氧簇杂化物的ESI-MS谱图。

[0033] 图3为实施例1制备的去氢胆酸-多钼氧簇杂化物的1H NMR谱图。

[0034] 图4为实施例1制备的去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物的FT-IR谱图。

[0035] 图5为实施例1制备的去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物的ESI-MS谱图。

[0036] 图6为实施例1制备的去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物的1H NMR谱图。

[0037] 图7为实施例1制备的叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物的ESI-MS谱图。

[0038] 图8为应用例体外细胞毒性实验的细胞相对存活率比较结果。

具体实施方式

[0039] 实施例1

[0040] 1)去氢胆酸-多钼氧簇杂化物的合成

[0041] 在250mL圆底烧瓶中分别加入65mg去氢胆酸、60mg 2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉和100mL乙腈，回流反应30min后，加入3039mg  [(C4H9)4N]3(MnMo6O18)[(OCH2)3CNH2]2，继续回流反应24h后停止反应，将反应产物旋蒸浓缩后滴入200mL乙酸乙酯中，抽滤，产物再次溶解在3mL乙腈中，置于乙醚蒸汽中沉淀3天，抽滤、干燥，得到去氢胆酸-多钼氧簇杂化物橙色固体267mg，收率73%。

[0042] 图1、图2和图3分别是上述产物的红外光谱图、质谱图和核磁共振氢谱图。结合上述谱图可以证明所合成产物是去氢胆酸-多钼氧簇杂化物。其中，图1中3357和3312cm-1为N-H伸缩振动峰，1709和1672cm-1为C＝O伸缩振动峰，1541cm-1为N-H弯曲振动峰，1044、943、921、902和667cm-1为多钼氧簇特征峰；图2中1542.3和1784.1的特征峰分别为目标产物掉三个四丁基胺离子加两个质子和目标产物掉两个四丁基胺离子加一个质子的离子质子峰，图谱中没有其他杂峰；图3中*表示溶剂峰，☆表示水峰。

[0043] 2)去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物的合成

[0044] 在100mL圆底烧瓶中分别加入267mg去氢胆酸-多钼氧簇杂化物、41mg芘甲醛和40mL甲醇，回流反应12h后，旋蒸浓缩，将产物在100mL甲苯中沉淀两次，抽滤，干燥，得到去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物黄色固体266mg，收率91%。

[0045] 通过图4的红外光谱图、图5的质谱图和图6的核磁共振氢谱图可以证明所合成产-1物是去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物。其中，图4中3357cm 为N-H伸缩振动峰，1709和1679cm-1为C＝O伸缩振动峰，1622cm-1为N=C伸缩振动峰，1538cm-1为N-H弯曲振动峰，1044、941、
920、903和667cm-1为多钼氧簇特征峰；图5中1755.8和1777.3的特征峰分别为目标产物掉三个四丁基胺离子加两个质子和目标产物掉三个四丁基胺离子加一个钾和质子的离子质子峰，图谱中没有其他杂峰；图6中*表示溶剂峰，☆表示水峰。

[0046] 3)叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物的合成

[0047] 将266mg去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物溶于500mL乙腈中，使其在9h后完全通过装有14000mg磺酸钾的离子树脂柱（1m×2cm），收集滤液并旋干，得到黄色固体产物179mg，收率89%。将含有50mg上述产物的热水溶液缓慢滴入含有36mg叶酸的热水中，剧烈搅拌25min，将溶液降至室温，离心收集沉淀，干燥，得叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物橙色固体53mg，收率62%。

[0048] 图7的质谱图中，1096.5的特征峰为目标产物掉两个叶酸离子带两个负电荷的离子质子峰，图谱中没有其他杂峰。叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物中各元素的理论计算值为C 41.39；H 3.70；N 10.47，测试值为C 40.91；H 3.36；N 10.58。通过图7的质谱图和元素分析结果，可以证明所合成产物是叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物。

[0049] 实施例2

[0050] 1)去氢胆酸-多钼氧簇杂化物的合成

[0051] 在250mL圆底烧瓶中分别加入70mg去氢胆酸、115mg 2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉和100mL乙腈，回流反应40min，加入1800mg  [(C4H9)4N]3(MnMo6O18)[(OCH2)
3CNH2]2，继续回流反应17h后停止反应，将反应产物旋蒸浓缩后滴入200mL乙酸乙酯中，抽滤，产物再次溶解在3mL乙腈中，置于乙醚蒸汽中沉淀3天，抽滤、干燥，得到去氢胆酸-多钼氧簇杂化物橙色固体270mg，收率68%。

[0052] 2)去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物的合成

[0053] 在100mL圆底烧瓶中分别加入200mg去氢胆酸-多钼氧簇杂化物、81mg芘甲醛和40mL甲醇，回流反应14h后，旋蒸浓缩，将产物在100mL甲苯中沉淀两次，抽滤，干燥，得到去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物黄色固体191mg，收率87%。

[0054] 3)叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物的合成

[0055] 将280mg去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物溶于500mL乙腈中，使其在11h后完全通过装有42000mg磺酸钾的离子树脂柱（1m×2cm），收集滤液并旋干，得到黄色固体产物171mg，收率81%。将含有45mg上述产物的热水溶液缓慢滴入含有34mg叶酸的热水中，剧烈搅拌40min，将溶液降至室温，离心收集沉淀，干燥，得叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物橙色固体53mg，收率62%。

[0056] 应用例

[0057] 分别将多钼氧簇（[(C4H9)4N]3(MnMo6O18)[(OCH2)3CNH2]2）、去氢胆酸-多钼氧簇杂化物和实施例1制备的叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物制备成20、40、60、100、150和200μg/mL的乙醇储备溶液。

[0058] 将人体乳腺癌细胞系(MCF-7)以胰蛋白酶进行酶化后，使其在100μL的细胞媒体溶液中过夜培养。以100μL上述各储备溶液代替原始细胞媒体溶液继续培养24h。移除储备溶液，将细胞转移到细胞媒体溶液中孵化2h，以2mg/mL钙黄绿素将细胞染色30min，在荧光显微镜下检测细胞的存活率。

[0059] 图8给出了上述体外细胞毒性实验的细胞相对存活率。根据图8结果显示，多钼氧簇自身抗肿瘤细胞的无效性，说明了其直接作为无机药物很难被肿瘤细胞所吸收，以达到杀死人体乳腺癌细胞的目的。去氢胆酸-多钼氧簇杂化物对人体乳腺癌细胞具有一定的杀死效果，但效果不是很明显，说明杂化物中去氢胆酸的引入，有助于提高肿瘤细胞对杂化物的吸收量。相对于多钼氧簇和去氢胆酸-多钼氧簇杂化物，叶酸包裹去氢胆酸-多钼氧簇-芘杂化物呈现出明显增强的毒杀人体乳腺癌细胞活性，其显示的对人体乳腺癌细胞明显增强的效果，说明通过去氢胆酸、芘、叶酸基团和多钼氧簇之间的协同作用，可以显著提高杂化物杀死肿瘤细胞的效果，最终达到降低给药量的目的。