一种酶活提高的乙醇脱氢酶突变体及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种酶活提高的乙醇脱氢酶突变体及其制备方法与应用，属于生物医药及化工领域。本发明通过优化乙醇脱氢酶活性位点附近氨基酸序列，得到乙醇脱氢酶突变体，其活性最高可提高36％。应用这种酶活提高的乙醇脱氢酶突变体时，可以大幅度降低转化过程中酶的用量，从而在大规模制备S‑N‑叔丁氧羰基‑3‑羟基哌啶时可有效降低生产成本，产生显著的经济效益。

权利要求

1.一种酶活提高的乙醇脱氢酶突变体，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的乙醇脱氢酶的第286位的苯丙氨酸突变为亮氨酸L，或者第294位的酪氨酸突变为苯丙氨酸F。

2.一种制备权利要求1所述乙醇脱氢酶突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：通过PCR或基因合成的方法获得编码野生型乙醇脱氢酶的基因的全序列，以全序列为模板，通过定点突变对乙醇脱氢酶野生型基因进行突变，获得乙醇脱氢酶突变体。

3.一种制备S-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法，其特征在于，以权利要求1所述乙醇脱氢酶突变体或含有所述乙醇脱氢酶突变体的细胞为催化剂，以N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮为底物，在辅因子及氢供体的存在下制备S-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述辅因子是NADP或NAD。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氢供体是异丙醇。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，制备反应在pH7.0～9.0的水相缓冲液中进行，温度为25℃～45℃。

说明书

一种酶活提高的乙醇脱氢酶突变体及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种酶活提高的乙醇脱氢酶突变体及其制备方法与应用，属于生物医药及化工领域。

背景技术

[0002] 乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH，E.C.1.1.1.1)也称酮还原酶(keto-reductase)，广泛存在于植物组织、微生物、人和哺乳动物中，以NAD+、NADP+或PQQ为辅酶，可逆的催化氧化短链醇、芳香醇等为相应的醛类或酮类，是一类重要的氧化还原酶。目前已对多种微生物例如超高温好氧古细菌(Hyperthermophilic)、梭菌属(Clostridium beijerincki)、硫化叶菌属(Sulfolobus solfataricus)、假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、醋菌属(Acetobacter pasteurianus)、乳酸菌(Lactobacillus brevis)、红球菌属(Rhodococcus ruber)来源的乙醇脱氢酶进行了深入研究。研究发现，与其他来源的乙醇脱氢酶相比，来源于R.ruber DSM 44541的乙醇脱氢酶具有较强的耐有机溶剂尤其是丙酮及异丙醇的特性，这种特性使得底物溶解性有较大的提高。并且，丙酮及异丙醇可作为乙醇脱氢酶催化的醛酮互变的共底物用于辅因子的再生。

[0003] 很多哌啶类衍生物具有抗菌、麻醉、抗肿瘤、治疗老年痴呆症、糖尿病及病毒感染(包括AIDS)等多种药理活性，其中S-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶是一种具有手性结构的重要中间体，被广泛应用于镇痛、抗精神病和抗肿瘤等药物的合成。该化合物作为关键中间体用于合成选择性抑制布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)的抑制剂依鲁替尼(Ibrutinib)。目前合成S-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法分为化学转化法和生物催化法。化学转化法包括消旋体的拆分及全合成两种方法，但是都存在价格昂贵，收率低等缺点，因此现在制备(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法普遍采用生物催化的方法。生物催化法则需要高活力的酶。

发明内容

[0004] 本发明要解决的一个技术问题是提供一种酶活提高的乙醇脱氢酶突变体，是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的乙醇脱氢酶的第54位的酪氨酸，或者第286位的苯丙氨酸，或者第294位的酪氨酸中的一个或者多个进行突变。

[0005] 在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第54位的酪氨酸突变为色氨酸W。

[0006] 在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第286位的苯丙氨酸突变为亮氨酸L。

[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将294位的酪氨酸突变为苯丙氨酸F。

[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、4、5所示。

[0009] 本发明要解决的另一个技术问题是提供获得上述乙醇脱氢酶突变体的方法，包括如下步骤：

[0010] 通过PCR或基因合成的方法获得编码野生型乙醇脱氢酶的基因的全序列，以全序列为模板，通过定点突变对乙醇脱氢酶野生型基因进行突变，获得乙醇脱氢酶突变体。

[0011] 本发明要解决的另一个技术问题是应用SEQ ID NO.3至5任一所述的乙醇脱氢酶突变体或含有SEQ ID NO.3至5任一所述的乙醇脱氢酶突变体的细胞制备S-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法，包括如下步骤：

[0012] 以SEQ ID NO.3至5任一所述乙醇脱氢酶突变体为催化剂，以N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮为底物，在辅因子及氢供体的存在下制备S-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶。

[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述辅因子是NADP或NAD。

[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述氢供体是异丙醇。

[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述制备反应在pH7.0～9.0的水相缓冲液中进行，温度为25℃～45℃。

[0016] 本发明的有益效果：通过优化乙醇脱氢酶活性位点附近氨基酸序列，得到SEQ ID NO.3至5所示乙醇脱氢酶突变体，其活性最高比野生型提高了36％。应用这种酶活提高的乙醇脱氢酶突变体时，可以大幅度降低转化过程中酶的用量，从而在大规模制备S-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶时可有效降低生产成本，产生显著的经济效益。

附图说明

[0017] 图1为野生型乙醇脱氢酶结构；

[0018] 图2为实施例3中野生型乙醇脱氢酶反应22小时后得到产物HPLC图；

[0019] 图3为实施例3中乙醇脱氢酶突变体KRED(ADH)_F286L反应22小时后得到产物HPLC图；

[0020] 图4为实施例3中乙醇脱氢酶突变体反应22小时后得到产物转化率比较图；

[0021] 图5为实施例4产物HNMR图。

具体实施方式

[0022] 产物HPLC定量检测方法、条件：

[0023] 表A

[0024]

[0025] 产物手性检测方法、条件：

[0026] 表B

[0027]

[0028] 实施例1野生型乙醇脱氢酶的获得

[0029] 全基因合成SEQ ID NO.2所示野生型乙醇脱氢酶基因，并根据全基因序列设计以下引物：

[0030] PCR上游引物：CTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAAGCCGTCCAGTACACC

[0031] PCR下游引物：GGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCA TCAGGGAACCACCACGCC

[0032] 表1PCR反应体系

[0033]试剂 用量/μl
PrimerStarPremix 25
PrimerFF 1
PrimerRR 1
DNAtemplate 1
ddH2O 22

[0034] PCR反应条件如下：

[0035] 98℃1min，98℃10s、55℃5s、72℃5s/kbp，30cycles，16℃。

[0036] PCR扩增野生型乙醇脱氢酶基因序列；

[0037] 同时对pET21a载体片段进行PCR处理：

[0038] PCR上游引物：ATGTATATCTCCTTCTTAAAG

[0039] PCR下游引物：TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGG

[0040] PCR体系同表1；PCR反应条件如下：

[0041] 98℃1min，98℃10s、55℃5s、72℃5s/kbp，30cycles，16℃

[0042] 胶回收PCR获得的带突变位点的基因片段及pET21a载体片段，测定浓度后按照基因片段比载体片段1:1质量比共转化DH5a菌株。使其在菌体细胞内完成同源重组从而将带野生型乙醇脱氢酶基因的核酸片段插入pET-21a载体中得到pET-21a-KRED。涂板挑取阳性菌落，在试管中过夜培养，提取质粒保存并取样送测序。

[0043] 将测序正确的质粒转化BL21(DE3)T1R菌株，挑取转化正确的菌落测试表达和保存作为生产菌种。

[0044] 培养基：

[0045] LB培养基：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、pH7.0。

[0046] 固体培养基在此基础上添加2％琼脂粉。

[0047] 获得工程菌株后，接种100ml三角摇瓶过夜培养，然后按照1：50接种1000ml培养瓶，37℃220rpm培养至OD600约为0.8，降温至16℃，添加IPTG(最终浓度为1mM)，培养10h，离心洗涤收集菌体。

[0048] 实施例2乙醇脱氢酶突变体的获得

[0049] 根据乙醇脱氢酶的三维结构(PDB:2XAA)，乙醇脱氢酶活性中心附近氨基酸包括F43、M47、Q51、A53、Y54、L119、A273、F281、F282、F286、Y294、W295。由于活性中心附近的氨基酸改变可能会显著影响酶活性，以Q51、A53、Y54、A273、F286、Y294氨基酸位点为例对野生型乙醇脱氢酶进行了定点突变。根据突变位点设计如表2所列引物。

[0050] 表2定点突变引物序列

[0051]引物名称 引物序列
KRED(ADH)_Q51M FF CCGGCGGCGATGTACGCCTAC
KRED(ADH)_Q51M RR GTAGGCGTACATCGCCGCCGG
KRED(ADH)_Q51L FF CCGGCGGCGCTGTACGCCTAC
KRED(ADH)_Q51L RR GTAGGCGTACAGCGCCGCCGG
KRED(ADH)_A53L FF GCGCAGTACCTCTACGGCCTG
KRED(ADH)_A53L RR CAGGCCGTAGAGGTACTGCGC
KRED(ADH)_A53M FF GCGCAGTACATGTACGGCCTG
KRED(ADH)_A53M RR CAGGCCGTACATGTACTGCGC
KRED(ADH)_Y54F FF CAGTACGCCTTCGGCCTGCCG
KRED(ADH)_Y54F RR CGGCAGGCCGAAGGCGTACTG
KRED(ADH)_Y54W FF CAGTACGCCTGGGGCCTGCCG
KRED(ADH)_Y54W RR CGGCAGGCCCCAGGCGTACTG
KRED(ADH)_A273L FF GGCATCCACCTCGGCGCACAC
KRED(ADH)_A273L RR GTGTGCGCCGAGGTGGATGCC
KRED(ADH)_F286L FF ATGATCCCGTTAGGCGCCTCC
KRED(ADH)_F286L RR GGAGGCGCCTAACGGGATCAT
KRED(ADH)_F286L FF ATGATCCCGTTAGGCGCCTCC
KRED(ADH)_F286L RR GGAGGCGCCTAACGGGATCAT
KRED(ADH)_Y294F FF GTGACCCCGTTCTGGGGCACC
KRED(ADH)_Y294F RR GGTGCCCCAGAACGGGGTCAC
KRED(ADH)_Y294L FF GTGACCCCGTTATGGGGCACC
KRED(ADH)_Y294L RR GGTGCCCCATAACGGGGTCAC

[0052] 表3PCR反应体系

[0053]试剂 用量/μl
PrimerStar Premix 25
Primer FF 1
Primer RR 1
DNA template 1
ddH2O 22

[0054] PCR反应条件如下：

[0055] 98℃1min，98℃10s、55℃5s、72℃5s/kbp，30cycles，16℃，

[0056] 以pET-21a-KRED为模板，PCR扩增表4、5所列5’端(a)及3’端(b)两片段：

[0057] 表4a片段PCR

[0058]

[0059] 表5b片段PCR

[0060]

[0061] 胶回收5’端及3’端片段。

[0062] 以5’端及3’端片段为模板，PCR扩增表6所列带突变位点的基因片段：

[0063] 表6带突变位点的基因片段

[0064]

[0065] 表7PCR反应体系

[0066]试剂 用量/μl
PrimerStar Premix 25
Primer FF 1
Primer RR 1
DNA template A片段0.5ul+B片段0.5μl
ddH2O 22

[0067] PCR反应条件如下：

[0068] 98℃1min；98℃10s、55℃5s、72℃5s/kbp,30cycles；16℃。

[0069] 同时对pET21a载体片段进行PCR处理：

[0070] PCR上游引物：ATGTATATCTCCTTCTTAAAG

[0071] PCR下游引物：TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGG

[0072] PCR体系同表2；PCR反应条件如下：

[0073] 98℃1min，98℃10s、55℃5s、72℃5s/kbp，30cycles，16℃。

[0074] 胶回收PCR获得的带突变位点的基因片段及pET21a载体片段，测定浓度后按照基因片段比载体片段1:1质量比共转化DH5a菌株。使其在菌体细胞内完成同源重组从而将带突变位点的核酸片段插入pET-21a载体中。涂板挑取阳性菌落，在试管中过夜培养，提取质粒保存并取样送测序。

[0075] 将测序正确的质粒转化BL21(DE3)T1R菌株，挑取转化正确的菌落测试表达和保存作为生产菌种。

[0076] 培养基：

[0077] LB培养基：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、pH7.0。

[0078] 固体培养基在此基础上添加2％琼脂粉。

[0079] 获得工程菌株后，接种100ml三角摇瓶过夜培养，然后按照1：50接种1000ml培养瓶，37℃220rpm培养至OD600约为0.8，降温至16℃，添加IPTG(最终浓度为1mM)，培养10h，离心洗涤收集菌体。

[0080] 实施例3乙醇脱氢酶的活性测试

[0081] 将上述收集菌体用50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)重悬至3.5g/L,使用高压匀浆细胞破碎仪15000Psi冰水浴高压匀浆破碎2次，得到细胞裂解液。

[0082] 酶反应活性体系(5ml反应体系)包括：N-叔丁氧羰基-哌啶酮0.1g/ml，异丙醇10％(v/v)，Na2HPO4·12H2O 24mg/ml，NaH2PO4·2H2O 6.6mg/ml，MgCl21mg/ml，辅酶0.4mg/ml，细胞裂解液30％(v/v)。

[0083] 置于恒温摇床30℃200rpm反应；反应15h后，补异丙醇0.5ml；继续反应至总反应时间为22h。反应结束后取样加入2倍体积乙腈抽提，离心20min取上清，0.45μm滤膜过滤，HPLC检测，计算转化率。酶活性定义为30摄氏度反应22h后HPLC检测产物N-叔丁氧羰基-哌啶酮的峰面积占底物峰面积的百分比。突变后的乙醇脱氢酶活性比野生型提高了36％，光学纯度e.e％为100％。

[0084] 实施例4应用乙醇脱氢酶突变体转化N-叔丁氧羰基-哌啶酮

[0085] 将KRED(ADH)-F286L突变菌体用50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)重悬至50g/L，使用高压匀浆细胞破碎仪15000Psi冰水浴高压匀浆破碎2次，得到细胞裂解液。

[0086] 将N-叔丁氧羰基-哌啶酮(5.0g、0.025mol)溶于5mL异丙醇30℃静置，称取Na2HPO4.12H2O(1.2g，0.003mol)，NaH2PO4.2H2O(0.33g，0.002mol)加入29ml水溶解，配成磷酸缓冲液。量取15mL细胞裂解液酶液，加入50mg MgCl2.6H2O，40mg NADP。将磷酸缓冲液，酶液依次加入底物中，2N/L NaOH溶液调节pH至7-8，加热至30℃左右，并每四小时监测并调节pH。反应54h。HPLC监测N-叔丁氧羰基-哌啶酮小于0.5％。将反应液用硅藻土过滤，滤饼EA(25mL×3)洗三次，滤液同体积EA萃取三次。合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋干得黄色油状物4.5g，收率89.1％。产物的结构鉴定数据为H-NMR(400MHz,DMSO):δ＝1.27-1.30[m,2H,-CH2],1.40[s,9H,-(CH)3],1.61-1.82[m,2H,-CH2]2.64-2.78[m,2H,-CH2],3.37-3.39[m,1H,-CH],3.59-3.77[m,2H,-CH2],4.84-4.85[d,1H,-OH]。

[0087] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。