一种柠檬酸发酵的方法

摘要

本发明涉及一种柠檬酸发酵的方法，以高粱、木薯为原料，经粉碎、调浆后液化、板框压滤，种子罐中加入高粱粉液化液或木薯粉液化液并加入一定量的无机氮或/和有机氮，另外将剩余的高粱粉液化液和木薯粉液化液直接或经板框过滤后打入发酵罐并加入一定量的无机氮或/和有机氮后消毒、降温后将种子罐培养液移至发酵罐开始发酵，采用本发明的技术方案，既能保证原料非转基因，又能拓宽原料来源，降低原料风险和成本，进一步增加企业的经济效益和提升企业的行业竞争力。

权利要求

1.一种柠檬酸发酵的方法，其特征在于：其具体步骤为：

（1）将高粱和木薯分别粉碎制备高粱粉和木薯粉，其中高粱占10-100wt%，木薯占0-

90wt%；

（2）将高粱粉加水调浆，调浆后浓度为15-35wt%，调节pH5.5 6.5，并向其中加入每克高~粱粉10-25个酶单位的中性蛋白酶、5-20个酶单位的纤维素酶和5 25个酶单位的耐高温α-~淀粉酶，50-55℃保温30-120分钟；

将木薯粉加水调浆，调浆后浓度为15-35wt%，调节pH5.5 6.5，并向其中加入每克木薯~粉5 15个酶单位的耐高温α-淀粉酶；

~

（3）将调浆后的高粱粉浆和木薯粉浆分别液化得到高粱粉液化液和木薯粉液化液，液化液DE值在10～85%之间；

（4）将步骤（3）中占最终发酵液总体积5-10%的高粱粉液化液或木薯粉液化液打入种子罐中，补加占最终发酵液总体积4.97-9.995%的80-90℃热水，加入占最终发酵液体积

0.005-0.03%的无机氮或/和有机氮，在80-121℃消毒15-60分钟，降温至28-40℃，接入黑曲霉孢子悬浮液进行种子液培养，其中孢子接入量为2.0-6.0*105个/mL，培养过程中搅拌转速为50-200rpm，罐压为0.03-0.15MPa，通气量为1:0.05-0.4，28-40℃培养20-35h即可移入发酵罐中；

（5）将步骤（3）中剩余的高粱粉液化液和木薯粉液化液直接或经板框过滤打入到发酵罐中至发酵液总体积的78.5-89.5%，之后再加入占发酵液总体积的0.5-1.5%的无机氮或/和有机氮，80-121℃消毒15-60分钟后，降温至35-40℃；

（6）将步骤（4）培养成熟的种子培养液移至发酵罐中，控制发酵条件如下：搅拌转速为

50-200rpm，罐压为0.03-0.15MPa，通气比为1:0.05-0.4，发酵温度35-40℃，发酵直至发酵终了，之后即可提取发酵液中的柠檬酸；

步骤(3)中液化具体过程为：将调浆后的高粱粉浆和木薯粉浆分别输送至不同的喷射液化装置经过两次连续喷射液化工艺进行液化，其中连续两次喷射液化工艺中一次喷射温度控制在95-105℃，一次喷射后在液化层流罐中维持1-8小时，二次喷射温度控制在120-

135℃，二次喷射后在二次液化搅拌罐中维持1-8个小时，液化最终液化液DE值在10～85%之间，分别获得高粱粉液化液和木薯粉液化液。

2.根据权利要求1所述的柠檬酸发酵的方法，其特征是，步骤（1）所述的高粱和木薯粉碎后60目的透过率在70%以上。

3.根据权利要求1所述的柠檬酸发酵的方法，其特征是，步骤(2)所述的高粱粉和木薯粉调浆后通过添加pH调节剂对其pH进行调节，所述的pH调节剂为氢氧化钠或纯碱或盐酸或硫酸。

4.根据权利要求1所述的柠檬酸发酵的方法，其特征是，步骤(4)和(5)所述的无机氮选自硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸氢二铵、氨水、柠檬酸铵中的一种或多种，所述的有机氮选自尿素、花生饼粉、蚕蛹粉、蛋白胨中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的柠檬酸发酵的方法，其特征是，步骤（6）所述的柠檬酸的提取使用钙盐法或色谱法。

6.根据权利要求1所述的柠檬酸发酵的方法，其特征是，步骤（6）中发酵终了的标准为：发酵罐正常产酸每小时不超过0.1%，还原糖不超过1.0%。

说明书

一种柠檬酸发酵的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种柠檬酸发酵的方法，尤其涉及一种以高粱和木薯混料发酵生产柠檬酸的方法。

背景技术

[0002] 柠檬酸，学名2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸，分子式C6H8O7(无水物)，是一种广泛地应用于食品，医药和化工领域的有机酸。随着经济的发展，各行各业对柠檬酸的需求量将稳步上升，当然各企业面对的挑战与机遇也越来越多。主要用于食品工业、医药业、化学工业，并且在电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域中也有十分广阔的应用。

[0003] 目前，转基因食品的研发迅猛发展，产品品种及产量也成倍增长，转基因作为一种新兴的生物技术手段，它的不成熟和不确定性，使得转基因食品的安全性成为人们关注的焦点，而玉米则是转基因农产品中的重点区域，而柠檬酸工业生产主要采用以玉米为原料经深层发酵获得，因此受限于玉米作为主要的粮食作物和转基因的风险，存在原料风险和成本极高的问题。在申请号CN201210347960.6中已叙述了一种利用高粱粉发酵生产柠檬酸的方法，能大幅度减少玉米的使用，但其在种子罐培养基和发酵罐培养基中还加入了部分玉米粉液化液。因此，其依然难以解决对玉米原料的依赖，无法做到完全的非粮非转基因原料发酵获得柠檬酸，而如何能够实现完全的非粮非转基因发酵获得柠檬酸成为现有技术亟待解决的问题之一。

发明内容

[0004] 本发明提供的是一种柠檬酸发酵的方法，采用非粮非转基因原料发酵生产柠檬酸，拓宽了发酵原料来源，有效降低原料风险和成本，解决了目前制约柠檬酸生产企业原料来源和原料成本高的问题，同时确保国内外客户对产品非转基因的要求，为柠檬酸发酵行业的发展提供了全新的方法和思路。

[0005] 本发明所采用的技术方案如下：

[0006] 一种柠檬酸发酵的方法，其具体步骤为：

[0007] (1)将高粱和木薯分别粉碎制备高粱粉和木薯粉，其中高粱占10-100wt％，木薯占0-90wt％；

[0008] (2)将高粱粉加水调浆，调浆后浓度为15-35wt％，调节pH5.5～6.5，并向其中加入每克高粱粉10-25个酶单位的中性蛋白酶、0-20个酶单位的纤维素酶和5～25个酶单位的耐高温α-淀粉酶，50-55℃保温30-120分钟；

[0009] 将木薯粉加水调浆，调浆后浓度为15-35wt％，调节pH5.5～6.5，并向其中加入每克木薯粉5～15个酶单位的耐高温α-淀粉酶；

[0010] (3)将调浆后的高粱粉浆和木薯粉浆分别液化得到高粱粉液化液和木薯粉液化液，液化液DE值在10～85％之间；

[0011] (4)将步骤(3)中占最终发酵液总体积5-10％的高粱粉液化液或木薯粉液化液打入种子罐中，补加占最终发酵液总体积4.97-9.995％的80-90℃热水，加入占最终发酵液体积0.005-0.03％的无机氮或/和有机氮，在80-121℃消毒15-60分钟，降温至28-40℃，接入黑曲霉孢子悬浮液进行种子液培养，其中孢子接入量为2.0-6.0*105个/mL，培养过程中搅拌转速为50-200rpm，罐压为0.03-0.15MPa，通气量为1:0.05-0.4，28-40℃培养20-35h即可移入发酵罐中；

[0012] (5)将步骤(3)中剩余的高粱粉液化液和木薯粉液化液直接或经板框过滤打入到发酵罐中至发酵液总体积的78.5-89.5％，之后再加入占发酵液总体积的0.5-1.5％的无机氮或/和有机氮，80-121℃消毒15-60分钟后，降温至35-40℃；

[0013] (6)将步骤(4)培养成熟的种子培养液移至发酵罐中，控制发酵条件如下：搅拌转速为50-200rpm，罐压为0.03-0.15MPa，通气比为1:0.05-0.4，发酵温度35-40℃，发酵直至发酵终了，之后即可提取发酵液中的柠檬酸。

[0014] 其中步骤(1)所述的高粱和木薯粉碎后60目的透过率在70％以上；

[0015] 步骤(2)所述的高粱粉和木薯粉调浆后通过添加pH调节剂对其pH进行调节，所述的pH调节剂为氢氧化钠或纯碱或盐酸或硫酸；

[0016] 步骤(2)中纤维素酶用量为每克高粱粉5-20个酶单位。

[0017] 步骤(3)中液化具体过程为：将调浆后的高粱粉浆和木薯粉浆分别输送至不同的喷射液化装置经过两次连续喷射液化工艺进行液化，其中连续两次喷射液化工艺中一次喷射温度控制在95-105℃，一次喷射后在液化层流罐中维持1-8小时，二次喷射温度控制在120-135℃，二次喷射后在二次液化搅拌罐中维持1-8个小时，液化最终液化液DE值在10～
85％之间，分别获得高粱粉液化液和木薯粉液化液；

[0018] 步骤(4)和(5)所述的无机氮选自硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸氢二铵、氨水、柠檬酸铵等中的一种或多种，所述的有机氮选自尿素、花生饼粉、蚕蛹粉、蛋白胨等中的一种或多种；

[0019] 步骤(6)所述的柠檬酸的提取使用钙盐法或色谱法；

[0020] 步骤(6)中发酵终了的标准为：发酵罐正常产酸每小时不超过0.1％，还原糖不超过1.0％。

[0021] 本发明与现有技术的最大区别就在于使用了高粱和木薯的混合原料，且高粱占10-100wt％，木薯占0-90wt％，为本领域首次采用完全非粮非转基因作物作为原料发酵制备柠檬酸，其中高粱主要养分：粗脂肪3％、粗蛋白8～11％、粗纤维2～3％、淀粉65～70％，而蛋白质在籽粒中的含量一般是9～11％，其中约有0.28％的赖氨酸，0.11％的蛋氨酸，
0.18％的胱氨酸，0.10％的色氨酸，0.37％的精氨酸，0.24％的组氨酸，1.42％的亮氨酸，
0.56％的异亮氨酸，0.48％的苯丙氨酸，0.30％的苏氨酸，0.58％的缬氨酸。高粱籽粒中亮氨酸和缬氨酸的含量略高于玉米，而精氨酸的含量又略低于玉米。其他各种氨基酸的含量与玉米大致相等。高粱蛋白质含量高于玉米，但是品质不佳，缺乏赖氨酸和色氨酸，蛋白质消化率低，且由于高粱醇溶蛋白质的分子间交联较多，而且蛋白质与淀粉间存在很强的结合键，致使酶难以进入分解，从而使其中的淀粉难以得到利用，而这正是现有技术中难以采用高粱作为原料生产柠檬酸的原因之一，而本发明的发明人则利用同时添加中性蛋白酶和耐高温α-淀粉酶的方式来克服这一问题，其中中性蛋白酶的加入能有效将蛋白水解，使蛋白结合的淀粉充分溶出，而控制每克高粱粉10～25个酶单位的中性蛋白酶的用量，可以充分保证蛋白的水解，之后对应加入适量的耐高温α-淀粉酶能使从蛋白交联中脱出的淀粉充分液化，提高淀粉的收率；同时水解后的蛋白质能够提供足够的含氮物质，这部分物质可以作为有机氮应用到后续的发酵工艺中，从而降低有机氮的添加量，提高原料的利用率，降低发酵的总体成本。

[0022] 高粱中纤维素含量较高，且具有不溶性，在生产中不易被转化应用，该发明则利用添加纤维素酶将纤维素水解转化为可利用的葡萄糖。而优选控制每克高粱粉5-20个酶单位的纤维素酶的用量，与加入的中性蛋白酶、耐高温α-淀粉酶有协同作用，可以充分保证纤维素的水解，纤维素酶的添加可以增加原料的利用率，并对柠檬酸的质量有所提升。

[0023] 木薯并非是营养平衡的食物，属于典型的非粮作物，木薯干物质中大部分是淀粉，在鲜薯中淀粉约含25％～30％，在薯干中约含80％，因此可以作为柠檬酸的发酵的原料之一，但是由于木薯块根含氮量少，在后续的发酵过程中需要添加较多的外来氮源，这样就会需要较多的有机氮和无机氮添加，这也是现有技术中利用木薯作为发酵原料时必须添加玉米等粮食作物补充氮源和碳源的原因，而这也限制了木薯作为原料生产柠檬酸技术的发展。

[0024] 正是基于这种原因，发明人确定了使用高粱和木薯的混合原料，且限定高粱占10-100wt％，木薯占0-90wt％，在这一重量比下，采用耐高温α-淀粉酶液化，可以确保生产柠檬酸所需的碳源，同时通过高粱和木薯提供部分的有机氮，从而降低外来氮源的用量，确保发酵过程的需要；而如果木薯粉用量过高，则会遇到与现有技术同样的外加氮源问题，因此发明人将其作为高粱的有效补充使用。

[0025] 将粉碎后的高粱粉和木薯粉加入水进行调浆，调浆后质量分数为15-35wt％。调浆浓度过低会大大增加后期液化的难度，同时耗水量增大会增加后续生产能耗，而如果调浆浓度过高会导致体系过于粘稠，不利于后期的液化；由于pH过高或过低都会使得淀粉酶的活性受到抑制，不利于后期的液化，导致混合料中残留的淀粉较多，造成部分的淀粉损失，引起资源的浪费，所以发明人选择通过添加化学品氢氧化钠、纯碱、盐酸、硫酸等对高粱粉调浆的pH进行调节，调节后pH5.5～6.5，在这一pH条件下耐高温α-淀粉酶的活性可以得到保障。

[0026] 如上所述调浆后高粱粉浆中加入中性蛋白酶，主要是因为高粱醇溶蛋白质的分子间交联较多，而且蛋白质与淀粉间存在很强的结合键，直接通过液化难以将淀粉完全释放出来，通过添加蛋白酶能有效破坏蛋白与淀粉的结合，充分释放淀粉，提高糖的得率。中性蛋白酶用量过大会增加生产成本，用量过低中性蛋白酶与高粱粉中的底物蛋白结合反应的几率小，蛋白的水解效果不佳，影响蛋白与淀粉的分离，淀粉的收率偏低；而如果与纤维素酶配合使用，利用中性蛋白酶、纤维素酶与耐高温α-淀粉酶的协同作用，使得蛋白和纤维素的水解效果更好，有利于提高淀粉的收率。

[0027] 高粱粉浆和木薯粉浆经过两次连续喷射液化，减少非发酵性糖类的产生，第一次喷射温度控制在95-105℃，一次喷射后在液化层流罐中维持1-8小时，二次喷射温度控制在120-135℃，二次喷射后在二次液化搅拌罐中维持1-8个小时，两次液化后液化液的DE值均控制在10～85％之间，分别获得高粱粉液化液和木薯粉液化液，本发明采用二次喷射的方式，主要是利用二次喷射的高温效果，能使未被酶解的蛋白变性，便于过滤，同时使淀粉颗粒膨胀溶出，提高淀粉酶的作用效果，进而提高淀粉收率。

[0028] 取上述占最终发酵液总体积5-10％的高粱粉液化液或木薯粉液化液打入种子罐中，补加占最终发酵液总体积4.97-9.995％的80-90℃热水，加入占最终发酵液体积0.005-0.03％的无机氮或/和有机氮，在80-121℃消毒15-60分钟，降温至28-40℃，接入黑曲霉孢子悬浮液进行种子液培养；本过程中，补加热水是调节种子罐培养基的碳氮比以满足种子培养的要求，若糖度过高菌种生产过旺，移入发酵罐中会过早进入衰亡期而影响柠檬酸产量；总糖度过低菌种生长不壮实，移入发酵罐产酸偏慢而发酵周期偏长；加入氮源是为了保证菌种生长的需要，加入的无机氮为硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、磷酸氢二铵、氨水、柠檬酸铵等中的一种或多种，有机氮为尿素、花生饼粉、蚕蛹粉、蛋白胨等中的一种或多种。在该步骤中，孢子接入量为2.0-6.0*105个/mL，所采用的黑曲霉菌株为黑曲霉Co827。

[0029] 将剩余的高粱粉液化液和木薯粉液化液直接或经板框过滤打入到发酵罐中至发酵液总体积的78.5-89.5％，之后再加入占发酵液总体积的0.5-1.5％的无机氮或/和有机氮，80-121℃消毒15-60分钟后，降温至35-40℃；本过程中，为保证发酵过程菌种生长需要，加入无机氮为硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、磷酸氢二铵、尿素、氨水、柠檬酸铵等中的一种或多种，有机氮为尿素、花生饼粉、蚕蛹粉、蛋白胨等中的一种或多种。

[0030] 上述内容中高粱粉液化液和木薯粉液化液可直接打入到发酵罐中，也可经板框过滤后打入到发酵罐中，优先选择后者，这是由于过滤后发酵液粘度降低，溶氧传质较好，节约能源，有利于传质和溶氧，提升发酵液质量；但是即使不经过过滤，也可以应用于本发明的技术方案中。

[0031] 之后即可将步骤(4)培养成熟的种子培养液移至上述发酵罐中，35-40℃通风搅拌发酵至发酵终了，这一过程中，由于温度过低，菌种生长代谢速度缓慢，导致发酵周期过长；温度过高会对菌种生长、代谢产生不利影响，导致产生其他的杂酸、代谢物质，给后续的提取增加负担，所以发酵温度控制在35-40℃。当发酵罐正常产酸每小时不超过0.1％，还原糖不超过1.0％即可终止发酵。最终的发酵液可以采用常用的钙盐法提取其中的柠檬酸。

[0032] 本发明以高粱和木薯为原料发酵生产柠檬酸，与目前的玉米发酵生产柠檬酸相比，既可以降低原料风险，又能确保产品非转基因。相关技术指标对比情况如下表所示：

[0033] 本发明混料发酵技术与原有玉米发酵技术指标对比情况

[0034]

[0035] 可见本发明的技术能显著降低企业的生产成本和产品风险，提高企业的经济效益和产品竞争力，拓宽了发酵原料的来源，有效降低原料风险和成本，解决了目前制约柠檬酸生产企业原料来源和成本问题，同时确保产品非转基因，为柠檬酸发酵行业的发展提供了全新的方法和思路。

具体实施方式

[0036] 本实施例中所采用的黑曲霉菌株均为黑曲霉Co827。

[0037] 实施例1：

[0038] 一种柠檬酸发酵的方法，其具体步骤为：

[0039] 首先将高粱和木薯粉碎制备高粱粉和木薯粉，其中高粱占90wt％，木薯占10wt％，高粱粉和木薯粉60目的透过率在70％以上；

[0040] 将高粱粉加水调浆，使其浓度达到25wt％，调节pH为5.8，并向其中加入每克高粱粉15个酶单位的中性蛋白酶、12个酶单位的纤维素酶和10个酶单位的耐高温α-淀粉酶；

[0041] 将木薯粉加水调浆，使其浓度达到25wt％，调节pH为5.8，并向其中加入每克木薯粉7个酶单位的耐高温α-淀粉酶；

[0042] 将调浆后的高粱粉浆和木薯粉浆分别输送至不同的喷射液化装置经过两次连续喷射液化工艺进行液化，其中连续两次喷射液化工艺中一次喷射温度控制在95℃，一次喷射后在液化层流罐中维持2小时，二次喷射温度控制在125℃，二次喷射后在二次液化搅拌罐中维持2个小时，液化最终液化液DE值为15.4％，分别获得高粱粉液化液和木薯粉液化液；

[0043] 种子罐中打入占最终发酵液总体积的5％高粱粉液化液，补加占发酵液总体积6.99％的87℃热水，添加占发酵液总体积0.01％的硫酸铵作为无机氮源，随后升温至121℃消毒30分钟，降温至37℃后接入孢子，控制黑曲霉孢子浓度为2.0*105个/mL，通气比为1:
0.1，罐压为0.15MPa，搅拌转速为80rpm，培养28h即可移入发酵罐中；

[0044] 将上述剩余的高粱粉液化液和木薯粉液化液全部打入发酵罐中至发酵液总体积的86.5％，添加占发酵液总体积的0.5％的氨水和0.25％硫酸铵作为无机氮源，添加占发酵液总体积0.75％的棉籽粕粉为有机氮源；开启搅拌使转速为75rpm，升温至90℃消毒30分钟后降温至36℃；

[0045] 将培养成熟的种子液移至发酵罐中，通气比为1:0.25，罐压为0.05MPa，搅拌转速为100rpm，36℃条件下培养直至发酵终了，发酵终了的标准为：发酵罐正常产酸每小时不超过0.1％，还原糖不超过1.0％。在此条件下，共发酵58小时，产酸17.45％，转化率99.15％，发酵液送至提取车间采用钙盐法或色谱法提取发酵液中的柠檬酸。

[0046] 实施例2：

[0047] 一种柠檬酸发酵的方法，其具体步骤为：

[0048] 首先将高粱和木薯粉碎制备高粱粉和木薯粉，其中高粱占10wt％，木薯占90wt％，高粱粉和木薯粉60目的透过率在70％以上；

[0049] 将高粱粉加水调浆，使其浓度达到23wt％，调节pH为6.0，并向其中加入每克高粱粉12个酶单位的中性蛋白酶和15个酶单位的耐高温α-淀粉；

[0050] 将木薯粉加水调浆，使其浓度达到27wt％，调节pH为6.0，并向其中加入每克木薯粉10个酶单位的耐高温α-淀粉酶；

[0051] 将调浆后的高粱粉浆和木薯粉浆分别输送至不同的喷射液化装置经过两次连续喷射液化工艺进行液化，其中连续两次喷射液化工艺中一次喷射温度控制在97℃，一次喷射后在液化层流罐中维持1.5小时，二次喷射温度控制在128℃，二次喷射后在二次液化搅拌罐中维持3个小时，液化最终液化液DE值为23％，分别获得高粱粉液化液和木薯粉液化液；

[0052] 种子罐中打入占最终发酵液总体积的5％高粱粉液化液，补加占发酵液总体积4.98％85℃热水，添加占发酵液总体积0.01％的硫酸铵和0.01％的氨水作为无机氮源，随后升温至90℃消毒45分钟，降温至28℃后接入孢子，控制黑曲霉孢子浓度为6.0*105个/mL，通气比为1:0.12，罐压为0.10MPa，搅拌转速为80rpm，培养28h即可移入发酵罐中；

[0053] 将上述剩余的高粱粉液化液和木薯粉液化液打入发酵罐中至发酵液总体积的89％，添加占发酵液总体积的0.25％硫酸铵作为无机氮源，添加占发酵液总体积0.75％的尿素为有机氮源；开启搅拌使转速为75rpm，升温至90℃消毒60分钟后降温至37℃；

[0054] 将培养成熟的种子液移至发酵罐中，通气比为1:0.35，罐压为0.05MPa，搅拌转速为90rpm，37℃条件下培养直至发酵终了，发酵终了的标准为：发酵罐正常产酸每小时不超过0.1％，还原糖不超过1.0％。在此条件下，共发酵64小时，产酸17.36％，转化率98.63％，发酵液送至提取车间采用钙盐法或色谱法提取发酵液中的柠檬酸。

[0055] 实施例3：

[0056] 一种柠檬酸发酵的方法，其具体步骤为：

[0057] 首先将高粱和木薯粉碎制备高粱粉和木薯粉，其中高粱占65wt％，木薯占35wt％，高粱粉和木薯粉60目的透过率在70％以上；

[0058] 将高粱粉加水调浆，使其浓度达到30wt％，调节pH为5.5，并向其中加入每克高粱粉17个酶单位的中性蛋白酶和12个酶单位的耐高温α-淀粉；

[0059] 将木薯粉加水调浆，使其浓度达到30wt％，调节pH为5.5，并向其中加入每克木薯粉12个酶单位的耐高温α-淀粉酶；

[0060] 将调浆后的高粱粉浆和木薯粉浆分别输送至不同的喷射液化装置经过两次连续喷射液化工艺进行液化，其中连续两次喷射液化工艺中一次喷射温度控制在105℃，一次喷射后在液化层流罐中维持3小时，二次喷射温度控制在120℃，二次喷射后在二次液化搅拌罐中维持2.5个小时，液化最终液化液DE值为42％，分别获得高粱粉液化液和木薯粉液化液；

[0061] 种子罐中打入占最终发酵液总体积的5％木薯粉液化液，补加占发酵液总体积4.97％90℃热水，添加占发酵液总体积0.01％的硫酸铵和0.01％的柠檬酸铵作为无机氮源，添加占发酵液总体积0.01％的棉籽粕粉作为有机氮源，随后升温至121℃消毒30分钟，降温至36.5℃后接入孢子，控制黑曲霉孢子浓度为4.0*105个/mL，通气比为1:0.17，罐压为
0.12MPa，搅拌转速为90rpm，培养30h即可移入发酵罐中；

[0062] 将上述剩余的高粱粉液化液和木薯粉液化液打入发酵罐中至发酵液总体积的89％，添加占发酵液总体积的0.25％硫酸铵和作为无机氮源，添加占发酵液总体积0.75％的棉籽粕粉为有机氮源；开启搅拌使转速为75rpm，升温至90℃消毒30分钟后降温至36℃；

[0063] 将培养成熟的种子液移至发酵罐中，通气比为1:0.0.32，罐压为0.09MPa，搅拌转速为85rpm，36℃条件下培养直至发酵终了，发酵终了的标准为：发酵罐正常产酸每小时不超过0.1％，还原糖不超过1.0％。在此条件下，共发酵62小时，产酸17.41％，转化率98.36％，发酵液送至提取车间采用钙盐法或色谱法提取发酵液中的柠檬酸。

[0064] 实施例4：

[0065] 一种柠檬酸发酵的方法，其具体步骤为：

[0066] 首先将高粱和木薯粉碎制备高粱粉和木薯粉，其中高粱占75wt％，木薯占25wt％，高粱粉和木薯粉60目的透过率在70％以上；

[0067] 将高粱粉加水调浆，使其浓度达到27wt％，调节pH为6.5，并向其中加入每克高粱粉20个酶单位的中性蛋白酶和17个酶单位的耐高温α-淀粉；

[0068] 将木薯粉加水调浆，使其浓度达到35wt％，调节pH为6.5，并向其中加入每克木薯粉15个酶单位的耐高温α-淀粉酶；

[0069] 将调浆后的高粱粉浆和木薯粉浆分别输送至不同的喷射液化装置经过两次连续喷射液化工艺进行液化，其中连续两次喷射液化工艺中一次喷射温度控制在98℃，一次喷射后在液化层流罐中维持5小时，二次喷射温度控制在127℃，二次喷射后在二次液化搅拌罐中维持1.5个小时，液化最终液化液DE值为30.8％，分别获得高粱粉液化液和木薯粉液化液；

[0070] 种子罐中打入占最终发酵液总体积的3％的高粱粉液化液和5％的木薯粉液化液，补加占发酵液总体积7.98％85℃热水，添加占发酵液总体积0.02％的硫酸铵作为无机氮源，随后升温至110℃消毒35分钟，降温至36.5℃后接入孢子，控制黑曲霉孢子浓度为3.5*105个/mL，通气比为1:0.23，罐压为0.10MPa，搅拌转速为100rpm，培养32h即可移入发酵罐中；

[0071] 将上述剩余的高粱粉液化液和木薯粉液化液打入发酵罐中至发酵液总体积的83.5％，添加占发酵液总体积0.5％的棉籽粕粉为有机氮源；开启搅拌使转速为85rpm，升温至110℃消毒30分钟后降温至36℃；

[0072] 将培养成熟的种子液移至发酵罐中，通气比为1:0.36，罐压为0.07MPa，搅拌转速为150rpm，36℃条件下培养直至发酵终了，发酵终了的标准为：发酵罐正常产酸每小时不超过0.1％，还原糖不超过1.0％。在此条件下，共发酵60小时，产酸17.59％，转化率99.38％，发酵液送至提取车间采用钙盐法或色谱法提取发酵液中的柠檬酸。

[0073] 实施例5：

[0074] 一种柠檬酸发酵的方法，其具体步骤为：

[0075] 首先将高粱粉碎制备高粱粉，高粱粉60目的透过率在70％以上；

[0076] 将高粱粉加水调浆，使其浓度达到27wt％，调节pH为5.6，并向其中加入每克高粱粉20个酶单位的中性蛋白酶、15个酶单位的纤维素酶和20个酶单位的耐高温α-淀粉酶；

[0077] 将调浆后的高粱粉浆经过两次连续喷射液化工艺进行液化，其中连续两次喷射液化工艺中一次喷射温度控制在97℃，一次喷射后在液化层流罐中维持4.5小时，二次喷射温度控制在133℃，二次喷射后在二次液化搅拌罐中维持3个小时，液化最终液化液DE值为30.0％，获得高粱粉液化液；

[0078] 种子罐中打入占最终发酵液总体积的6％高粱粉液化液，补加占发酵液总体积6.99％的86℃热水，添加占发酵液总体积0.01％的硫酸铵作为无机氮源，随后升温至121℃消毒30分钟，降温至37℃后接入孢子，控制黑曲霉孢子浓度为3.0*105个/mL，通气比为1:
0.13，罐压为0.15MPa，搅拌转速为100rpm，培养27h即可移入发酵罐中；

[0079] 将上述剩余的高粱粉液化液全部打入发酵罐中至发酵液总体积的85.5％，添加占发酵液总体积的0.50％硫酸铵作为无机氮源，添加占发酵液总体积1.0％的棉籽粕粉为有机氮源；开启搅拌使转速为170rpm，升温至90℃消毒30分钟后降温至36℃；

[0080] 将培养成熟的种子液移至发酵罐中，通气比为1:0.37，罐压为0.1MPa，搅拌转速为170rpm，36℃条件下培养直至发酵终了，发酵终了的标准为：发酵罐正常产酸每小时不超过
0.1％，还原糖不超过1.0％。在此条件下，共发酵62小时，产酸17.32％，转化率98.97％，发酵液送至提取车间采用钙盐法或色谱法提取发酵液中的柠檬酸。

[0081] 实施例6：

[0082] 一种柠檬酸发酵的方法，其具体步骤为：

[0083] 首先将高粱和木薯粉碎制备高粱粉和木薯粉，其中高粱占85wt％，木薯占15wt％，高粱粉和木薯粉60目的透过率在70％以上；

[0084] 将高粱粉加水调浆，使其浓度达到35wt％，调节pH为5.5，并向其中加入每克高粱粉25个酶单位的中性蛋白酶、12个酶单位的纤维素酶和25个酶单位的耐高温α-淀粉；

[0085] 将木薯粉加水调浆，使其浓度达到15wt％，调节pH为5.5，并向其中加入耐高温α-淀粉酶，每克木薯粉5个酶单位的耐高温α-淀粉酶；

[0086] 将调浆后的高粱粉浆和木薯粉浆分别输送至不同的喷射液化装置经过两次连续喷射液化工艺进行液化，其中连续两次喷射液化工艺中一次喷射温度控制在97℃，一次喷射后在液化层流罐中维持2.5小时，二次喷射温度控制在120℃，二次喷射后在二次液化搅拌罐中维持3个小时，液化最终液化液DE值为23％，分别获得高粱粉液化液和木薯粉液化液；

[0087] 种子罐中打入占最终发酵液总体积的5％的高粱粉液化液补加占发酵液总体积6.995％90℃热水，添加占发酵液总体积0.0025％的硫酸铵和0.0025％氨水作为无机氮源，随后升温至121℃消毒30分钟，降温至36.5℃后接入孢子，控制黑曲霉孢子浓度为2.0*105个/mL，通气比为1:0.0.35，罐压为0.05MPa，搅拌转速为120rpm，培养35h即可移入发酵罐中；

[0088] 将上述剩余的高粱粉液化液和木薯粉液化液板框过滤后打入发酵罐中至发酵液总体积的87.0％，添加占发酵液总体积0.25％的磷酸氢二铵和0.25％的氯化铵作为无机氮源，添加占发酵液总体积0.5％的尿素为有机氮源；开启搅拌使转速为100rpm，升温至105℃消毒40分钟后降温至38℃；

[0089] 将培养成熟的种子液移至发酵罐中，通气比为1:0.12，罐压为0.12MPa，搅拌转速为100rpm，38℃条件下培养直至发酵终了，发酵终了的标准为：发酵罐正常产酸每小时不超过0.1％，还原糖不超过1.0％。在此条件下，共发酵56小时，产酸17.85％，转化率102.00％，发酵液送至提取车间采用钙盐法或色谱法提取发酵液中的柠檬酸。

[0090] 实施例7：

[0091] 一种柠檬酸发酵的方法，其具体步骤为：

[0092] 首先将高粱和木薯粉碎制备高粱粉和木薯粉，其中高粱占75wt％，木薯占25wt％，高粱粉和木薯粉60目的透过率在70％以上；

[0093] 将高粱粉加水调浆，使其浓度达到15wt％，调节pH为5.9，并向其中加入每克高粱粉25个酶单位的中性蛋白酶和18个酶单位的耐高温α-淀粉酶；

[0094] 将木薯粉加水调浆，使其浓度达到29wt％，调节pH为5.9，并向其中加入耐高温α-淀粉酶，每克木薯粉12个酶单位的耐高温α-淀粉酶；

[0095] 将调浆后的高粱粉浆和木薯粉浆分别输送至不同的喷射液化装置经过两次连续喷射液化工艺进行液化，其中连续两次喷射液化工艺中一次喷射温度控制在100℃，一次喷射后在液化层流罐中维持3.5小时，二次喷射温度控制在120℃，二次喷射后在二次液化搅拌罐中维持4.5个小时，液化最终液化液DE值为45％，分别获得高粱粉液化液和木薯粉液化液；

[0096] 种子罐中打入占最终发酵液总体积的10％的高粱粉液化液补加占发酵液总体积5.97％85℃热水，添加占发酵液总体积0.01％的硫酸铵和0.02％硝酸铵作为无机氮源，随后升温至121℃消毒30分钟，降温至36.5℃后接入孢子，控制黑曲霉孢子浓度为5.0*105个/mL，通气比为1:0.0.35，罐压为0.05MPa，搅拌转速为120rpm，培养20h即可移入发酵罐中；

[0097] 将上述剩余的高粱粉液化液和木薯粉液化液板框过滤后打入发酵罐中至发酵液总体积的82.5％，添加占发酵液总体积0.25％的磷酸氢二铵和0.25％的氯化铵作为无机氮源，添加占发酵液总体积0.5％的棉籽粕粉和0.5％油菜籽粕粉为有机氮源；开启搅拌使转速为150rpm，升温至105℃消毒20分钟后降温至40℃；

[0098] 将培养成熟的种子液移至发酵罐中，通气比为1:0.20，罐压为0.06MPa，搅拌转速为90rpm，40℃条件下培养直至发酵终了，发酵终了的标准为：发酵罐正常产酸每小时不超过0.1％，还原糖不超过1.0％。在此条件下，共发酵55小时，产酸17.76％，转化率100.91％，发酵液送至提取车间采用钙盐法或色谱法提取发酵液中的柠檬酸。

[0099] 实施例8：

[0100] 一种柠檬酸发酵的方法，其具体步骤为：

[0101] 首先将高粱和木薯粉碎制备高粱粉和木薯粉，其中高粱占10wt％，木薯占90wt％，高粱粉和木薯粉60目的透过率在70％以上；

[0102] 将高粱粉加水调浆，使其浓度达到23wt％，调节pH为6.4，并向其中加入每克高粱粉10个酶单位的中性蛋白酶和10个酶单位的纤维素酶和10个酶单位的耐高温α-淀粉酶；

[0103] 将木薯粉加水调浆，使其浓度达到27wt％，调节pH为6.4，并向其中加入每克木薯粉10个酶单位的耐高温α-淀粉酶；

[0104] 将调浆后的高粱粉浆和木薯粉浆分别输送至不同的喷射液化装置经过两次连续喷射液化工艺进行液化，其中连续两次喷射液化工艺中一次喷射温度控制在97℃，一次喷射后在液化层流罐中维持4小时，二次喷射温度控制在125℃，二次喷射后在二次液化搅拌罐中维持2个小时，液化最终液化液DE值为19.4％，分别获得高粱粉液化液和木薯粉液化液；

[0105] 种子罐中打入占最终发酵液总体积的5％高粱粉液化液，补加占发酵液总体积4.98％86℃热水，添加占发酵液总体积0.01％的硫酸铵和0.01％的柠檬酸铵作为无机氮源，随后升温至90℃消毒60分钟，降温至28℃后接入孢子，控制黑曲霉孢子浓度为6.0*105个/mL，通气比为1:0.12，罐压为0.10MPa，搅拌转速为80rpm，培养28h即可移入发酵罐中；

[0106] 将上述剩余的高粱粉液化液和木薯粉液化液板框过滤后打入发酵罐中至发酵液总体积的89％，添加占发酵液总体积的0.25％硫酸铵作为无机氮源，添加占发酵液总体积0.75％的棉籽粕粉为有机氮源；开启搅拌使转速为75rpm，升温至90℃消毒60分钟后降温至
37℃；

[0107] 将培养成熟的种子液移至发酵罐中，通气比为1:0.15，罐压为0.05MPa，搅拌转速为75rpm，37℃条件下培养直至发酵终了，发酵终了的标准为：发酵罐正常产酸每小时不超过0.1％，还原糖不超过1.0％。在此条件下，共发酵63小时，产酸17.48％，转化率101.21％，发酵液送至提取车间采用钙盐法或色谱法提取发酵液中的柠檬酸。

[0108] 实施例9：

[0109] 一种柠檬酸发酵的方法，其具体步骤为：

[0110] 首先将高粱和木薯粉碎制备高粱粉和木薯粉，其中高粱占65wt％，木薯占35wt％，高粱粉和木薯粉60目的透过率在70％以上；

[0111] 将高粱粉加水调浆，使其浓度达到27wt％，调节pH为6.0，并向其中加入每克高粱粉15个酶单位的中性蛋白酶和15个酶单位的纤维素酶和20个酶单位的耐高温α-淀粉酶；

[0112] 将木薯粉加水调浆，使其浓度达到27wt％，调节pH为6.0，并向其中加入每克木薯粉15个酶单位的耐高温α-淀粉酶；

[0113] 将调浆后的高粱粉浆和木薯粉浆分别输送至不同的喷射液化装置经过两次连续喷射液化工艺进行液化，其中连续两次喷射液化工艺中一次喷射温度控制在97℃，一次喷射后在液化层流罐中维持3小时，二次喷射温度控制在130℃，二次喷射后在二次液化搅拌罐中维持3小时，液化最终液化液DE值为25％，分别获得高粱粉液化液和木薯粉液化液；

[0114] 种子罐中打入占最终发酵液总体积的5％高粱粉液化液，补加占发酵液总体积4.98％85℃热水，添加占发酵液总体积0.02％的硫酸铵作为无机氮源，随后升温至100℃消毒45分钟，降温至36.5℃后接入孢子，控制黑曲霉孢子浓度为3.5*105个/mL，通气比为1:
0.15，罐压为0.10MPa，搅拌转速为120rpm，培养26h即可移入发酵罐中；

[0115] 将上述剩余的高粱粉液化液和木薯粉液化液板框过滤后打入发酵罐中至发酵液总体积的89％，添加占发酵液总体积的0.25％硫酸铵作为无机氮源，添加占发酵液总体积0.25％的尿素和0.5％的棉籽粕粉为有机氮源；开启搅拌使转速为85rpm，升温至90℃消毒
30分钟后降温至36.5℃；

[0116] 将培养成熟的种子液移至发酵罐中，通气比为1:0.20，罐压为0.075MPa，搅拌转速为85rpm，36.5℃条件下培养直至发酵终了，发酵终了的标准为：发酵罐正常产酸每小时不超过0.1％，还原糖不超过1.0％。在此条件下，共发酵63小时，产酸17.95％，转化率102.57％，发酵液送至提取车间采用钙盐法或色谱法提取发酵液中的柠檬酸。

[0117] 实施例10：

[0118] 一种柠檬酸发酵的方法，其具体步骤为：

[0119] 首先将高粱粉碎制备高粱粉，高粱粉60目的透过率在70％以上；

[0120] 将高粱粉加水调浆，使其浓度达到25wt％，调节pH为6.1，并向其中加入每克高粱粉10个酶单位的中性蛋白酶和8个酶单位的纤维素酶和15个酶单位的耐高温α-淀粉酶；

[0121] 将调浆后的高粱粉浆经过两次连续喷射液化工艺进行液化，其中连续两次喷射液化工艺中一次喷射温度控制在95℃，一次喷射后在液化层流罐中维持2.5小时，二次喷射温度控制在135℃，二次喷射后在二次液化搅拌罐中维持4小时，液化最终液化液DE值为42％，获得高粱粉液化液；

[0122] 种子罐中打入占最终发酵液总体积的5％高粱粉液化液，补加占发酵液总体积4.98％90℃热水，添加占发酵液总体积0.02％的硫酸铵作为无机氮源，随后升温至118℃消毒30分钟，降温至32℃后接入孢子，控制黑曲霉孢子浓度为4.0*105个/mL，通气比为1:
0.18，罐压为0.12MPa，搅拌转速为110rpm，培养30h即可移入发酵罐中；

[0123] 将上述剩余的高粱粉液化液板框过滤后打入发酵罐中至发酵液总体积的89％，添加占发酵液总体积的0.25％硫酸铵作为无机氮源，添加占发酵液总体积0.25％的蛋白胨和0.5％的棉籽粕粉为有机氮源；开启搅拌使转速为80rpm，升温至85℃消毒30分钟后降温至
38℃；

[0124] 将培养成熟的种子液移至发酵罐中，通气比为1:0.20，罐压为0.095MPa，搅拌转速为85rpm，38℃条件下培养直至发酵终了，发酵终了的标准为：发酵罐正常产酸每小时不超过0.1％，还原糖不超过1.0％。在此条件下，共发酵58小时，产酸17.78％，转化率101.60％，发酵液送至提取车间采用钙盐法或色谱法提取发酵液中的柠檬酸。