用于肺特异性递送的工具

摘要

本发明涉及包含脂质组合物的组合物，其中所述脂质组合物由以下组成：式(I)的阳离子脂质，其中n是1、2、3和4中的任一个，其中m是1、2和3中的任一个，Y‑是阴离子，其中R1和R2中的每一个单独地和独立地选自直链C12‑C18烷基和直链C12‑C18烯基；甾醇化合物，其中所述甾醇化合物选自胆甾醇和豆甾醇；和聚乙二醇化脂质，其中所述聚乙二醇化脂质包含PEG部分，且其中所述聚乙二醇化脂质选自：式(II)的聚乙二醇化磷酸乙醇胺，其中R3和R4中的每一个单独地和独立地是直链C13‑C17烷基，且p是15‑130的任意整数；式(III)的聚乙二醇化神经酰胺，其中R5是直链C7‑C15烷基，且q是15‑130的任意整数；和式(IV)的聚乙二醇化二酰甘油，其中R6和R7中的每一个单独地和独立地是直链C11‑C17烷基，且r是15‑130的任意整数。

权利要求

1.包含脂质组合物的组合物，其中所述脂质组合物如下：

70摩尔％的β-精氨酰基-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸盐

29摩尔％的胆甾醇，和

1摩尔％的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)其中所述组合物包含270mM蔗糖水溶液作为载体；且其中所述组合物包含siRNA分子。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述siRNA分子是功能性核酸，且其中带电荷的脂质氮原子与核酸主链磷酸之比是3-12。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述siRNA分子靶向ANG2。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述靶向ANG2的siRNA分子包含以下两个序列中的一个或两个：

5′AgUuGgAaGgAcCaCaUgC3′和

5′gCaUgUgGuCcUuCcAaCu3′，其中被指示为大写字母的核苷酸是2’-O-甲基修饰的核苷酸。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述靶向ANG2的siRNA分子包含以下两个序列：

5′AgUuGgAaGgAcCaCaUgC3′和

5′gCaUgUgGuCcUuCcAaCu3′，其中被指示为大写字母的核苷酸是2’-O-甲基修饰的核苷酸。

6.根据权利要求4或5所述的组合物，其中所述组合物包含0.28mg/ml的siRNA和2.4mg/ml总脂质。

7.根据权利要求1所述的组合物，

其中带电荷的脂质氮原子与核酸主链磷酸之比是8-9。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中带电荷的脂质氮原子与核酸主链磷酸之比是

8.4。

9.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物用在治疗和/或预防受试者的疾病的方法中。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的所述组合物。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的所述组合物。

12.根据权利要求9-11中的任一项所述的组合物，其中所述组合物将所述siRNA递送到受试者的细胞中。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述细胞是肺内皮细胞。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述siRNA在所述肺内皮细胞中提供治疗效果。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述siRNA靶向并抑制所述细胞内的靶分子，由此实现所述治疗效果。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述靶分子参与作为所述疾病的基础的病理学机制。

17.根据权利要求9所述的组合物，其中所述疾病选自急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺癌、肺转移瘤和肺高血压。

18.根据权利要求9所述的组合物，其中所述疾病为肺动脉高压。

19.根据权利要求9所述的组合物，其中所述受试者选自人、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、猴、狗、猫、猪、绵羊、山羊、牛和马。

20.根据权利要求9所述的组合物，其中借助于静脉内施用或借助于吸入将所述组合物施用给所述受试者。

21.根据权利要求1-8中的任一项所述的组合物用于制备用于治疗和/或预防疾病的药物的用途。

22.根据权利要求21所述的用途，其中所述疾病是这样的疾病，其中参与作为所述疾病的基础的病理学机制的靶分子存在于肺内皮细胞中，且抑制所述靶分子提供治疗效果。

23.根据权利要求22所述的用途，其中所述组合物的siRNA靶向并抑制所述细胞内的所述靶分子，由此实现所述治疗效果。

24.根据权利要求21-22中的任一项所述的用途，其中所述疾病选自急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺癌、肺转移瘤和肺高血压。

25.根据权利要求21-22中的任一项所述的用途，其中所述疾病为肺动脉高压。

26.根据权利要求21-22中的任一项所述的用途，其中所述药物用于静脉内施用。

27.药物组合物，其包含根据权利要求1-8中的任一项所述的组合物和药学上可接受的载体。

28.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述药物组合物用于治疗和/或预防疾病，其中所述疾病选自急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺癌、肺转移瘤和肺高血压。

29.根据权利要求1-8中的任一项所述的组合物在制备siRNA转运剂中的用途。

30.根据权利要求29所述的用途，其中所述转运剂将siRNA转运到细胞中。

31.根据权利要求30所述的用途，其中所述转运剂将siRNA转运到哺乳动物细胞中。

32.根据权利要求30所述的用途，其中所述转运剂将siRNA转运到人细胞中。

33.根据权利要求30所述的用途，其中所述细胞是肺内皮细胞。

34.根据权利要求33所述的用途，其中所述细胞是人肺内皮细胞。

35.试剂盒，其包含根据权利要求1-8中的任一项所述的组合物和使用说明书。

36.用于将siRNA转运到细胞中或穿过细胞膜的体外方法，其中所述方法包括以下步骤：使所述细胞或所述细胞膜与根据权利要求1-8中的任一项所述的组合物接触。

37.根据权利要求36所述的体外方法，其中所述方法包括以下步骤：在所述细胞中和/或在所述细胞膜之外检测所述siRNA。

38.根据权利要求21所述的用途，其中所述组合物将所述siRNA递送到所述受试者的细胞中。

39.根据权利要求38所述的用途，其中所述细胞是肺内皮细胞。

40.根据权利要求39所述的用途，其中所述siRNA在所述肺内皮细胞中提供治疗效果。

41.根据权利要求40所述的用途，其中所述siRNA靶向并抑制所述细胞内的靶分子，由此实现所述治疗效果。

42.根据权利要求41所述的用途，其中所述靶分子参与作为所述疾病的基础的病理学机制。

43.根据权利要求21所述的用途，其中所述受试者选自人、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、猴、狗、猫、猪、绵羊、山羊、牛和马。

44.根据权利要求43所述的用途，其中所述受试者是人。

45.用于制备药物的方法，其中所述方法包括将根据权利要求1-8中的任一项所述的组合物与药学活性剂一起配制。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述药物用于治疗和/或预防选自急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺癌、肺转移瘤和肺高血压的疾病。

47.根据权利要求45所述的方法，其中所述药物用于治疗和/或预防肺动脉高压。

48.根据权利要求45-46中的任一项所述的方法，其中所述药学活性剂是适合用于治疗肺病的化合物。

说明书

用于肺特异性递送的工具

[0001] 本发明涉及包含脂质组合物的组合物；用在治疗疾病的方法中的包含脂质组合物的组合物；包含脂质组合物的组合物用于制备用于治疗和/或预防疾病的药物的用途；药物组合物，其含有包含脂质组合物的组合物；包含脂质组合物的组合物作为转运剂的用途；试剂盒，其含有包含脂质组合物的组合物；用于将生物学活性化合物或药学活性化合物转运到细胞中或穿过细胞膜的方法，其中所述方法包括使所述细胞或所述细胞膜与所述包含脂质组合物的组合物接触；用于治疗和/或预防疾病的方法，其中所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的所述包含脂质组合物的组合物。

[0002] 分子生物学以及分子医学都严重依赖于将生物学活性化合物引入细胞中。这样的生物学活性化合物典型地分别包括DNA、RNA以及肽和蛋白质以及其它。不得不克服的障碍典型地是具有带负电荷的外表面的脂质双层。在本领域中，已经开发了许多技术以穿透细胞膜并且由此引入所述生物学活性化合物。但是，为实验室用途设想的一些方法不能用于医学领域，并且更具体地不适合用于药物递送。例如，本领域已知的电穿孔和弹道(ballistic)方法仅仅容许(如果能够的话)生物学活性化合物的局部递送。除了所述脂质双层之外，细胞膜还包含运输系统。因此，进行努力以使用该种类的运输系统，以便将所述生物学活性化合物转运穿过细胞膜。但是，由于这样的运输系统的特异性或交叉反应性，它们的应用不是普遍可适用的方法。

[0003] 在本领域中描述的用于将生物学活性化合物转运到细胞中的一种更普遍可适用的方案是使用病毒载体。但是，病毒载体仅可以用于将基因有效地转运到一些细胞类型中；但是它们不可用于将化学合成的分子引入到细胞中。

[0004] 一个替代方案是使用所谓的脂质体(Bangham,J.Mol.Biol.13,238-252)。脂质体是两亲的脂质在水中缔合后所产生的小泡。脂质体典型地包含同心排列的磷脂双层。取决于层的数量，脂质体可以分类为小的单层小泡、多层小泡和大的多层小泡。已经证明脂质体是有效的递送剂，因为它们可以将亲水的化合物掺入水性中间层中，而将疏水的化合物掺入脂质层中。本领域众所周知，脂质制剂的组成以及它的制备方法对得到的脂质聚集体的结构和大小具有影响，并因而对脂质体具有影响。也已知脂质体结合阳离子脂质。

[0005] 除了是脂质体的组分之外，阳离子脂质也已经引起相当大的注意，因为它们可以如此用于生物聚合物的细胞递送。使用阳离子脂质，由于静电相互作用可以将任何阴离子化合物基本上以定量方式包封。另外，据信，阳离子脂质与带负电荷的细胞膜相互作用，从而引发细胞膜运输。已经发现，使用含有阳离子脂质的脂质体制剂或将如此的阳离子脂质与生物学活性化合物一起使用需要探索性的方法，因为每种制剂具有有限的用途，因为它典型地可以将质粒递送到一些而不是全部细胞类型中，经常是在不存在血清的情况下。

[0006] 已经证实脂质和由其运输的生物学活性化合物的电荷和/或质量比是不同类型的所述生物学活性化合物递送中的关键因素。例如，已经证实，适于包含5,000至10,000个碱基大小的质粒递送的脂质制剂对于典型地包含约10至约50个碱基的寡核苷酸如siRNA分子、合成的核酶或反义分子的递送而言通常不是有效的。另外，最近已经指示，即使在相同的细胞类型中，反义寡核苷酸和核酶的最佳递送条件也是不同的。

[0007] 美国专利6,395,713公开了基于阳离子脂质的组合物，其中所述阳离子脂质由亲脂基团、接头和头基团组成，并且公开了这样的组合物用于将生物学活性化合物转运到细胞中的用途。

[0008] 国际专利申请WO 2005/105152公开了另一种基于阳离子脂质的组合物，其经证实在功能性核酸分子如siRNA分子的递送中是特别有效的。

[0009] 取决于要治疗的疾病和要递送的药物，需要将药物递送至特定器官或特定细胞类型。一种这样的特定器官是肺，且一种这样的特定细胞类型是肺内皮细胞。肺和肺内皮细胞的靶向例如在用于治疗疾病如急性肺损伤(acute lung injury)、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome)、肺癌(lung cancer)、肺转移瘤(pulmonary metastasis)、肺高血压(pulmonary hypertension)和肺动脉高压(pulmonary artery hypertension)的药物的递送中是有利的。

[0010] 作为本发明的基础的一个问题是，提供能够向肺递送药剂(优选治疗活性剂，更优选药物)的工具。作为本发明的基础的另一个问题是，提供能够向肺组织递送药剂(优选治疗活性剂，更优选药物)的工具。作为本发明的基础的另一个问题是，提供能够向肺内皮细胞递送药剂(优选治疗活性剂，更优选药物)的工具。

[0011] 作为本发明的基础的另一个问题是，提供用于治疗肺病、优选地选自急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺癌、肺转移瘤、肺高血压和肺动脉高压的肺病的工具。

[0012] 作为本发明的基础的另一个问题是，提供一种递送载体作为用于治疗肺病、优选地选自急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺癌、肺转移瘤、肺高血压和肺动脉高压的肺病的工具的部分。

[0013] 作为本发明的基础的另一个问题是，提供一种药物组合物。优选地，所述药物组合物适合用于向肺递送药剂(优选治疗活性剂，更优选药物)。作为本发明的基础的另一个问题是，提供一种药物组合物，其适合用于向肺组织递送药剂(优选治疗活性剂，更优选药物)。作为本发明的基础的另一个问题是，提供一种药物组合物，其适合用于向肺内皮细胞递送药剂(优选治疗活性剂，更优选药物)。

[0014] 作为本发明的基础的另一个问题是，提供一种可以用于制备药物的工具，其中所述药物适合用于或被用于治疗肺病、优选地选自急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺癌、肺转移瘤、肺高血压和肺动脉高压的肺病。

[0015] 作为本发明的基础的另一个问题是，提供一种用于预防和/或治疗疾病的方法，其中所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含治疗活性剂或药学活性剂，优选药物。作为本发明的基础的另一个问题是，提供一种用于治疗和/或预防肺病的方法，其中所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含治疗活性剂或药学活性剂，优选药物。作为本发明的基础的另一个问题是，提供一种用于治疗和/或预防疾病、优选肺病的方法，其中所述治疗包括向肺、优选肺内皮细胞递送治疗活性剂或药学活性剂。

[0016] 作为本发明的基础的另一个问题是，提供一种转运剂。优选地，所述转运剂能够将生物学活性剂、治疗活性剂和/或药学活性剂转运到细胞中或穿过细胞膜，其中优选地这样的细胞是肺内皮细胞。

[0017] 作为本发明的基础的另一个问题是，提供一种用于将生物学活性剂、治疗活性剂和/或药学活性剂转运到细胞中或穿过细胞膜的方法，其中优选地这样的细胞是肺内皮细胞。

[0018] 作为本发明的基础的另一个问题是，提供一种试剂盒。优选地，所述试剂盒适合(a)用在治疗和/或预防疾病、优选肺病的方法中，(b)用在将生物学活性剂、治疗活性剂和/或药学活性剂转运到细胞中或穿过细胞膜的方法中，其中优选地这样的细胞是肺内皮细胞，和/或(c)用在药物、优选用于治疗和/或预防疾病(更优选肺病，且最优选选自急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺癌、肺转移瘤、肺高血压和肺动脉高压的肺病)的药物的制备中。

[0019] 所附的从属权利要求的主题解决了这些和其它问题。优选的实施方案可以取自所附的从属权利要求。以下实施方案也解决了这些和其它问题。

[0020] 实施方案1：包含脂质组合物的组合物，其中所述脂质组合物由以下组成：

[0021] 式(I)的阳离子脂质

[0022]

[0023] 其中n是1、2、3和4中的任一个，

[0024] 其中m是1、2和3中的任一个，

[0025] Y-是阴离子，

[0026] 其中R1和R2中的每一个单独地和独立地选自直链C12-C18烷基和直链C12-C18烯基；

[0027] 甾醇化合物，其中所述甾醇化合物选自胆甾醇和豆甾醇；和

[0028] 聚乙二醇化脂质，其中所述聚乙二醇化脂质包含PEG部分，且其中所述聚乙二醇化脂质选自：

[0029] 式(II)的聚乙二醇化磷酸乙醇胺

[0030]

[0031] 其中R3和R4中的每一个单独地和独立地是直链C13-C17烷基，且

[0032] p是15-130的任意整数；

[0033] 式(III)的聚乙二醇化神经酰胺

[0034]

[0035] 其中R5是直链C7-C15烷基，且

[0036] q是15-130的任意整数；

[0037] 和

[0038] 式(IV)的聚乙二醇化二酰甘油

[0039]

[0040] 其中R6和R7中的每一个单独地和独立地是直链C11-C17烷基，且

[0041] r是15-130的任意整数。

[0042] 实施方案2：实施方案1的组合物，其中R1和R2彼此不同。

[0043] 实施方案3：实施方案1的组合物，其中R1和R2是相同的。

[0044] 实施方案4：实施方案1-3中的任一个的组合物，其中R1和R2中的每一个单独地和独立地选自C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C12烯基、C14烯基、C16烯基和C18烯基。

[0045] 实施方案5：实施方案4的组合物，其中C12烯基、C14烯基、C16烯基和C18烯基中的每一个包含一个或两个双键。

[0046] 实施方案6：实施方案5的组合物，其中C18烯基是具有一个在C9和C10之间的双键的C18烯基，优选顺式-9-十八烷基]。

[0047] 实施方案7：实施方案1-6中的任一个的组合物，其中R1和R2是不同的，且R1是棕榈基且R2是油烯基。

[0048] 实施方案8：实施方案1-6中的任一个的组合物，其中R1和R2是不同的，且其中R1是月桂基且R2是肉豆蔻基。

[0049] 实施方案9：实施方案1-8中的任一个的组合物，其中所述阳离子脂质是式(Ia)的化合物

[0050]

[0051] 实施方案10：实施方案1-9中的任一个的组合物，其中Y-选自卤化物、乙酸盐和三氟乙酸盐。

[0052] 实施方案11：实施方案10的组合物，其中Y-是Cl-。

[0053] 实施方案12：实施方案1-11中的任一个的组合物，其中所述阳离子脂质是式(Ib)的β-精氨酰基-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸盐：

[0054]

[0055] 实施方案13：实施方案1-11中的任一个的组合物，其中所述阳离子脂质是式(Ic)的β-精氨酰基-2,3-二氨基丙酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺三盐酸盐：

[0056]

[0057] 实施方案14：实施方案1-11中的任一个的组合物，其中所述阳离子脂质是式(Id)的ε-精氨酰基-赖氨酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺三盐酸盐：

[0058]

[0059]

[0060] 实施方案15:实施方案1-14中的任一个的组合物，其中所述甾醇化合物是胆甾醇。

[0061] 实施方案16：实施方案12-14中的任一个、优选实施方案14的组合物，其中所述甾醇化合物是胆甾醇。

[0062] 实施方案17：实施方案1-14中的任一个的组合物，其中所述甾醇化合物是豆甾醇。

[0063] 实施方案18：实施方案12-14中的任一个、优选实施方案14的组合物，其中所述甾醇化合物是豆甾醇。

[0064] 实施方案19：实施方案1-18中的任一个、优选实施方案12-14中的任一个、更优选实施方案16和18中的任一个的组合物，其中所述聚乙二醇化脂质的PEG部分具有约800至约5000Da的分子量。

[0065] 实施方案20：实施方案19的组合物，其中所述聚乙二醇化脂质的PEG部分的分子量是约800Da。

[0066] 实施方案21：实施方案19的组合物，其中所述聚乙二醇化脂质的PEG部分的分子量是约2000Da。

[0067] 实施方案22：实施方案19的组合物，其中所述聚乙二醇化脂质的PEG部分的分子量是约5000Da。

[0068] 实施方案23：实施方案1-22中的任一个、优选实施方案19-22中的任一个的组合物，其中所述聚乙二醇化脂质是式(II)的聚乙二醇化磷酸乙醇胺，其中R3和R4中的每一个单独地和独立地是直链C13-C17烷基，且

[0069] p是选自18、19或20、或选自44、45或46、或选自113、114或115的任意整数。

[0070] 实施方案24：实施方案23的组合物，其中R3和R4是相同的。

[0071] 实施方案25：实施方案23的组合物，其中R3和R4是不同的。

[0072] 实施方案26：实施方案23和25中的任一个的组合物，其中R3和R4中的每一个单独地和独立地选自C13烷基、C15烷基和C17烷基。

[0073] 实施方案27：实施方案1-26中的任一个、优选实施方案12-14中的一个、更优选实施方案14和16中的任一个的组合物，其中所述式(II)的聚乙二醇化磷酸乙醇胺是

[0074]

[0075] 实施方案28：实施方案1-26中的任一个、优选实施方案12-14中的一个、更优选实施方案16和18中的任一个的组合物，其中所述式(II)的聚乙二醇化磷酸乙醇胺是

[0076]

[0077] 实施方案29：实施方案1-22中的任一个、优选实施方案19-22中的任一个的组合物，其中所述聚乙二醇化脂质是式(III)的聚乙二醇化神经酰胺，其中R5是直链C7-C15烷基，且

[0078] q是选自18、19或20、或选自44、45或46、或选自113、114或115的任意整数。

[0079] 实施方案30：实施方案29的组合物，其中R5是直链C7烷基。

[0080] 实施方案31：实施方案30的组合物，其中R5是直链C15烷基。

[0081] 实施方案32：实施方案1-22和29-31中的任一个、优选实施方案12-14中的一个、更优选实施方案16和18中的任一个的组合物，其中所述式(III)的聚乙二醇化神经酰胺是[0082]

[0083] 实施方案33：实施方案1-22和29-31中的任一个、优选实施方案12-14中的一个、更优选实施方案16和18中的任一个的组合物，其中所述式(III)的聚乙二醇化神经酰胺是[0084]

[0085] 实施方案34：实施方案1-22中的任一个、优选实施方案19-22中的任一个的组合物，其中所述聚乙二醇化脂质是式(IV)的聚乙二醇化二酰甘油

[0086]

[0087] 其中R6和R7中的每一个单独地和独立地是直链C11-C17烷基，且

[0088] r是选自18、19或20、或选自44、45或46、或选自113、114或115的任意整数。

[0089] 实施方案35：实施方案34的组合物，其中R6和R7是相同的。

[0090] 实施方案36：实施方案34的组合物，其中R6和R7是不同的。

[0091] 实施方案37：实施方案34-36中的任一个的组合物，其中R6和R7中的每一个单独地和独立地选自直链C17烷基、直链C15烷基和直链C13烷基。

[0092] 实施方案38：实施方案1-22和34-37中的任一个、优选实施方案12-14中的一个、更优选实施方案16和18中的任一个的组合物，其中所述式(IV)的聚乙二醇化二酰甘油是[0093]

[0094] 实施方案39：实施方案1-22和34-36中的任一个、优选实施方案12-14中的一个、更优选实施方案16和18中的任一个的组合物，其中所述式(IV)的聚乙二醇化二酰甘油是[0095]

[0096] 实施方案40：实施方案1-22和34-36中的任一个、优选实施方案12-14中的一个、更优选实施方案16和18中的任一个的组合物，其中所述式(IV)的聚乙二醇化二酰甘油是[0097]

[0098] 实施方案41：实施方案1-40中的任一个的组合物，其中

[0099] 式(I)的阳离子脂质选自：

[0100] β-精氨酰基-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸盐

[0101]

[0102] β-精氨酰基-2,3-二氨基丙酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺三盐酸盐

[0103]

[0104] 和

[0105] ε-精氨酰基-赖氨酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺三盐酸盐

[0106]

[0107] 其中所述甾醇化合物选自胆甾醇和豆甾醇；且

[0108] 其中所述聚乙二醇化脂质是式(II)的聚乙二醇化磷酸乙醇胺，其中所述聚乙二醇化磷酸乙醇胺选自：

[0109] 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)[0110]

[0111] 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](铵盐)[0112]

[0113] 实施方案42：实施方案1-40中的任一个的组合物，其中

[0114] 式(I)的阳离子脂质选自：

[0115] β-精氨酰基-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸盐

[0116]

[0117] β-精氨酰基-2,3-二氨基丙酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺三盐酸盐

[0118]

[0119] 和

[0120] ε-精氨酰基-赖氨酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺三盐酸盐

[0121]

[0122] 其中所述甾醇化合物选自胆甾醇和豆甾醇；且

[0123] 其中所述聚乙二醇化脂质是式(III)的聚乙二醇化神经酰胺，其中所述聚乙二醇化神经酰胺选自：

[0124] N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰[甲氧基(聚乙二醇)2000]}

[0125]

[0126] 和

[0127] N-棕榈酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰[甲氧基(聚乙二醇)2000]}

[0128]

[0129] 实施方案43：实施方案1-40中的任一个的组合物，其中

[0130] 式(I)的阳离子脂质选自：

[0131] β-精氨酰基-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸盐

[0132]

[0133] β-精氨酰基-2,3-二氨基丙酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺三盐酸盐

[0134]

[0135] 和ε-精氨酰基-赖氨酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺三盐酸盐

[0136]

[0137] 其中所述甾醇化合物选自胆甾醇和豆甾醇；且

[0138] 其中所述聚乙二醇化脂质是式(IV)的聚乙二醇化二酰甘油，其中所述聚乙二醇化二酰甘油选自：

[0139] 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油[甲氧基(聚乙二醇)2000]

[0140]

[0141] 1,2-二棕榈酰基-sn-甘油[甲氧基(聚乙二醇)2000]

[0142]

[0143] 实施方案44：实施方案1-43中的任一个、优选实施方案41-43中的任一个的组合物，其中

[0144] 所述阳离子脂质是β-精氨酰基-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸盐

[0145]

[0146] 所述甾醇化合物是胆甾醇，且

[0147] 所述聚乙二醇化脂质是式(II)的聚乙二醇化磷酸乙醇胺，所述式(II)的聚乙二醇化磷酸乙醇胺是

[0148] 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)[0149]

[0150] 实施方案45：实施方案1-44中的任一个、优选实施方案41-44中的任一个和更优选实施方案44的组合物，其中，在所述脂质组合物中，所述阳离子脂质组合物的含量是约65摩尔％至约75摩尔％，所述甾醇化合物的含量是约24摩尔％至约34摩尔％，且所述聚乙二醇化脂质的含量是约0.5摩尔％至约1.5摩尔％，其中所述脂质组合物的阳离子脂质的含量、甾醇化合物的含量和聚乙二醇化脂质的含量的总和是100摩尔％。

[0151] 实施方案46：实施方案45的组合物，其中，在所述脂质组合物中，所述阳离子脂质的含量是约70摩尔％，所述甾醇化合物的含量是约29摩尔％，且所述聚乙二醇化脂质的含量是约1摩尔％。

[0152] 实施方案47：上述实施方案中的任一个的组合物，其中所述脂质组合物如下：

[0153] 70摩尔％的β-精氨酰基-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸盐[0154]

[0155] 29摩尔％的胆甾醇，和

[0156] 1摩尔％的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)

[0157]

[0158] 实施方案48：实施方案1-47中的任一个的组合物，其中所述组合物包含载体，优选地所述载体是药学上可接受的载体。

[0159] 实施方案49：实施方案48的组合物，其中所述载体选自水、水溶液、优选等渗水溶液、盐溶液、优选等渗盐溶液、缓冲液、优选等渗缓冲液和水混溶性溶剂。

[0160] 实施方案50：实施方案49的组合物，其中所述载体是水混溶性溶剂，且其中所述水混溶性溶剂选自乙醇和叔丁醇。

[0161] 实施方案51：实施方案48-50中的任一个的组合物，其中所述载体是蔗糖水溶液，优选270mM蔗糖水溶液。

[0162] 实施方案52：根据上述实施方案中的任一项的组合物，其中所述脂质组合物如下：

[0163] 70摩尔％的β-精氨酰基-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸盐[0164]

[0165] 29摩尔％的胆甾醇，和

[0166] 1摩尔％的式(II)的聚乙二醇化磷酸乙醇胺，所述式(II)的聚乙二醇化磷酸乙醇胺是

[0167] 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)[0168]

[0169] 且

[0170] 其中所述组合物包含270mM蔗糖水溶液。

[0171] 实施方案53：实施方案48-52中的任一个的组合物，其中所述脂质组合物在载体中形成颗粒。

[0172] 实施方案54：实施方案53的组合物，其中所述颗粒具有约30nm至约150nm的根据DLS测量的Z-平均尺寸(Z-average size)。

[0173] 实施方案55：实施方案54的组合物，其中所述颗粒具有约50nm至约100nm的根据DLS测量的Z-平均尺寸。

[0174] 实施方案56：实施方案53-55中的任一个的组合物，其中，通过动态光散射确定，所述颗粒的根据DLS测量的Z-平均尺寸是约60-80nm。

[0175] 实施方案57：实施方案1-56中的任一个、优选实施方案48-56中的任一个的组合物，其中在20℃的温度和在270mM蔗糖溶液中确定，所述组合物具有约+25至约+80mV的ζ电位，优选约+30mV至约+60mV的ζ电位，更优选约+46mV的ζ电位。

[0176] 实施方案58：实施方案1-57中的任一个、优选实施方案41-57中的任一个和更优选实施方案47和52中的任一个的组合物，其中所述组合物还包含化学化合物，其中所述化学化合物是生物学活性剂或药学活性剂。

[0177] 实施方案59：实施方案1-57中的任一个、优选实施方案41-57中的任一个和更优选实施方案47和52中的任一个的组合物，其中所述组合物还包含化学化合物，其中所述化学化合物能够由所述脂质组合物递送到细胞中和/或递送至细胞。

[0178] 实施方案60：实施方案59的组合物，其中所述细胞是哺乳动物的细胞，优选地所述哺乳动物选自人、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、猴、狗、猫、猪、绵羊、山羊、牛和马。

[0179] 实施方案61：实施方案59-60中的任一个的组合物，其中所述细胞是肺内皮细胞，优选地所述细胞是人肺内皮细胞。

[0180] 实施方案62：实施方案58-61中的任一个的组合物，其中所述化学化合物选自寡核苷酸、多核苷酸、核酸、肽、多肽、蛋白质和小分子。

[0181] 实施方案63：实施方案62的组合物，其中所述化学化合物是核酸，且其中所述核酸选自RNA、DNA、PNA和LNA。

[0182] 实施方案64：实施方案62的组合物，其中所述核酸是功能性核酸，优选地所述功能性核酸选自siRNA、微RNA(microRNA)、siNA、介导RNA干扰的核酸、反义核酸、核酶、适配体、spiegelmer和mRNA。

[0183] 实施方案65：实施方案62的组合物，其中所述多核苷酸选自siRNA、微RNA、siNA、介导RNA干扰的核酸、反义核酸、核酶、适配体、spiegelmer和mRNA。

[0184] 实施方案66：实施方案62的组合物，其中所述寡核苷酸选自siRNA、微RNA、siNA、介导RNA干扰的核酸、反义核酸、核酶、适配体和spiegelmer。

[0185] 实施方案67：实施方案62和66中的任一个的组合物，其中所述寡核苷酸与所述脂质组合物形成复合物。

[0186] 实施方案68：实施方案1-67中的任一个、优选实施方案41-47和53-56中的任一个的组合物，其中所述组合物包含siRNA分子。

[0187] 实施方案69：实施方案68的组合物，其中所述siRNA分子靶向ANG2。

[0188] 实施方案70：实施方案70的组合物，其中所述靶向ANG2的siRNA分子包含以下两个序列中的一个或两个：

[0189] 5′AgUuGgAaGgAcCaCaUgC 3′(SEQ ID NO:1)和

[0190] 5′gCaUgUgGuCcUuCcAaCu 3′(SEQ ID NO:2)，

[0191] 优选地，被指示为大写字母的核苷酸是2’-O-甲基。

[0192] 实施方案71：实施方案70的组合物，其中所述靶向ANG 2的siRNA分子包含以下两个序列：

[0193] 5′AgUuGgAaGgAcCaCaUgC 3′(SEQ ID NO:1)和

[0194] 5′gCaUgUgGuCcUuCcAaCu 3′(SEQ ID NO:2)，

[0195] 优选地，被指示为大写字母的核苷酸是2’-O-甲基。

[0196] 实施方案72：实施方案62的组合物，其中所述化学化合物是蛋白质，且其中所述蛋白质选自抗体、细胞因子和抗促成素(anticaline)。

[0197] 实施方案73：根据上述实施方案中的任一个的组合物，其中所述脂质组合物如下：

[0198] 70摩尔％的β-精氨酰基-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸盐[0199]

[0200] 29摩尔％的胆甾醇，和

[0201] 1摩尔％的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)

[0202]

[0203] 其中所述组合物包含270mM蔗糖水溶液，优选地作为载体或所述载体；且

[0204] 其中所述组合物包含化学化合物，其中所述化学化合物选自siRNA、微RNA、siNA和介导RNA干扰的化合物，优选地所述化学化合物是(a)生物学活性剂或药学活性剂或所述生物学活性剂或药学活性剂和/或(b)能够被所述脂质组合物递送到细胞中和/或递送至细胞，更优选地递送至哺乳动物肺内皮细胞。

[0205] 实施方案74：实施方案1-73中的任一个、优选实施方案58-73中的任一个和更优选实施方案73的组合物，其中所述化学化合物是功能性核酸，且其中带电荷的脂质氮原子与核酸主链磷酸之比(N/P比)是约3-12，优选约5-10，且更优选约8-9，且最优选约8.4。

[0206] 实施方案75：实施方案73和74中的任一个的组合物，其中所述组合物包含siRNA分子。

[0207] 实施方案76：实施方案75的组合物，其中所述siRNA分子靶向ANG2。

[0208] 实施方案77：实施方案76的组合物，其中所述靶向ANG2的siRNA分子包含以下两个序列中的一个或两个：

[0209] 5′AgUuGgAaGgAcCaCaUgC 3′(SEQ ID NO:1)和

[0210] 5′gCaUgUgGuCcUuCcAaCu 3′(SEQ ID NO:2)，

[0211] 优选地，被指示为大写字母的核苷酸是2’-O-甲基。

[0212] 实施方案78：实施方案77的组合物，其中所述靶向ANG 2的siRNA分子包含以下两个序列：

[0213] 5′AgUuGgAaGgAcCaCaUgC 3′(SEQ ID NO:1)和

[0214] 5′gCaUgUgGuCcUuCcAaCu 3′(SEQ ID NO:2)，

[0215] 优选地，被指示为大写字母的核苷酸是2’-O-甲基。

[0216] 实施方案79：实施方案73-78中的任一个、优选实施方案78的组合物，其中所述组合物包含0.28mg/ml siRNA和2.4mg/ml总脂质。

[0217] 实施方案80：根据上述实施方案中的任一个的组合物，其中所述脂质组合物如下：

[0218] 70摩尔％的β-精氨酰基-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸盐[0219]

[0220] 29摩尔％的胆甾醇，和

[0221] 1摩尔％的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)

[0222]

[0223] 其中所述组合物包含270mM蔗糖水溶液，优选地作为载体或所述载体；

[0224] 其中所述组合物包含化学化合物，其中所述化学化合物选自siRNA、微RNA和siNA，优选地所述化学化合物是(a)生物学活性剂或药学活性剂或所述生物学活性剂或药学活性剂和/或(b)能够被所述脂质组合物递送到细胞中和/或递送至细胞，更优选地递送至哺乳动物肺内皮细胞；且

[0225] 其中带电荷的脂质氮原子与核酸主链磷酸之比(N/P比)是约8-9，优选约8.4。

[0226] 实施方案81：实施方案80的组合物，其中所述组合物包含siRNA分子。

[0227] 实施方案82：实施方案81的组合物，其中所述siRNA分子靶向ANG2。

[0228] 实施方案83：实施方案82的组合物，其中所述靶向ANG2的siRNA分子包含以下两个序列中的一个或两个：

[0229] 5′AgUuGgAaGgAcCaCaUgC 3′(SEQ ID NO:1)和

[0230] 5′gCaUgUgGuCcUuCcAaCu 3′(SEQ ID NO:2)，

[0231] 优选地，被指示为大写字母的核苷酸是2’-O-甲基。

[0232] 实施方案84：实施方案83的组合物，其中所述靶向ANG 2的siRNA分子包含以下两个序列：

[0233] 5′AgUuGgAaGgAcCaCaUgC 3′(SEQ ID NO:1)和

[0234] 5′gCaUgUgGuCcUuCcAaCu 3′(SEQ ID NO:2)，

[0235] 优选地，被指示为大写字母的核苷酸是2’-O-甲基。

[0236] 实施方案85：实施方案80-84中的任一个、优选实施方案84的组合物，其中所述组合物包含0.28mg/ml siRNA和2.4mg/ml总脂质。

[0237] 实施方案86：实施方案1-85中的任一个、优选实施方案58-85中的任一个和更优选实施方案73-85中的任一个的组合物，所述组合物用在治疗和/或预防受试者的疾病的方法中。

[0238] 实施方案87：实施方案86的组合物，其中所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的所述组合物，优选治疗有效量的所述组合物。

[0239] 实施方案88：实施方案86-87中的任一个的组合物，其中所述组合物将所述化学化合物递送到受试者的细胞中。

[0240] 实施方案89：实施方案88的组合物，其中所述细胞是肺内皮细胞。

[0241] 实施方案90：实施方案89的组合物，其中所述化学化合物在所述肺内皮细胞中提供治疗效果，优选地所述化学化合物靶向并更优选地抑制所述细胞内的靶分子，由此实现所述治疗效果。

[0242] 实施方案91：实施方案90的组合物，其中所述靶分子参与作为所述疾病的基础的病理学机制。

[0243] 实施方案92：实施方案86-91中的任一个的组合物，其中所述疾病选自急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺癌、肺转移瘤、肺高血压和肺动脉高压。

[0244] 实施方案93：实施方案86-92中的任一个的组合物，其中所述受试者选自人、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、猴、狗、猫、猪、绵羊、山羊、牛和马。

[0245] 实施方案94：实施方案86-93中的任一个的组合物，其中借助于静脉内施用或借助于吸入将所述组合物施用给所述受试者。

[0246] 实施方案95：实施方案1-85中的任一个、优选实施方案58-85中的任一个和更优选实施方案73-85中的任一个的组合物用于制备用于治疗和/或预防疾病的药物的用途。

[0247] 实施方案96：实施方案95的用途，其中所述疾病是这样的疾病，其中参与作为所述疾病的基础的病理学机制的靶分子存在于肺内皮细胞中，且抑制所述靶分子会提供治疗效果。

[0248] 实施方案97：实施方案95-96中的任一个的用途，其中所述组合物的化学化合物靶向并更优选地抑制所述细胞内的靶分子，由此实现所述治疗效果。

[0249] 实施方案98：实施方案95-97中的任一个的用途，其中所述疾病选自急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺癌、肺转移瘤、肺高血压和肺动脉高压。

[0250] 实施方案99：实施方案95-98中的任一个的用途，其中所述药物用于静脉内施用。

[0251] 实施方案100：药物组合物，其包含实施方案1-85中的任一个的组合物、优选实施方案58-85中的任一个的组合物以及更优选实施方案73-85中的任一个的组合物和药学上可接受的载体。

[0252] 实施方案101：实施方案100的药物组合物，其中实施方案1-85中的任一个的组合物、优选实施方案58-850中的任一个的组合物且更优选实施方案73和85中的任一个的组合物的化学组合物是药学活性剂或所述药学活性剂。

[0253] 实施方案102：实施方案100-101中的任一个的药物组合物，其中所述实施方案1-85中的任一个的组合物、优选实施方案57-85中的任一个的组合物且更优选实施方案73-85中的任一个的组合物的载体是药学上可接受的载体或所述药学上可接受的载体。

[0254] 实施方案103：实施方案100-102中的任一个的药物组合物，其中所述药物组合物用于治疗和/或预防疾病，其中所述疾病如在实施方案95-99中的任一个中所定义。

[0255] 实施方案104：实施方案1-85中的任一个、优选实施方案58-85中的任一个和更优选实施方案73-85中的任一个的组合物作为转运剂的用途。

[0256] 实施方案105：实施方案104的用途，其中所述转运剂将生物学活性化合物或药学活性化合物转运到细胞中，优选转运到哺乳动物细胞中，且更优选转运到人细胞中。

[0257] 实施方案106：实施方案105的用途，其中所述细胞是肺内皮细胞，优选人肺内皮细胞。

[0258] 实施方案107：实施方案104-106中的任一个的用途，其中所述化学组合物的化学化合物是所述生物学活性剂或所述药学活性剂。

[0259] 实施方案108：试剂盒，其包含实施方案1-85中的任一个、优选实施方案58-85中的任一个和更优选实施方案73-85中的任一个的组合物和使用说明书。

[0260] 实施方案109：用于将生物学活性化合物或药学活性化合物转运到细胞中或穿过细胞膜的方法，其中所述方法包括以下步骤：使所述细胞或所述细胞膜与实施方案1-85中的任一个、优选实施方案58-85中的任一个和更优选实施方案73-85中的任一个的组合物以及所述生物学活性化合物或药学活性化合物接触。

[0261] 实施方案110：实施方案109的方法，其中所述方法包括以下步骤：在所述细胞中和/或在所述细胞膜之外检测所述生物学活性化合物或所述药学活性化合物。

[0262] 实施方案111：实施方案109-110中的任一个的方法，其中所述生物学活性化合物或所述药学活性化合物是实施方案58-85中的任一个的组合物的化学化合物。

[0263] 实施方案112：用于治疗和/或预防疾病的方法，其中所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的实施方案1-85中的任一个、优选实施方案58-85中的任一个和更优选实施方案73-85中的任一个的组合物。

[0264] 实施方案113：实施方案112的方法，其中所述组合物将所述化学化合物递送到受试者的细胞中。

[0265] 实施方案114：实施方案113的方法，其中所述细胞是肺内皮细胞。

[0266] 实施方案115：实施方案114的方法，其中所述化学化合物在所述肺内皮细胞中提供治疗效果，优选地所述化学化合物靶向并更优选地抑制所述细胞内的靶分子，由此实现所述治疗效果。

[0267] 实施方案116：实施方案115的方法，其中所述靶分子参与作为所述疾病的基础的病理学机制。

[0268] 实施方案117：实施方案112-116中的任一个的方法，其中所述疾病选自急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺癌、肺转移瘤、肺高血压和肺动脉高压。

[0269] 实施方案118：实施方案112-117中的任一个的方法，其中所述受试者选自人、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、猴、狗、猫、猪、绵羊、山羊、牛和马，优选地所述受试者是人。

[0270] 实施方案119：用于制备药物的方法，其中所述方法包括将根据实施方案1-85中的任一个的组合物与药学活性剂一起配制。

[0271] 实施方案120：实施方案119的方法，其中所述药物用于治疗和/或预防如上述实施方案中的任一个所述的疾病。

[0272] 实施方案121：实施方案119-120中的任一个的方法，其中所述药学活性剂是适合用于治疗肺病的化合物。

[0273] 实施方案122：根据实施方案1-68中的任一个的组合物，其中所述siRNA靶向如表1中所示的靶标。在一个优选的实施方案中，所述靶标

[0274] 是PKN3，其中更优选地所述siRNA包含具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的核酸链和/或具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列的核酸链，其中所述核酸链的核苷酸被如表1中所示地修饰，或者没有被修饰或被不同地修饰；

[0275] 是CD31，其中更优选地所述siRNA包含具有SEQ ID NO:11的核苷酸序列的核酸链和/或具有SEQ ID NO:12的核苷酸序列的核酸链，其中所述核酸链的核苷酸被如表1中所示地修饰，或者没有被修饰或被不同地修饰；

[0276] 是Tie2，其中更优选地所述siRNA包含具有SEQ ID NO:9的核苷酸序列的核酸链和/或具有SEQ ID NO:10的核苷酸序列的核酸链，其中所述核酸链的核苷酸被如表1中所示地修饰，或者没有被修饰或被不同地修饰；

[0277] 是KDR/VEGFR2，其中更优选地所述siRNA包含具有SEQ ID NO:13的核苷酸序列的核酸链和/或具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列的核酸链，其中所述核酸链的核苷酸被如表1中所示地修饰，或者没有被修饰或被不同地修饰；

[0278] 是CDH5/VE-钙黏着蛋白，其中更优选地所述siRNA包含具有SEQ ID NO:15的核苷酸序列的核酸链和/或具有SEQ ID NO:16的核苷酸序列的核酸链，其中所述核酸链的核苷酸被如表1中所示地修饰，或者没有被修饰或被不同地修饰；或者

[0279] 是BMPR2，其中更优选地所述siRNA包含具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列的核酸链和/或具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的核酸链，其中所述核酸链的核苷酸被如表1中所示地修饰，或者没有被修饰或被不同地修饰；

[0280] 在本发明内，在其中所述阳离子脂质是β-精氨酰基-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺的本发明的每个和任意方面的每个和任意实施方案中，所述β-精氨酰基-2,3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺优选地是β-L-精氨酰基-2,3-L-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺。

[0281] 在本发明内，在其中所述阳离子脂质是β-精氨酰基-2,3-二氨基丙酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺的本发明的每个和任意方面的每个和任意实施方案中，所述β-精氨酰基-2,3-二氨基丙酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺优选地是β-L-精氨酰基-2,3-L-二氨基丙酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺。

[0282] 在本发明内，在其中所述阳离子脂质是ε-精氨酰基-赖氨酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺的本发明的每个和任意方面的每个和任意实施方案中，所述ε-精氨酰基-赖氨酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺优选地是ε-L-精氨酰基-L-赖氨酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺。

[0283] 本发明的发明人已经令人惊讶地发现，包含脂质组合物的组合物，其中所述脂质组合物由以下组成：

[0284] 式(I)的阳离子脂质

[0285]

[0286] 其中n是1、2、3和4中的任一个，

[0287] 其中m是1、2和3中的任一个，

[0288] 其中Y-是阴离子，且

[0289] 其中R1和R2中的每一个单独地和独立地选自直链C12-C18烷基和直链C12-C18烯基；

[0290] 甾醇化合物，其中所述甾醇化合物选自胆甾醇和豆甾醇；和

[0291] 聚乙二醇化脂质，其中所述聚乙二醇化脂质包含PEG部分，且其中所述聚乙二醇化脂质选自：

[0292] 式(II)的聚乙二醇化磷酸乙醇胺

[0293]

[0294] 其中R3和R4中的每一个单独地和独立地是直链C13-C17烷基，且

[0295] 其中p是15-130的任意整数；

[0296] 式(III)的聚乙二醇化神经酰胺

[0297]

[0298] 其中R5是直链C7-C15烷基，且

[0299] 其中q是15-130的任意整数；

[0300] 和

[0301] 式(IV)的聚乙二醇化二酰甘油

[0302]

[0303] 其中R6和R7中的每一个单独地和独立地是直链C11-C17烷基，且

[0304] 其中r是15-130的任意整数，

[0305] 适合到达宿主生物体(诸如哺乳动物)的肺和肺组织并积累在其中，并从而将与这样的脂质组合物结合的试剂(诸如核酸)递送至这样的器官和组织，且更具体地递送至这样的宿主生物体的肺内皮细胞。优选地，这样的核酸是寡核苷酸或多核苷酸(诸如siRNA)，但是不限于此。

[0306] 该发现是如此惊人的，因为它与阳离子脂质纳米复合物的典型系统行为形成对比，阳离子脂质纳米复合物通常显示出普遍的肝组织中的基因敲低，而在肺中仅有瞬时的siRNA积累(Polach,KJ等人(2012),Mol Ther 20:91-100；Schroeder,A等人(2010),J Intern Med 267:9-21；Tao,W等人(2010),Mol Ther 18:1657-1666)。不希望受任何理论约束，本发明的发明人假定，聚乙二醇化脂质的PEG部分存在于由脂质组合物形成的lipoplex纳米颗粒的表面上，从而在所述纳米颗粒周围形成亲水保护层，所述保护层能够通过空间排斥力排斥调理素蛋白的吸附，从而避免血清调理素如免疫球蛋白和纤连蛋白对lipoplex的结合和快速降解，否则所述血清调理素会导致在阳离子递送系统的静脉内施用后观察到的全身性毒性。此外，证实了阳离子脂质分别由于静电相互作用和熵效应而允许带负电荷的RNA主动加载到lipoplex中。它会浓缩寡核苷酸，保护它们免于降解并促进细胞摄取和内体释放。设想本发明的脂质组合物的甾醇化合物在不丧失融合性(fusogenicity)的情况下维持lipoplex稳定性，并从而影响lipoplex的层化性(lamellarity)、血浆药代动力学和生物分布。

[0307] 考虑到本文中提供的实验证据，本发明的包含脂质组合物的组合物显然适合用于治疗肺病和可以通过将药学活性剂和/或治疗活性剂靶向肺、肺组织和/或肺内皮细胞来治疗的疾病。这样的疾病包括肺癌以及肺转移瘤(参见，例如Steeg,PS(2006),Nat Med 12:895-904)，其中在肺癌的情况下靶分子是CD31、Ras、myc、Hif-1a、VEGF-R2、-R1、R-3、PKN3、miR221、miR145。用本发明的包含脂质组合物的组合物观察到的低的和一次性(one-time)定量给药具体地也使它成为用于递送药剂的载体，所述药剂可用于治疗需要住院进行静脉内药物施用的急性感染，诸如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)/急性肺损伤(ALI)、以导致水肿和脓毒症的炎症和增加的血管渗透性为特征的危及生命的综合征(van der Heijden,M等人(2009),Expert Opin Ther Targets 13:39-53；David,S等人(2012),Crit Care Med 
40:3034-3041；和Hotchkiss,RS等人(2003),N Engl J Med 348:138-150。可以分别被与ARDS/ALI相关的药学活性剂或治疗活性剂靶向的特定靶分子是ANG2。ANG2(也被称作“促血管生成素-2(angiopoietin-2)”)是一种内皮衍生出的Tie2拮抗剂，并且作为血管不稳定因子直接促进脓毒症发病率和死亡率(Fiedler,U.,和H.G.Augustin.2006,Trends 
Immunol.27:552-8)。因此，通过采用合成核酸如siRNA、反义分子、antagomir(例如，描述在Piva等人.2013,INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 43:985-994,Ganguli等人,2011,Bioinformation 7(1):41-43(2011),和Costa等人.2013,Pharmaceuticals,6,1195-1220)和/或微RNA模拟物(例如，描述在Henry等人,2011,Pharmaceutical research 12,3030-
3042；和Ling,H.,等人(2013),Nat Rev Drug Discov 12(11):847-865)的脂质组合物抑制选择性靶基因是一种用于治疗和/或预防肺病(包括危及生命的急性肺病)的策略。

[0308] 本发明的另一个方面是一种脂质组合物，其中所述脂质组合物由以下组成：

[0309] 式(I)的阳离子脂质

[0310]

[0311] 其中n是1、2、3和4中的任一个，

[0312] 其中m是1、2和3中的任一个，

[0313] 其中Y-是阴离子，且

[0314] 其中R1和R2中的每一个单独地和独立地选自直链C12-C18烷基和直链C12-C18烯基；

[0315] 甾醇化合物，其中所述甾醇化合物选自胆甾醇和豆甾醇；和

[0316] 聚乙二醇化脂质，其中所述聚乙二醇化脂质包含PEG部分，且其中所述聚乙二醇化脂质选自：

[0317] 式(II)的聚乙二醇化磷酸乙醇胺

[0318]

[0319] 其中R3和R4中的每一个单独地和独立地是直链C13-C17烷基，且

[0320] 其中p是15-130的任意整数；

[0321] 式(III)的聚乙二醇化神经酰胺

[0322]

[0323] 其中R5是直链C7-C15烷基，且

[0324] 其中q是15-130的任意整数；

[0325] 和

[0326] 式(IV)的聚乙二醇化二酰甘油

[0327]

[0328] 其中R6和R7中的每一个单独地和独立地是直链C11-C17烷基，且

[0329] 其中r是15-130的任意整数。

[0330] 本发明的另一个方面在于式(I)的阳离子脂质在制备本发明的脂质组合物、本发明的药物或本发明的递送载体中的用途，

[0331]

[0332] 其中n是1、2、3和4中的任一个，

[0333] 其中m是1、2和3中的任一个，

[0334] 其中Y-是阴离子，且

[0335] 其中R1和R2中的每一个单独地和独立地选自直链C12-C18烷基和直链C12-C18烯基。

[0336] 本发明的另一个方面是选自胆甾醇和豆甾醇的甾醇化合物在制备本发明的脂质组合物、本发明的药物或本发明的递送载体中的用途。

[0337] 本发明的另一个方面是以下物质在制备本发明的脂质组合物、本发明的药物或本发明的递送载体中的用途：

[0338] 式(II)的聚乙二醇化磷酸乙醇胺

[0339]

[0340] 其中R3和R4中的每一个单独地和独立地是直链C13-C17烷基，且

[0341] 其中p是15-130的任意整数；

[0342] 式(III)的聚乙二醇化神经酰胺

[0343]

[0344] 其中R5是直链C7-C15烷基，且

[0345] 其中q是15-130的任意整数；

[0346] 和

[0347] 式(IV)的聚乙二醇化二酰甘油

[0348]

[0349] 其中R6和R7中的每一个单独地和独立地是直链C11-C17烷基，且

[0350] 其中r是15-130的任意整数。

[0351] 如果没有相反指示，本发明的组合物是本发明的包含脂质组合物的组合物。在本发明内，本发明的脂质组合物的任何实施方案也是本发明的脂质组合物的实施方案。

[0352] 如在本文中优选地使用的，递送剂或递送载体是包含本发明的脂质组合物的组合物。也如在本文中优选地使用的，递送剂或递送载体是本发明的组合物。如在本文中优选地使用的，递送剂或递送载体是这样的试剂或载体，诸如适合用于将化合物递送至结构的组合物；优选地，这样的结构是器官、组织或细胞；更优选地，这样的结构是器官、组织或细胞。在一个优选的实施方案中，这样的化合物是治疗活性剂、生物学活性剂或药学活性剂。

[0353] 如在本文中优选地使用的，治疗活性剂是适合在宿主生物体中引起治疗效果或治疗有益效果的化合物。

[0354] 如在本文中优选地使用的，生物学活性剂是适合在宿主生物体中引起生物学效应的化合物。

[0355] 如在本文中优选地使用的，药学活性剂是适合在宿主生物体中引起药物效果或药学有益效果的化合物。

[0356] 要理解，如果没有相反指示，治疗活性剂的任何实施方案也是生物学活性剂的实施方案和药学活性剂的实施方案，反之亦然。

[0357] 关于本发明，治疗也包括预防。与此相一致，在一个实施方案中，治疗活性剂也是在疾病的预防中有活性的药剂。在一个备选实施方案中，治疗活性剂在疾病的预防中没有活性。

[0358] 如在本文中优选地使用的，烷基是缺少一个氢的烷烃取代基，其中烷烃仅由氢和碳原子组成，所有键是单键，且所述碳原子没有以环状结构相连，而是形成开链；烷烃的一般化学式是CnH2n+2。

[0359] 如在本文中优选地使用的，烯基是缺少一个氢的烯烃取代基，其中烯烃是含有至少一个碳-碳双键的不饱和化学化合物。

[0360] 如在本文中优选地使用的，PEG是聚乙二醇。

[0361] 如本文中使用的，n是1-4之间的任意整数，这意味着n可以是1、2、3和4。如本文中使用的，m是1-3之间的任意整数，这意味着m可以是1、2和3。

[0362] 本发明的组合物的阳离子脂质及其制备方法例如公开在国际专利申请WO 2005/105152中。

[0363] 应当理解，本发明的组合物的阳离子脂质是阳离子脂质。更优选地，存在于所述脂质中的NH或NH2基团中的任一个以质子化形式存在。典型地，所述脂质的任何正电荷由阴离子的存在来补偿。这样的阴离子可以是单价或多价阴离子。优选的阴离子是卤化物、乙酸盐和三氟乙酸盐。如本文中使用的卤化物优选地是氯化物、氟化物、碘化物和溴化物。最优选的是氯化物。在阳离子脂质与要转运到细胞中的治疗活性化合物或药学活性化合物或生物学活性化合物结合后，卤化物阴离子被优选地表现出一个或几个负电荷的所述活性化合物替代，但是要承认生物学活性化合物的总电荷不一定是负的。相同的考虑同样适用于本发明的组合物的其它化合物。在这样的化合物是阴离子化合物或带有一个或几个负电荷的情况下，这样的负电荷可以被阳离子的存在补偿。这样的阳离子可以是单价或多价阴离子。优选的阳离子是铵、钠或钾。

[0364] 要知道，根据式(I)的任何化合物包含至少两个不对称的C原子。在本发明内，在本文中公开了这样的化合物的任何可能的非对映异构体，即具体地是R-R、S-S、R-S和S-R非对映异构体。

[0365] 本发明的组合物的甾醇化合物可以是合成的或得自天然来源诸如绵羊毛或植物。

[0366] 本发明的组合物的聚乙二醇化脂质可得自商业来源诸如日本的NOF Corporation、美国的Avanti Polar Lipids或瑞士的Cordon Pharma。

[0367] 用于确定本发明的脂质组合物和本发明的组合物的Z-平均尺寸的方法是本领域技术人员已知的，且包括如在实施例部分中描述的动态光散射DLS，或可以得自例如，Zetasizer Nano Series User Manuel,Malvern Instruments Ltd.,UK。

[0368] 用于确定本发明的脂质组合物和本发明的组合物的ζ电位的方法是本领域技术人员已知的，且包括如在实施例部分中描述的电泳光散射，或可以得自例如，Zetasizer Nano Series User Manuel,Malvern Instruments Ltd.,UK。

[0369] 在一个实施方案中，本发明的组合物和特别是本发明的脂质组合物可以包含载体。这样的载体优选地是液体载体。优选的液体载体是水性载体和非水性载体。优选的水性载体是水、水性盐溶液、水性缓冲系统，更优选地所述缓冲系统和/或所述水性盐溶液具有生理学缓冲强度和生理学盐浓度。优选的非水性载体是溶剂，优选有机溶剂诸如乙醇、叔丁醇。不希望受任何理论约束，原则上，可以使用任何水混溶性有机溶剂。要承认的是，所述组合物、更具体地所述脂质组合物因此可以作为脂质体存在或形成脂质体；当与总体上带负电荷的化合物接触时，优选地要通过本发明的脂质组合物和/或本发明的组合物递送的化合物，本发明的脂质组合物和本发明的组合物形成lipoplex，即通过静电相互作用和熵效应形成的复合物，所述熵效应基于当聚阴离子(诸如核酸分子)与阳离子脂质或除了其它脂质组分以外还含有至少一种阳离子脂质组分的脂质系统相互作用时抗衡离子和水的释放。

[0370] 在另一个实施方案中，本发明的脂质组合物和/或本发明的组合物作为冻干的组合物存在。如此冻干的组合物允许所述组合物在室温有效的长期贮存。

[0371] 在本发明内，本发明的脂质组合物和/或本发明的组合物包含化学化合物，其中所述化学化合物是生物学活性剂、治疗活性剂和/或药学活性剂。这类药剂在本文中也被称作“活性剂”。

[0372] 优选地，任何这样的活性剂是带负电荷的分子。术语带负电荷的分子意在包括具有至少一个或超过一个带负电荷的基团的分子，所述带负电荷的基团可以与根据本发明的阳离子脂质的带正电荷的基团离子配对，尽管本发明的发明人不希望受任何理论约束。原则上，在接头部分处的正电荷也可以对脂质本身或在阳离子脂质和带负电荷的分子(即生物学活性化合物)之间形成的任何复合物的总结构具有一些影响。除此以外，与在美国专利6,395,713中公开的阳离子脂质相比，如由Xu Y,Szoka FC Jr.；Biochemistry；1996May 
07,35(18):5616-23所教导的，引入到根据本发明的脂质中的额外的正电荷应当促进该脂质的增加的毒性。与本领域技术人员将从该现有技术文件预见到的相反，根据本发明的化合物特别适合用于在本文中公开的多种目的，并且特别地没有任何增加的毒性。

[0373] 如在本文中优选地使用的肽是由至少两个彼此共价地连接(优选地通过肽键)的氨基酸组成的任何聚合物。更优选地，肽由2-10个氨基酸组成。所述肽的一个特别优选的实施方案是寡肽，其甚至更优选地包含约10至约100个氨基酸。如在本文中优选地使用的蛋白质是由多个彼此共价地连接的氨基酸组成的聚合物。优选地，这样的蛋白质包含约至少100个氨基酸或氨基酸残基。

[0374] 可以与根据本发明的阳离子脂质和组合物结合使用的优选蛋白质是任何抗体，优选任何单克隆抗体。

[0375] 特别优选的生物学活性化合物(即药学活性化合物)和这样的与根据本发明的组合物结合使用的另外的组分是核酸。这样的核酸可以是DNA、RNA、PNA或其任何混合物。更优选地，所述核酸是功能性核酸。如在本文中优选地使用的功能性核酸是这样的核酸，其不是分别编码肽和蛋白质的核酸。优选的功能性核酸是siRNA、siNA、RNAi、反义核酸、核酶、适配体和spiegelmer，它们都是本领域已知的。

[0376] siRNA是小干扰RNA，例如，如在国际专利申请PCT/EP03/08666中所描述的。这些分子典型地由双链RNA结构组成，所述双链RNA结构包含15-25个、优选18-23个核苷酸对，它们彼此碱基配对，即，彼此基本上互补，典型地由沃森-克里克碱基配对介导。该双链RNA分子的一条链与靶核酸(优选mRNA)基本上互补，而所述双链RNA分子的第二条链与所述靶核酸的一段基本上相同。所述siRNA分子可以在每侧和每段上分别侧接许多另外的寡核苷酸，但是，所述另外的寡核苷酸不一定必须彼此碱基配对。

[0377] RNAi具有与siRNA基本上相同的设计，但是，所述分子与siRNA相比显著更长。RNAi分子典型地分别包含50个或更多个核苷酸和碱基对。

[0378] 基于与siRNA和RNAi相同的作用模式而有活性的另一类功能性核酸是siNA。例如，在国际专利申请PCT/EP03/074654中描述了siNA。更具体地，siNA对应于siRNA，其中所述siNA分子不包含任何核糖核苷酸。

[0379] 如在本文中优选地使用的反义核酸是这样的寡核苷酸，其基于碱基互补性而与靶RNA(优选mRNA)杂交，从而活化RNA酶H。RNA酶H被磷酸二酯和硫代磷酸酯偶联的DNA活化。但是，除了硫代磷酸酯偶联的DNA以外，磷酸二酯偶联的DNA被细胞核酸酶快速地降解。反义多核苷酸因此仅作为DNA-RNA杂合复合物是有效的。反义核酸的优选长度是在16-23个核苷酸的范围内。这类反义寡核苷酸的例子描述在美国专利5,849,902和美国专利5,989,912等中。

[0380] 另一组功能性核酸是作为优选地由RNA组成的催化活性核酸的核酶，其基本上包含两个部分。第一部分显示催化活性，而第二部分负责与靶核酸的特异性相互作用。在靶核酸和核酶的所述部分之间的相互作用(典型地通过两个杂交链上的基本上互补的碱基段的杂交和沃森-克里克碱基配对)后，催化活性部分可以变得有活性，这意味着，在所述核酶的催化活性是磷酸二酯酶活性的情况下，所述催化活性部分对靶核酸进行分子内或分子间的切割。核酶、用途和设计原则是本领域技术人员已知的，并且，例如，描述在Doherty和Doudna(Annu.Ref.Biophys.Biomolstruct.2000；30:457-75)中。

[0381] 另一组功能性核酸是微RNA。微RNA是小非编码RNA分子。完全加工的成熟的miRNA典型地具有约22个核苷酸的长度。微RNA在基因表达的转录和转录后调节中起作用。由真核细胞核DNA编码的miRNA通过与mRNA分子内的互补序列的碱基配对而起作用，经常通过翻译抑制或靶标降解和/或微RNA模拟物而导致基因沉默(参见，例如，Anand,S.(2013),Vasc Cell 5(1):2；Kasinski,A.L.和F.J.Slack(2011),Nat Rev Cancer 11(12):849-864；Liu,D.,等人(2011),Int J Dev Biol 55(4-5):419-429；Staszel,T.,等人(2011),Pol Arch Med Wewn 121(10):361-366；Urbich,C.,等人(2008),Cardiovasc Res 79(4):581-588；Costa,P.M.和M.C.Pedroso de Lima(2013),Pharmaceuticals(Basel)6(10):1195-1220；
和Henry,J.C.,等人(2011),Pharm Res 28(12):3030-3042)。

[0382] 另一组功能性核酸是antagomir，其被例如描述在Costa,P.M.和M.C.Pedroso de Lima(2013),Pharmaceuticals(Basel)6(10):1195-1220；Piva,R.,等人(2013),Int J Oncol 43(4):985-994；Ganguli,S.,等人(2011),Bioinformation 7(1):41-43；和Ling,H.,等人(2013),Nat Rev Drug Discov12(11):847-865中。

[0383] 另一组功能性核酸是适配体。适配体是单链的或双链的与靶分子特异性地相互作用的D-核酸。适配体的制备或选择例如描述在欧洲专利EP 0533 838中。与RNAi、siRNA、siNA、反义核苷酸和核酶不同，适配体不降解任何靶mRNA，而是与靶化合物(诸如蛋白质)的二级和三级结构特异性地相互作用。在与靶标相互作用后，所述靶标典型地显示其生物活性的改变。适配体的长度典型地在少至15个到多达80个核苷酸的范围内，并且优选地在约20至约50个核苷酸的范围内。

[0384] 另一组功能性核酸是spiegelmer，如在例如国际专利申请WO 98/08856中所述。Spiegelmer是类似于适配体的分子。但是，与适配体不同，spiegelmer完全地或者大部分由L-核苷酸而不是D-核苷酸组成。另外，特别是关于spiegelmer的可能长度，关于适配体所述的同样适用于spiegelmer。

[0385] 本发明的另一个方面涉及药物组合物，其包含本发明的脂质组合物或本发明的组合物。本发明的药物组合物包含药学活性化合物和任选的药学上可接受的载体。这样的药学上可接受的载体可以优选地选自如本文中关于根据本发明的组合物所限定的载体。本领域技术人员将理解，如本文中所述的任何组合物原则上也可以用作药物组合物，前提条件是，它的成分和它们的任意组合是药学上可接受的。药物组合物包含药学活性化合物。这样的药学活性化合物可以与根据本发明的组合物的另外的化合物或活性剂相同，其优选地是任何生物学活性化合物，更优选地是本文中公开的任何生物学活性化合物。另外的组分，药学活性化合物和/或生物学活性化合物优选地选自肽、蛋白质、寡核苷酸、多核苷酸和核酸。

[0386] 根据本发明的组合物，特别是药物组合物，可以用于多种施用形式，其中局部施用和全身施用是特别优选的。甚至更优选的是选自肌肉内、经皮、皮下、静脉内和肺施用的施用途径。如在本文中优选地使用的，局部施用是指，将相应的组合物以空间上紧密关联的方式分别施用至要分别给其施用所述组合物和生物学活性化合物的细胞、组织和器官。如本文中使用的，全身施用是指不同于局部施用的施用，并且更优选地是分别施用至体液诸如血液和液体中，其中所述体液将所述组合物分别运输至要分别给其递送所述组合物和生物学活性化合物的细胞、组织和器官。

[0387] 如在本文中优选地使用的，宿主生物体或受试者是哺乳动物，优选地所述哺乳动物选自人、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、猴、狗、猫、猪、绵羊、山羊、牛和马；更优选地，所述宿主生物体或所述受试者是人。

[0388] 任何可以使用根据本发明的组合物制备的药物分别用于治疗和预防受试者。优选地，这样的受试者是哺乳动物，且甚至更优选地，这样的哺乳动物选自人、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、猴、狗、猫、猪、绵羊、山羊、牛和马。在另一个方面，根据本发明的组合物和/或本发明的脂质组合物可以用作转运剂，更优选地用作转染剂。

[0389] 如在本文中优选地使用的，转运剂是适合用于转运化合物(更优选生物学活性化合物诸如药学活性化合物)穿过膜(优选细胞膜)并且更优选地如本文前面描述的那样将这样的化合物转运到细胞中的任何试剂。优选地，所述细胞是肺内皮细胞，更优选如本文中定义的宿主生物体的内皮细胞。

[0390] 在另一个方面，本发明涉及转运、更具体地用生物学活性化合物转染细胞的方法。在第一步中(其中不一定限制步骤的顺序)，分别提供细胞以及膜和细胞。在第二步中，提供根据本发明的化合物以及生物学活性化合物诸如药学活性化合物。可以使该反应物分别与所述细胞和所述膜接触，并且由于根据本发明的化合物和组合物的生物物理学特征，所述生物学活性化合物将从膜的一侧转移至另一侧，或者在所述膜形成细胞的情况下，从细胞外部转移至细胞内。在本发明内，在分别接触细胞和膜之前，将生物学活性化合物和本发明的组合物和/或本发明的脂质组合物接触，由此优选地形成复合物，并且使这样的复合物分别与细胞和膜接触。

[0391] 在本发明的另一个方面，分别转运生物学活性化合物和药学活性化合物的方法包括以下步骤：分别提供细胞和膜，提供根据本发明的组合物和/或本发明的脂质组合物，并分别使所述两种组合物与细胞和膜接触。在本发明内，可以在分别与细胞和膜接触之前或期间形成所述组合物。

[0392] 在如本文中公开的用于转运生物学活性化合物的任何方法的实施方案中，所述方法可以包括另外的步骤，优选检测生物学活性化合物是否已经被转移的步骤。这样的检测反应强烈地依赖于根据所述方法转移的生物学活性化合物的种类，并且对于本领域技术人员是显而易见的。在本发明内，这样的方法在如本文中所述的任何细胞、组织、器官和生物体上执行。

[0393] 在另一个方面，本发明涉及用于制备药物的方法。所述方法包括将治疗活性剂或药学活性剂与本发明的组合物和/或本发明的脂质组合物一起配制。关于如何实践这样的配制的细节是本领域技术人员已知的，且也可以获自本说明书的实施例部分。

[0394] 通过以下图和实施例进一步举例说明本发明，从以下图和实施例可以获得本发明的其它特征、实施方案和优点，其中

[0395] 图1是这样的图，其显示了使用不同的lipoplex制剂全身施用后1小时的siRNA体内分布；siRNA浓度以每克组织的初始剂量百分比[％ID/g]指示；

[0396] 图2a显示了形成DACC的化学化合物、它们的化学结构和它们的摩尔比(以百分比表达)，以及由DACC和siRNA分子形成的lipoplex的所述siRNA分子的基础设计；所述siRNA分子是平端的，且在两条链上的圆圈指示2-O-甲基修饰的核苷酸；

[0397] 图2b是这样的图，其以Z-平均尺寸显示DACC/siRNA lipoplex的粒度分布；

[0398] 图2c是这样的图，其显示DACC/siRNA lipoplex的ζ电位；

[0399] 图2d是DACC/siRNA lipoplex的电子显微照片；

[0400] 图3a是这样的图，其显示在施用DACC/siRNA lipoplex后1、6和24小时在不同器官中表示为％ID/g组织的siRNA浓度；

[0401] 图3b是福尔马林固定的石蜡包埋的肺组织切片的一系列共焦显微图像，显示了在DACC/siRNACy3的全身静脉内施用后1小时Cy3-标记的siRNA在肺中的细胞分布；左上图像显示siRNA-Cy3染色(白色)，右上图像和下面的图像显示了siRNACy3染色(红色)和核染色(绿色)的放大视图；指示了比例条；

[0402] 图3c是福尔马林固定的石蜡包埋的心脏、肝、脾和肾的切片的一系列共焦显微图像，显示了在DACC/siRNACy3的全身静脉内施用后1小时Cy3-标记的siRNA在所述器官中的细胞分布；上图用白色以低放大率显示，而下图用红色以放大视图显示；指示了比例条；

[0403] 图4a显示了在转染用于抑制Tie-2的DACC/siRNATie-2lipoplex后，小鼠内皮细胞系MS-1的蛋白质印迹分析的结果；

[0404] 图4b至4e是这样的图，其显示了在用DACC/siRNATie-2lipoplex处理后，通过定量逆转录酶-PCR分析确定的小鼠的肺(图4b)、心脏(图4c)、肝(图4d)和肾(图4e)的细胞中Tie-2mRNA的抑制与PTEN mRNA的抑制的对比；

[0405] 图5a是这样的图，其显示了通过用DACC/siRNATie-2lipoplex、DACC/siRNACD31lipoplex和270mM蔗糖溶液进行推注处理的小鼠的肺细胞中Tie-2mRNA的抑制与肌动蛋白mRNA的抑制的对比，其中施用的lipoplex的量分别是3.0mg/kg、1.5mg/kg和
0.75mg/kg；

[0406] 图5b是这样的图，其显示了通过输注DACC/siRNATie-2lipoplex和5％葡萄糖溶液处理的小鼠的肺细胞中Tie-2mRNA的抑制与肌动蛋白mRNA的抑制的对比，其中施用的lipoplex的量分别是0.3mg/kg、1.0mg/kg、3.0mg/kg、6.0mg/kg和12mg/kg；

[0407] 图6a是这样的图，其显示了处理后3天、处理后7天、处理后14天和处理后21天，用Tie-2DACC/siRNA lipoplex、对照lipoplex或蔗糖处理的小鼠的肺细胞中Tie-2mRNA的抑制与肌动蛋白mRNA的抑制的对比；

[0408] 图6b显示了施用单次剂量的DACC/siRNATie-2lipoplex或蔗糖溶液后3天和21天收集的小鼠肺组织的蛋白质印迹分析的结果，PTEN被用作上样对照；

[0409] 图7a至7d是这样的图，其显示了用DACC/siRNAVEGFR2lipoplex(图7a)、DACC/siRNAVE-钙黏着蛋白lipoplex(图7b)、DACC/siRNABMPR2lipoplex(图7c)和DACC/siRNACD31lipoplex(图7d)处理的小鼠的肺内皮中不同靶基因(图7a:VEGFR2；图7b:VE-钙黏着蛋白；图7c:BMPR2；和图7d:CD31)的抑制与PTEN mRNA的抑制的对比，其中在每种情况下在对照动物组中施用270mM蔗糖和DACC/siRNA对照；

[0410] 图8a是肺转移瘤小鼠模型的实验设置和使用DACC/siRNACD31的治疗方案的图示；

[0411] 图8b是这样的图，其显示了在图8a中所示的治疗方案期间直至第15天的相对体重；

[0412] 图8c是Kaplan-Meier图，其显示了如图8a中的方案所描绘的实验肺转移瘤小鼠模型中用DACC/siRNACD31、DACC/siRNA萤光素酶或270mM蔗糖(作为对照)处理的小鼠到限定的终点标准在细胞攻击后70天的时间里的存活。

[0413] 图8d是这样的图，其显示了用DACC/siRNACD31lipoplex、对照lipoplex或蔗糖处理的小鼠的肺组织中CD31mRNA的抑制与CD34mRNA的抑制的对比；

[0414] 图9a是通过LPS处理和使用DACC/siRNAANGPT2的治疗方案诱导炎症反应的实验设置的图示；

[0415] 图9b是这样的图，其显示了用LPS(0.5mg/kg)或盐水(0.9％NaCl)攻击后6小时小鼠的肺中ANGPT2mRNA的抑制与肌动蛋白mRNA的表达的对比。用2.8mg/kg、2.0mg/kg和ANGPT2“10mg/kg的剂量的DACC/siRNA lipoplex处理小鼠；270mM蔗糖用作空载对照；

[0416] 图10a是肺炎链球菌(S.pneumoniae)感染的肺小鼠模型的实验设置和使用DACC/siRNAANGPT2的治疗方案的图示；

[0417] 图10b是Kaplan-Meier图，其显示了在用肺炎链球菌(S.pneumoni)攻击后10天的时间里，用DACC/siRNAANGPT2和氨苄青霉素、DACC/siRNA萤光素酶和氨苄青霉素、蔗糖和氨苄青霉素或蔗糖和空载(盐水)处理的小鼠的存活，如图10a中的方案所描绘的；

[0418] 图11概述了用于确定使用不同的靶向EDN1或可溶性的VEGF受体1(sFlt1)的siRNA分子和不同的递送系统的小鼠中EDN1表达的减少的实验设置；和

[0419] 图12是柱状图，其显示了来自根据图5所示的实验设置处理的小鼠的肺组织的总裂解物中的EDN1mRNA表达；将EDN1mRNA表达相对于PTEN mRNA标准化。

[0420] 实施例1：材料和方法

[0421] 如果没有相反指示，则贯穿实施例使用以下描述的材料和方法。

[0422] 短干扰RNA

[0423] 在表1中列出了实施例2-9的主题实验所用的siRNA分子(AtuRNAi)。在所述实施例2-9中使用的siRNA分子(AtuRNAi)是平端的19-聚体双链RNA寡核苷酸，其通过在两条链上的交替的2’-O-甲基修饰而稳定化，并且在表2中列出了实施例10-11的主题实验所用的siRNA分子。在所述实施例10-11中使用的siRNA分子是平端的19-聚体双链RNA寡核苷酸，其通过在两个链上的交替的2’-O-甲基修饰而稳定化，靶向萤光素酶的对照siRNA分子是通过在两条链上的交替的2’-O-甲基修饰而稳定化的23-聚体双链RNA寡核苷酸。这样的修饰以前已经由Santel A等人(Santel,A等人(2006).Gene Ther 13:1222-1234)和Czauderna,F.等人(Czauderna,F.等人(2003),Nucleic Acids Res 31:2705-2716)描述，并由BioSpring(Frankfurt a.M.,德国)合成。贯穿本说明书和权利要求书，核苷酸的2’-O-甲基修饰被表示为由对应的大写字母表示的如此修饰的核苷酸，而未修饰的核苷酸用对应的小写字母表示。

[0424] 表1:

[0425]

[0426]

[0427] 表2：

[0428]

[0429] siRNA lipoplex的制备和表征

[0430] Atuplex是一种脂质组合物，其含有

[0431] a)50mol％β-(L-精氨酰基)-2,3-L-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸盐)；

[0432] b)49mol％1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)；和

[0433] c)1mol％N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐。

[0434] DACC9是一种脂质组合物，其含有

[0435] a)70mol％下式的β-(L-精氨酰基)-2,3-L-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸盐：

[0436]

[0437] b)29mol％胆甾醇；和

[0438] c)1mol％下式的mPEG-2000-DSPE：

[0439]是8.4。

[0440] DACC10是一种脂质组合物，其含有

[0441] a)70mol％下式的β-(L-精氨酰基)-2,3-L-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸盐：

[0442]

[0443] b)29mol％胆甾醇；和

[0444] c)1mol％下式的mPEG-2000-神经酰胺-C8：

[0445]

[0446] ，其中配料比[脂质/磷酸寡聚物]是8.4。

[0447] 通过用270mM无菌蔗糖溶液进行脂质膜再水合(Santel,A等人(2006).Gene Ther 13:1222-1234))制备阳离子脂质体(也被称作DACC9)，其由摩尔比为70:29:1的阳离子脂质AtuFECT01(β-L-精氨酰基-2,3-L-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸盐；
Silence Therapeutics AG,Berlin,德国)、胆甾醇(Sigma Aldrich)和mPEG2000-DSPE(1,
2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N[甲氧基(聚乙二醇)-2000])；Avanti Polar Lipids Inc.,Alabaster,AL,USA)组成。以类似的方式制备由以上DACC10脂质组合物组成的阳离子脂质体。得到的脂质体储液分别具有5mg/ml或高达9mg/ml(例如用于输注研究)的总脂质浓度。通过在270mM蔗糖中混合等体积的脂质体分散体和siRNA溶液，形成siRNA lipoplex。为此，以特定方式调节二者的浓度，所述方式使得最终的lipoplex制剂特征在于约6.8的最终脂质/siRNA比[m/m]，该比率对应于大约8.4的核酸主链磷酸与带电荷的脂质氮原子之间的配料比(N/P比)。使用Zetasizer Nano-ZS(Malvern Instruments,
Worcestershire,UK)通过动态光散射确定脂质体和lipoplex的颗粒尺寸(Z-平均尺寸、强度分布)和ζ电位。在这里，将对应的分散剂性质调至270mM蔗糖。通过Vironova AB(斯德哥尔摩,瑞典)进行负染色透射电子显微术(nsTEM)。

[0448] 如果提及DACC，这意味着，这样的提及表示DACC9和DACC10。

[0449] siRNA分布和体内RNAi

[0450] 将8周龄C57Bl/6j(Harlan)雄性和雌性用于体内研究。在该研究中的所有动物实验根据批准的方案执行，并遵循Landesamt für Arbeits-,Gesundheitsschutz und technische Sicherheit Berlin,Germany的指南(No.G0264/99)。通过以指示的剂量推注尾静脉，静脉内地施用等渗的siRNA lipoplex制剂。对于siRNA-Cy3生物分布研究，小鼠接受单剂量的DACC9siRNA-Cy3(2.8mg siRNA/kg体重)。注射后1小时，通过断颈法将小鼠处死，并如前所述处理组织用于石蜡包埋(Santel,A等人(2006).Gene Ther 13:1222-1234))。切割4μm的切片，并用Roticlear(Roth,A538.5)脱石蜡，通过分级乙醇洗涤再水合并用Sytox Green染料(Molecular probes)复染色。用Zeiss LSM510Meta共焦显微镜分析荧光摄取。通过Zeiss LSM5软件记录和处理图像。对于不同器官中的siRNA分布的定量分析，小鼠接受单剂量的用PKN3siRNA配制的lipoplex。通过改进的捕获探针夹心杂交测定(Aleku,M,等人(2008).Cancer Res 68:9788-9798)，确定不同组织中的PKN3siRNA的浓度。
对于靶mRNA敲低分析，在处死小鼠后立即解剖组织，并立即在液氮中快速冷冻。使用碳化钨珠子(Qiagen)在Mixer Mill MM301(Retsch GmbH,Haan,德国)中将大约20mg组织匀浆化。
用Invisorb Spin Tissue RNA Mini Kit(Invitek,Berlin,德国)从裂解物分离总RNA。取决于组织，将25-100ng总RNA用于使用得自BioTez GmBH(柏林，德国)的扩增子集合(在表3中列出)的定量TaqMan RT-PCR：使用以前描述的用于RT-PCR的标准方案(Santel,A等人(2006).Gene Ther 13:1222-1234))，利用浓度分别为300和100nM的引物和探针，利用ABI PRISM 7700Sequence Detector(软件:Sequence Detection System v1.6.3(ABI))或StepOnePlusTMReal Time PCR Sytem(ABI)进行TaqMan RT-PCR反应。通过使用Comparative CT方法，计算TaqMan数据。如以前所述(Santel,A等人(2006).Gene Ther 13:1222-1234))，通过全组织裂解物的蛋白质印迹法评估靶蛋白质表达。将速冻的组织在Mixer Mill MM 
301(Retsch GmbH,Haan,德国)中匀浆化，并在Riper-裂解缓冲液中提取蛋白质。将等量的蛋白质加载用于使用下述抗体的免疫印迹分析：兔抗-PTEN(Ab-2,Neomarkers,Fremont,CA,USA)和小鼠抗-Tie2(克隆Ab33,Upstate05-584)。

[0451] 表3：用于Taqman分析的引物集合

[0452]

[0453]

[0454] 输注研究

[0455] 对于输注研究，颈静脉中插入导管的小鼠(Harlan)接受单次最高剂量(12mg siRNA/kg体重；40ml/kg体重)的DACC9/lipoplex的1小时输注。对于剂量滴定，将DACC9lipoplex储液在5％葡萄糖溶液中稀释以保持施用体积恒定。

[0456] 小鼠内皮细胞系MS1的转染.

[0457] 从美国典型细胞培养物中心(ATCC)得到小鼠内皮细胞系MS1(ATCC CRL-2279)，并根据供应商的推荐进行培养。将细胞接种进6孔板中并如前所述(Santel,A等人(2006).Gene Ther 13:1222-1234)用DACC9/siRNATie-2转染。简而言之，在细胞接种后约12小时，将不同量的在含有10％血清的培养基中稀释的DACC9/siRNA制剂添加至细胞以达到10-160nM siRNA的转染浓度。转染以后3天，裂解细胞。将蛋白质通过SDS-PAGE进行分离，并如前所述进行免疫印迹法(Santel,A等人(2006).Gene Ther 13:1222-1234))。

[0458] 实验肺转移瘤小鼠模型

[0459] 在补充了10％FCS和4mM谷氨酰胺的RPMI培养基中培养Lewis肺癌(LLC)细胞。用胰蛋白酶将细胞解离，随后在细胞培养基中并且在PBS中洗涤。将在200μl PBS中的250 000个细胞注射进8周龄雄性BDF1小鼠(Harlan)的尾静脉中。肿瘤细胞攻击前5天开始，每隔一天将小鼠用等渗蔗糖或DACC9lipoplex处理11次。每天监测小鼠的体重发展和痛苦征象。当达到限定的终点标准(评分>＝4)时，通过断颈法处死动物。终点标准是痛苦征象(萎靡不振、变虚弱、难以移动或进食、化合物毒性(弓起痉挛(hunching convulsion))、连续3天体重下降15％或1天体重损失2β％和>＝4的评分)。

[0460] 肺炎链球菌感染的肺模型

[0461] 通过Eurofin/Panlabs(Ricerca,研究B09784,从模型608100改进)进行研究：通过尾静脉注射用DACC9lipoplex(2.8mg siRNA/kg体重)或蔗糖(作为空载对照)处理雄性的无特定病原体的ICR小鼠(体重20-22g)。24小时后，将所有小鼠用LD 90-100剂量(0.02ml,7-9x106CFU)的肺炎链球菌(ATCC 6301)气管内感染以诱导急性肺炎。感染后2小时，通过静脉内途径施用单次次优剂量的氨苄青霉素(3mg/kg)。监测小鼠的存活直到感染后10天。在没有氨苄青霉素处理的情况下，小鼠在肺炎链球菌感染后3天内死亡。用单次剂量的氨苄青霉素仅观察到存活的中等增加。除了氨苄青霉素处理以外还进行DACC9/Angpt2 siRNA预处理显著地增加小鼠的存活。>50％的动物存活指示试验物的显著活性。

[0462] 统计分析

[0463] 将数据表达为平均值±SEM。

[0464] 实施例2：DACC的肺特异性

[0465] 在体内评价不同的lipoplex制剂，以便研究它们各自的将siRNA货物递送至选定器官的能力。所有用于检查siRNA生物分布模式的lipoplex都用阳离子脂质AtuFECT01和siRNAPKN-3配制，但是含有不同比率的不同辅脂质(co-lipid)和/或PEG-脂质。通过尾静脉注射静脉内地施用lipoplex，并使用siRNA特异性的基于定量ELISA的捕获探针测定确定全身施用后1小时肝、肾、肺、心脏和脾组织样品中的siRNA浓度。结果显示在图1中。

[0466] 不同lipoplex的组成总结在表4中。

[0467] 表4：不同lipoplex的组成

[0468]

[0469] 递送至各个组织的siRNA的浓度随使用的lipoplex系统而变化，而DACC9lipoplex系统显示出向肺的最有效siRNA递送(图1，黑色条)。此外，lipoplex制剂稳定性和功能性器官摄取之间的反相关，即甚至就它们的聚集趋势而言最稳定的制剂也被发现最少被捕集在肺内皮的血管床中，而是直接积累在肝和脾中用于随后降解。然而，siRNA向靶组织的递送和细胞摄取不是负责活性的唯一因素，如之前由Heyes等人(Heyes,J,Palmer,L,Bremner,K,和MacLachlan,I(2005).J Control Release 107:276-287)对于不同的基于阳离子脂质的系统所证实的，提示胞吞作用不是限速的，而是在siRNA已经被细胞内化后发生的那些事件(诸如内体释放和RISC加载)对基因沉默的效率具有最大影响。

[0470] 实施例3：脂质组合物和DACC/siRNA lipoplex的物理化学表征

[0471] DACC9lipoplex(在本文中有时也被称作DACC9lipoplex)由在270mM蔗糖溶液中的摩尔比为70:29:1的带正电荷的脂质系统AtuFECT01(β-L-精氨酰基-2,3-L-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸盐)、胆甾醇和mPEG2000-DSPE(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N[甲氧基(聚乙二醇)-2000])以及通过使2′-O-甲基修饰在两条链上交替而化学稳定化的平端的siRNA双链体组成(Santel,A,等人(2006),Gene Ther 13:1222-1234；Aleku,M,等人(2008),Cancer Res 68:9788-9798)。DACC9的化学化合物、它们的化学结构和它们的摩尔比(以百分比表达)以及lipoplex的siRNA分子的基础设计显示在图2a中。关于siRNA分子，应当指出，它们是平端的，并且圆圈指示2-O-甲基修饰的核苷酸。

[0472] 关于尺寸和ζ电位来表征得到的DACC9lipoplex颗粒。在270mM蔗糖溶液中的Z-平均尺寸达到～70nm，如通过动态光散射所确定的，结果显示在图2b中，并且在270mM蔗糖中测量的ζ电位是在40-50mV之间，这可以从图2c看出。

[0473] DACC9lipoplex颗粒的电子显微术揭示了主要呈球形排列的优势层状结构，如在图2d中所示。蔗糖的添加使得制剂能够在冷冻、干燥和再水合步骤期间稳定，由此确保有效长期贮存为冻干产品(数据未显示)。对于由在270mM蔗糖溶液中的DACC10脂质组合物、通过使2′-O-甲基修饰在两条链上交替而化学稳定化的平端的siRNA双链体组成的DACC10lipoplex(Santel,A,等人(2006),Gene Ther 13:1222-1234；Aleku,M,等人(2008),Cancer Res 68:9788-9798)，得到了类似的结果。

[0474] 实施例4：DACC主要将siRNA递送至肺内皮

[0475] 为了更详细地表征通过DACC9lipoplex的全身施用的siRNA递送的组织分布和动力学，用单次剂量的DACC9(2.8mg siRNA/kg体重)处理小鼠，并在施用DACC9lipoplex制剂后1、6和24小时收集来自不同器官的许多组织样品以确定相应的siRNA浓度。结果显示在图3a中。

[0476] 如从图3a可见，在1小时时间点在肺组织中发现了最高siRNA浓度[约40％ID/g组织]，其次是脾、肝，肾和心脏更低。所有研究的组织中的siRNA浓度随时间减小，在血液、脑、前列腺或骨骼肌中测得低于初始剂量的1％的siRNA水平。

[0477] 为了检查优势地靶向的组织内的siRNA分布，用与花青染料(Cy3)标记的siRNA一起配制的DACC9lipoplex处理小鼠。然后通过对福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片进行共焦显微术，使组织中的Cy3-标记的siRNA可视化。在肺、肝、肾和心脏中的siRNA分布模式暗示血管染色模式，这可以从图3b-c看出。

[0478] 从所有研究的器官，肺被siRNA-Cy3最强烈地染色，其中siRNA染色在肺血管系统中均匀地分布。

[0479] 在放大视图中，肺中源自siRNA的染色是细小的点且围绕细胞核集中，该观察结果指示siRNA的细胞内摄取(图3b)。在心脏中，发现覆盖毛细血管内层的不同的Cy3染色，而肌肉纤维没有siRNA-Cy3信号(图3c)。肝中的窦状隙内皮细胞层显示弱siRNA-Cy3染色模式(图3c)，而在肝窦状隙内的个体细胞被强烈地Cy3染色。椭圆形状的细胞核(图3c,参见箭头)标记了负责除去外来颗粒物质的库普弗(Kupffer)细胞，因此，这里发现的lipoplex也可能是通过吞噬作用被吸收的(Whitehead,KA等人(2009),Nat Rev Drug Discov 8:129-138)。肝细胞(可通过它们的大的、规则和圆形的细胞核来辨别)不具有siRNA-Cy3染色。脾中的siRNA-Cy3染色在白髓的边缘区中是显著的，而白髓的中央保持没有CY3染色(图3c)。
由于已知负责从血液中清除lipoplex的单核细胞和巨噬细胞被隔离在该区域中，通过相应的巨噬细胞的lipoplex清除可以解释在该区域中观察到的增强的siRNA-Cy3染色模式。还在肾的小管周毛细血管中检测到不同的Cy3信号(图3c,箭头)。肾小管细胞的染色是弥散性的，具有Cy3-siRNA向小管的内腔积累的趋势，指示由肾分泌游离的siRNA。总之，通过DACC9递送系统的siRNA分布的定量和定性分析揭示了siRNA摄取主要发生在肺中，但是也在心脏、肝和肾的微血管系统中以及在肝和脾的吞噬细胞中检测到不同的来源于siRNA-Cy3的信号。

[0480] 实施例5：肺血管系统中DACC9对靶基因表达的抑制

[0481] 为了试验由DACC9递送的siRNA是否在功能上有活性且可以用于抑制血管床中的靶基因表达，制备了含有对靶基因Tie-2有特异性的siRNA的DACC制剂。Tie-2表达是对内皮细胞高度特异性的，且它是许多器官中该细胞类型的共同标志物(van der Heijden,M等人,Expert Opin Ther Targets 13:39-53)。首先在体外试验了DACC/siRNATie-2的RNAi活性。用DACC9/siRNATie-2转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并在72小时后通过免疫印迹法评估细胞裂解物中的Tie-2蛋白表达。结果显示在图4a中。

[0482] Tie-2表达被160和80nM siRNA剂量的DACC9/siRNATie-2显著地减小，40nM siRNA减小的程度较低(图4a)，这证实了DACC9可以在功能上将siRNA递送到细胞中并介导RNAi。应当指出，这些浓度不反映siRNA IC50，因为DACC9没有为细胞培养转染实验进行优化，且较低浓度可以用在后者中。

[0483] 为了研究DACC9是否能够在体内在血管内皮中进行基因沉默，通过尾静脉注射连续数天给小鼠施用3剂DACC9lipoplex(3x2.8mg/kg)。在最后一次处理后24小时，收集肺、心脏、肝和肾组织。从全组织裂解物制备总mRNA，并通过定量RT-PCR评估靶mRNA水平。结果显示在图4b-e中。与使用DACC9/siRNA对照或使用蔗糖溶液的对照处理相比，在用DACC9/siRNATie-2全身性地处理的小鼠的肺组织中，Tie-2mRNA水平下降了超过80％(图4b)。即使在重复施用DACC9/siRNATie-2制剂以后，在肝、肾和心脏组织中也没有观察到显著的Tie-2敲低Tie-2(图4c-e)，指示肺是在功能上被DACC9/siRNA 靶向的主要器官。

[0484] 实施例6：靶基因表达的DACC/siRNA剂量应答性

[0485] 为了进一步研究小鼠中DACC9lipoplex抑制靶基因的剂量要求，通过静脉内尾静脉推注施用单剂的3.0、1.5和0.75mg siRNA/kg体重的DACC9/siRNATie-2或DACC9siRNACD31l。在注射后24小时收集肺组织用于RNA分析。Tie-2靶基因表达的抑制的结果显示在图5a中。

[0486] 令人惊奇地，通过推注处理注射的单剂DACC9/siRNATie-2(3.0mg siRNA/kg)足以降低Tie-2mRNA水平，类似于关于图4b所述的重复给药(3x2.8mg siRNA/kg)以后得到的水平(比较，图5a和4b)。1.5mg siRNA/kg也可有效地降低Tie-2表达，但是程度较低，而0.75mg siRNA/kg不显著影响Tie-2水平。由于到目前为止描述的所有DACC9施用都通过推注来执行，而经由输注施用是在人中递送lipoplex的优选形式，所以通过1小时输注将不同剂量的DACC9/siRNATie-2施用到小鼠的颈静脉中。此种通过输注形式进行的施用(所述输注用约1h的时间实施)是临床上必要的。结果显示在图5b中。

[0487] DACC9/siRNATie-2输注以后的靶基因沉默与3mg siRNA/kg体重的推注的结果相当。肺组织中的Tie-2mRNA水平下降了大约80％。由于该施用模式使得能够使用与推注相比更大体积的DACC9lipoplex，所以施用的剂量分别增加至6mg siRNA/kg和/或12mg siRNA/kg。
经证实，lipoplex浓度的这种增加将Tie-2表达水平甚至进一步降低超过95％(图5b)。尽管如此，所有动物耐受甚至在最高剂量(12mg/kg)的DACC9/siRNATie-2的输注处理(图5b)。

[0488] 基于以上数据，对于使用单次剂量在肺中抑制Tie-2表达而言，小鼠的EC50为约1.5mg siRNA/kg，而更高的剂量3mg/kg(推注)和高达6mg/kg(输注)也被耐受。但是，较高单剂量的siRNA lipoplex对体重发展具有不利的影响，在12mg siRNA/kg剂量水平显示超过
10％的下降(相对于在3和1mg siRNA/kg剂量时可忽略的重量减轻(数据未显示)。从临床角度，观察到的低的和一次性的定量给药对于随后的毒性分析(profiling)而言是有利的。

[0489] 实施例7：靶标抑制的持续时间和由DACC介导的RNAi介导的敲低的验证

[0490] 为了评估通过DACC9lipoplex的靶基因抑制的持续时间，用单次剂量(2.8mg/kg)的DACC9/siRNATie-2或DACC9/siRNAANGPT2处理小鼠，并将组群在处理后(p.t.)3、7、14和21天处死。通过定量RT-PCR定量在相应的肺组织中的Tie-2靶mRNA水平。结果显示在图6a中。

[0491] 在用lipoplex处理后3天，在DACC9/siRNATie-2处理组中观察到最显著的Tie-2表达减少(与DACC9对照组相比，超过80％Tie-2减少)。尽管如此，与用蔗糖或用对照DACC9lipoplex处理的对照组相比，21天以后Tie-2mRNA水平仍然下降了超过50％(图6a)。
显著地，证实单次剂量的DACC9lipoplex(2.8mg siRNA/kg)使靶基因Tie-2的mRNA水平下降
60-90％(图6a)，该沉默效应持续多达3周。

[0492] 为了证实Tie-2mRNA的减少导致Tie-2蛋白的对应减少，分别在用DACC9lipoplex或用蔗糖(作为空载对照)处理以后3和21天，由小鼠制备肺组织匀浆物。通过蛋白质印迹法检测Tie-2蛋白，如在图6b中所示。在处理以后3天观察到Tie-2蛋白水平的最显著下降，这对应于Tie-2mRNA水平的相应下降，并被证实随时间逐渐衰减。但是，在处理以后21天仍然观察到Tie-2蛋白表达的深远下降。此外，Tie-2mRNA水平在21天以后保持下降了超过70％。

[0493] 实施例8：DACC/siRNA对肺内皮中的另外的靶基因的抑制

[0494] 为了证实DACC9递送系统也能够抑制在肺内皮中表达的除了Tie-2以外的其它基因，用对其它基因靶标(其表达高度限于内皮细胞)具有特异性的siRNA制备DACC9lipoplex：VEGFR2受体、VE-钙黏着蛋白、BMPR2和CD31基因，各种siRNA的序列在实施例1中显示。用DACC9/siRNAVEGFR2、DACC9/siRNAVE-钙黏着蛋白、DACC9/siRNABMPR-2或DACC9/siRNACD31的单次注射(2.8mg siRNA/kg)处理小鼠，使相应靶基因的mRNA水平下降60-90％，如在图7中所示。观察到的mRNA水平的下降因而证实，DACC9lipoplex能够在功能上将siRNA递送至血管内皮，由此能够实现在该组织类型中的靶标特异性的基因沉默。此外，DACC9lipoplex的仅仅单次施用足以下调相应的靶基因在肺血管系统中的表达。

[0495] 实施例9：DACC/siRNACD31处理增加实验肺转移瘤小鼠模型中的存活

[0496] CD31/Pecam1是同型以及异型细胞相互作用所需的细胞表面蛋白。它参与肿瘤发生的多个过程，如血管生成、血管渗透性和转移(Cao,G等人(2009),Am J Pathol 175:903-915；DeLisser,H等人(2010),Proc Natl Acad Sci USA 107:18616-18621)。在以前的研究中也证实，通过RNA干扰来靶向CD31会导致皮下异种移植物肿瘤模型中和常位前列腺癌模型中的肿瘤生长的下降(Santel,A,等人(2006),Gene Ther 13:1360-1370)。

[0497] 在本研究中，研究了DACC9/siRNACD31是否可以在治疗上被用于治疗肺癌。为此，试验了使用DACC9/siRNACD31的处理是否在实验肺转移瘤小鼠模型中具有治疗益处(Santel,A等人(2010),Clin Cancer Res 16:5469-5480)。在该模型中，将Lewis肺癌细胞(LL)静脉内地施用给同基因的BDF1小鼠，从而导致肿瘤细胞在肺中的定殖以及随后肺转移瘤的长出。在LL肿瘤细胞静脉内注射之前5天，制备DACC9/siRNACD31、对照lipoplex DACC9/siRNA萤光素酶和蔗糖(作为空载对照)并将其注射到小鼠中。每隔一天重复通过推注(2.8mg/kg)的处理直至第15天(图8a)。

[0498] 连续地监测体重。在处理期间没有观察到由DACC9lipoplex施用引起的体重下降，这可以从图8b看出。

[0499] 监测动物的存活至限定的终点标准达多至肿瘤细胞攻击后70天。结果显示在图8c中。与接受蔗糖(p<0.006,时序检验)或DACC9/siRNA萤光素酶(p<0.001)的对照处理组相比，接受DACC9/siRNACD31的动物的存活显著地增强。用等渗蔗糖溶液或萤光素酶对照lipoplex处理的动物显示出较差的存活：在蔗糖对照组中，没有动物存活超过30天，DACC9/siRNA萤光素酶CD31对照组中仅两只动物存活至第70天。与此相比，8只接受DACC9/siRNA 的动物中的7只存活至第70天。在单独的组群中在肿瘤细胞攻击以后第16天在处理阶段结束以后评价了CD31表达(图8a)。与用DACC9/siRNA萤光素酶或蔗糖(作为空载对照)处理的动物相比，用DACC9/siRNACD31处理的动物的肺中的CD31表达下降了大约80％(图8d)，从而证实在治疗情况中CD31表达可以被DACC9lipoplex靶向。

[0500] 实施例10：DACC/siRNAANG2防止小鼠中通过LPS的ANG2的诱导

[0501] 用指定剂量的DACC9lipoplex或用蔗糖溶液静脉内地处理C57BL6小鼠。48小时以后，用LPS(0.5mg/kg，静脉内)或盐水(0.9％NaCl)攻击小鼠。在LPS处理后6小时收集肺组织，并处理以用于RNA分离(参见图9a)。通过qRT-PCR确定肺组织样品中的ANGPT2mRNA水平。使用肌动蛋白mRNA水平作为标准化物。与使用的材料和方法有关的实验的其它方面根据实施例1进行。

[0502] 结果显示在图9b中。如从图9b可见，蔗糖处理组LPS诱导了肺组织中ANGPT2mRNA水平的升高。DACC9/ANGPT2siRNA处理以剂量依赖性的方式减少了ANGPT2诱导。

[0503] 实施例11：DACC/siRNA处理增加肺炎链球菌感染的肺模型(小鼠)中的存活[0504] 通过尾静脉注射，用DACC9lipoplex(2.8mg siRNA/kg体重)或蔗糖(作为lipoplex的空载对照)处理雄性的无特定病原体的ICR小鼠(体重20-22g)。24小时以后，用LD 90-100剂量(0.02ml,7-9x 106CFU)用肺炎链球菌(ATCC 6301)气管内地感染所有小鼠以诱导急性肺炎。感染以后2小时，通过静脉内途径施用单次次优剂量的氨苄青霉素“AMP”(3mg/kg)或0.9％NaCl。监测小鼠的存活直到感染以后10天(参见图10a)。与使用的材料和方法有关的实验的其它方面根据实施例1进行。结果显示在图10b中。

[0505] 如从图10b可见，在没有氨苄青霉素处理的情况下，小鼠在肺炎链球菌感染后3天内死亡。通过单次剂量的氨苄青霉素，仅观察到存活的中等增加。除了氨苄青霉素处理以外的DACC9/Angpt2siRNA(DACC9/siRNAAngpt2)预处理显著增加小鼠存活。>50％的动物存活指示试验物的显著活性。

[0506] 实施例12：小鼠中EDN-1表达的减少

[0507] 该动物研究的目的是评价用于靶向内皮缩血管肽1编码基因EDN1的不同递送系统。用于小鼠的实验设定和处理方案描绘在图11中。

[0508] 通过推注施用，用单剂量的与DACC9、DACC10一起配制的靶向EDN1的siRNA(被称作EDN1-hmr2)(其由两条单独的链组成，所述链彼此100％互补，其中每条链由19个核苷酸组成)或用三个剂量的与Atuplex一起配制的EDN1-hmr2siRNA处理小鼠。对照lipoplex含有靶向编码可溶性VEGF受体1(sFlt1)的基因的siRNA(其被称作sFLT1-hm4)。在处理后48小时分析肺组织中的靶基因表达。

[0509] 结果显示在图12中。从所述图12显而易见，就向肺组织递送siRNA的目的而言，与DACC9或DACC10一起配制的siRNA比与Atuplex一起配制的siRNA更有效。

[0510] 在本文中列举的所有参考文献通过引用并入本文。

[0511] 在本说明书、权利要求书和/或附图中公开的本发明的特征可以单独地和以其任意组合成为用于实现其不同形式的本发明的材料。