一种豆类松散型胚性愈伤组织的通用诱导方法

摘要

本发明公开了一种豆类松散型胚性愈伤组织的通用诱导方法，包括播种获得无菌苗，剪取无菌苗子叶、叶片和两叶片间的茎段作为外植体，接种到1号培养基上进行愈伤组织的诱导，15‑20天后，将诱导出的愈伤组织接种到2号培养基上进行胚性愈伤组织的诱导，在从愈伤组织到胚性愈伤组织的诱导过程中，每10‑15天继代培养一次，继代培养过程中，选取表面光滑的表层愈伤组织块进行转移，当继代培养4‑5次后，就完成了豆类胚性愈伤组织的诱导，该方法为标准的豆类松散型胚性愈伤组织的诱导体系。可以用于解决豆类愈伤组织诱导过程中由于愈伤组织整体结构和细胞形态不均一，导致诱导效率降低的问题。

权利要求

1.一种豆类松散型胚性愈伤组织的诱导方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）播种获得无菌苗：豆类种子首先使用20-40%（w/w）次氯酸钠浸没，漂洗20-30分钟后；然后无菌水冲洗3次，每次2-3分钟，最后直接播种于MS培养基中，每瓶5-6粒，待7-10天后得到无菌苗；

（2）剪取无菌苗子叶、叶片和两叶片间的茎段作为外植体，接种到1号培养基上进行愈伤组织的诱导；所述的1号培养基指的是：MS培养基+1mg/mL 2,4-D；

（3）15-20天后，将诱导出的愈伤组织接种到2号培养基上进行胚性愈伤组织的诱导，在从愈伤组织到胚性愈伤组织的诱导过程中，每10-15天继代培养一次，继代培养过程中，选取表面光滑的表层愈伤组织块进行转移；所述的2号培养基指的是：MS培养基+1mg/mL 6-BA+1mg/mL 2,4-D+1 mg/mL AgNO3；

（4）当继代培养4-5次后，就完成了豆类的胚性愈伤组织的诱导，该方法为标准的豆类松散型胚性愈伤组织的诱导体系；其中的豆类指菜豆、豇豆、豌豆、蚕豆。

2.权利要求1所述豆类松散型胚性愈伤组织的通用诱导方法在用于解决豆类愈伤组织诱导过程中由于愈伤组织整体结构和细胞形态不均一，导致诱导效率降低方面的应用。

说明书

一种豆类松散型胚性愈伤组织的通用诱导方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术在蔬菜育种中的应用技术领域，涉及利用组织培养技术诱导松散型胚性愈伤组织的通用方法。

背景技术

[0002] 豆类在我国栽培面积很大，栽培范围十分广泛。近年来我国豆类生产发展迅速，据FAO报告，我国食荚豇豆和菜豆2013年种植面积约为7000余万亩，位居世界第一。

[0003] 愈伤组织根据组织学观察、外观特征及其再生性、再生方式等可分成两大类：胚性愈伤组织（embryonic callus，EC）和非胚性愈伤组织（non-embryonic callus，NEC）。从细胞学来看，胚性愈伤组织是由胚性细胞（embryonic cell）组成的细胞团，具有细胞较小且等直径，原生质浓厚，无液泡，核大，分裂活性强等特点。此种细胞具有类似胚细胞性质、容易调控分化表达全能性。胚性愈伤组织也是植物的体细胞胚胎发生(somatic embryogenesis)的途径之一。

[0004] 松散型愈伤组织的应用非常广泛：第一，用于植物的快速繁殖。使用松散型胚性愈伤组织的体胚分化效率大大高于普通的愈伤再生。第二，作为研究体系或研究平台，进行品种适应性研究。第三，用于种质资源创新。在构建的松散型胚性愈伤体系基础之上，通过加入诱变与胁迫等技术，可以筛选和创新种质资源。第四，用于种质保存。胚性细胞系具有良好的胚胎发生能力，且易于保存，经研究胚性愈伤组织经冷冻后存活率很高。恢复培养后仍然能进行正常的体胚发生，成熟和植株再生。第五，用于提取植物中有效成份。通过诱导高质量且能长期继代保持葡萄的松散型愈伤组织，为生产生物活性物质建立实验体系。第六，用于基因工程育种。胚性愈伤组织及植株再生，遗传上具有稳定性，植株再生率高，以此作为转基因技术中的受体材料，在分子水平通过遗传转化技术将有用的外源基因导入目的植物中，获得抗除草剂、抗病毒、抗虫、抗旱或抗寒的转基因植株，具有重要意义。第七，用于对体细胞胚胎形成的机理进行深入研究。松散型胚性愈伤组织为机理的深入研究提供了很好的平台。

[0005] 目前，我国关于松散型愈伤组织的诱导研究在龙眼上已经比较成熟，豆类愈伤组织诱导只停留在普通硬愈伤诱导，硬愈伤组织的内部与外部细胞结构不一致，内部细胞木栓化不能继续诱导成苗，只有外层细胞具有继续诱导的可能。并且只是针对特定品种，没有豆类的通用诱导配方。豆类松散型愈伤组织诱导还未见报道。

发明内容

[0006] 本发明目的是突破豆类组织培养技术中的硬愈伤内部细胞木栓化的瓶颈，使诱导的愈伤组织的内部与外部细胞均一、稳定，同时具备继续成苗能力；解决愈伤诱导过程中出现的褐化、老化等问题。提供一个豆类松散型胚性愈伤组织的诱导方法，该方法可获得高质量、稳定、能够长期继代保持的胚性愈伤组织，并且构建一套豆类通用的松散型胚性愈伤组织实验体系。

[0007] 为实现上述目的本发明公开了如下的记述内容：

[0008] 一种豆类松散型胚性愈伤组织的通用诱导方法，其特征在于按如下的步骤进行：

[0009] （1）播种获得无菌苗：豆类种子首先使用20-40%（w/w）次氯酸钠浸没，漂洗20-30分钟后；然后无菌水冲洗3次，每次2-3分钟，最后直接播种于MS培养基中，每瓶5-6粒，待7-10天后得到无菌苗;

[0010] （2）剪取无菌苗子叶、叶片和两叶片间的茎段作为外植体，接种到1号培养基上进行愈伤组织的诱导；所述的1号培养基指的是：MS培养基+1mg/mL 2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）

[0011] （3）15-20天后，将诱导出的愈伤组织接种到2号培养基上进行胚性愈伤组织的诱导，在从愈伤组织到胚性愈伤组织的诱导过程中，每10-15天继代培养一次，继代培养过程中，选取表面光滑的表层愈伤组织块进行转移；所述的2号培养基指的是：MS培养基+1mg/mL 6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）+1mg/mL 2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）+1 mg/mL AgNO3；

[0012] （4）当继代培养4-5次后，就完成了豇豆和菜豆的胚性愈伤组织的诱导，该方法为标准的豇豆和菜豆松散型胚性愈伤组织的诱导体系。

[0013] 本发明所用的到的继代培养是指：愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，营养物质和水分逐渐被消耗，代谢产物也不断被积累，必须将愈伤组织转移到新鲜培养基上，以保障愈伤组织无限期地保持不分化的增殖状态的过程称之为继代培养。

[0014] 本发明所用的MS培养基指的是：（mg/L）

[0015] 大量元素：NH4NO3 1650； KNO3 1900； CaCl2·2H2O 440； MgSO4·7H2O 370； KH2PO4 700；

[0016] 微量元素：KI 0.83；H3BO3 6.2；MnSO4·4H2O 22.3；ZnSO4·7H2O 8.6；Na2MnO4·2H2O 0.25；CuSO4·5H2O 0.025；CoCl2·6H2O 0.025；FeSO4·7H2O（27.8）+Na2-EDTA·2H2O（37.3）

[0017] 有机成分：肌醇 100；烟酸 0.5；盐酸吡哆醇（维生素B6） 0.5；盐酸硫胺素（维生素B1） 0.5；甘氨酸 2

[0018] 本发明进一步公开了豆类松散型胚性愈伤组织的通用诱导方法目的是突破豆类组织培养技术中的硬愈伤内部细胞木栓化的瓶颈，使诱导的愈伤组织的内部与外部细胞均一、稳定，同时具备继续成苗能力；解决愈伤诱导过程中出现的褐化、老化等问题。实验结果证明采用本发明的方法可以提供一个豆类松散型胚性愈伤组织的诱导方法，该方法可获得高质量、稳定、能够长期继代保持的胚性愈伤组织，并且构建一套豆类通用的松散型胚性愈伤组织实验体系。

[0019] 本发明一个典型诱导松散型胚性愈伤组织的通用步骤如下：

[0020] （1）播种获得无菌苗：豆类种子首先使用20-40%（w/w）次氯酸钠浸没，漂洗20-30分钟后；然后无菌水冲洗3次，每次2-3分钟，最后直接播种于MS培养基中，每瓶5-6粒，待7-10天后得到无菌苗；

[0021] （2）剪取无菌苗子叶、叶片和两叶片间的茎段作为外植体，接种到1号培养基上进行愈伤组织的诱导；所述的1号培养基指的是：MS培养基+1mg/mL 2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）；

[0022] （3）15-20天后，将诱导出的愈伤组织接种到2号培养基上进行胚性愈伤组织的诱导，在从愈伤组织到胚性愈伤组织的诱导过程中，每10-15天继代培养一次，继代培养过程中，选取表面光滑的表层愈伤组织块进行转移；所述的2号培养基指的是：MS培养基+1mg/mL 6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）+1mg/mL 2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）+1 mg/mL AgNO3；

[0023] （4）当继代培养4-5次后，含水量很大的，较稀软的愈伤组织开始转变为稍硬的颗粒状松散型愈伤组织，而且其颜色从白色透明状逐渐过渡到灰白色或黄绿色，此时的愈伤组织从组织结构上看为许多球状体构成的松散结构。当以上特征愈伤组织出现时，就完成了豆类胚性愈伤组织的诱导。本方法通过对豆类胚性愈伤组织的诱导，建立了标准的豆类松散型胚性愈伤组织的诱导体系。

[0024] 本发明公开的豆类松散型胚性愈伤组织的通用诱导方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：

[0025] （1）松散型胚性愈伤组织团内外部细胞均一、稳定，同时具备继续成苗的能力。

[0026] （2）构成松散型胚性愈伤组织团的细胞全部可以成苗，解决诱导效率低的问题，提供一个可获得高质量、稳定、能够长期继代保持的豆类松散型胚性愈伤组织的诱导方法。

[0027] （3）构建一套豆类通用的松散型胚性愈伤组织实验体系。

[0028] 附图说明：

[0029] 图1为松散型胚性愈伤组织外部形态与结构图；

[0030] 图2为显微镜下松散型胚性愈伤组织细胞形态图（显微镜型号：LEICA DM2000）。

具体实施方式

[0031] 下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

[0032] 实施例1

[0033] 菜豆“双丰一号”松散型胚性愈伤组织诱导方法

[0034] （1）播种获得无菌苗：菜豆种子经过20%(w/w)次氯酸钠漂洗20分钟后，无菌水冲洗3次，每次2-3分钟，直接播种于MS培养基中，每瓶5-6粒，待7天后得到无菌苗。

[0035] （2）剪取无菌苗子叶、叶片和两叶片间的茎段等作为外植体，接种到1号培养基（MS培养基+0.5mg/mL 2,4-D）上进行愈伤组织的诱导；

[0036] （3）15天后，将诱导出的愈伤组织接种到2号培养基上（MS培养基+0.5mg/mL 6-BA+1mg/mL 2,4-D+1 mg/mL AgNO3）进行胚性愈伤组织的诱导，在从愈伤组织到胚性愈伤组织的诱导过程中，每10天继代培养一次，继代培养过程中，选取表面光滑的表层愈伤组织块进行转移；

[0037] （4）当继代培养4-5次后，含水量很大的，较稀软的愈伤组织开始转变为稍硬的颗粒状松散型愈伤组织，而且其颜色从白色透明状逐渐过渡到灰白色，此时的愈伤组织从组织结构上看为许多球状体构成的松散结构(见图2)。当以上特征愈伤组织出现时，就完成了豇豆和菜豆的胚性愈伤组织的诱导。本方法通过对豇豆和菜豆胚性愈伤组织的诱导，建立了标准的豇豆和菜豆松散型胚性愈伤组织的诱导体系。

[0038] 实施例2

[0039] （1）播种获得无菌苗：菜豆种子经过40%(w/w)次氯酸钠漂洗20分钟后，无菌水冲洗3次，每次2-3分钟，直接播种于MS培养基中，每瓶5-6粒，待7天后得到无菌苗。

[0040] （2）剪取无菌苗子叶、叶片和两叶片间的茎段等作为外植体，接种到1号培养基（MS培养基+0.5mg/mL 2,4-D）上进行愈伤组织的诱导；

[0041] （3）20天后，将诱导出的愈伤组织接种到2号培养基上（MS培养基+0.5mg/mL 6-BA+1mg/mL 2,4-D+1 mg/mL AgNO3）进行胚性愈伤组织的诱导，在从愈伤组织到胚性愈伤组织的诱导过程中，每15天继代培养一次，继代培养过程中，选取表面光滑的表层愈伤组织块进行转移；

[0042] （4）当继代培养4-5次后，含水量很大的，较稀软的愈伤组织开始转变为稍硬的颗粒状松散型愈伤组织，而且其颜色从白色透明状逐渐过渡到灰白色，此时的愈伤组织从组织结构上看为许多球状体构成的松散结构(见图2)。当以上特征愈伤组织出现时，就完成了豇豆和菜豆的胚性愈伤组织的诱导。本方法通过对豇豆和菜豆胚性愈伤组织的诱导，建立了标准的豇豆和菜豆松散型胚性愈伤组织的诱导体系。

[0043] 实施例3

[0044]

[0045] 结论：

[0046] （1）豆类松散型胚性愈伤组织通用诱导方法的建立，可以得到内外部细胞均一、稳定，同时具备继续成苗能力的球形胚性细胞。

[0047] （2）构成松散型胚性愈伤组织团的细胞90%以上可以成苗，提高诱导效率。

[0048] （3）构建一个豆类通用的松散型胚性愈伤组织实验体系平台，为科学研究奠定基础。