用于咽炎扁桃体炎上呼吸道感染的炎宁液体制剂的检测法

摘要

本发明属于中药领域，具体涉及一种炎宁液体制剂的质量检测方法，更具体的是涉及一种炎宁液体制剂中活性成分的检测方法。其通过HPLC方法对炎宁液体制剂中的阿克替苷、槲皮素和异荭草素的含量进行测定。所述检测方法具体为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇：乙腈：0.4％磷酸溶液＝40：20：40为流动相，检测波长为360nm，流速为0.8ml/min。

权利要求

1.一种炎宁液体制剂的检测方法，其通过HPLC方法对炎宁液体制剂中的阿克替苷、槲皮素和异荭草素的含量进行测定；

所述检测方法具体为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇：乙腈：0.4%磷酸溶液＝40：20：40为流动相，检测波长为360nm，流速为0.8ml/min，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得所述炎宁液体制剂中阿克替苷、槲皮素和异荭草素的含量；

所述对照品溶液的制备方法为精密称取阿克替苷、槲皮素和异荭草素标准品，加流动相制成1mL含0.080mg阿克替苷、0.100mg槲皮素和0.150mg异荭草素的对照品溶液；

所述供试品溶液的制备方法为取所述炎宁液体制剂5mL，置25mL容量瓶中，加甲醇

15mL，超声波处理5分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，0.45μm滤膜滤过即得。

说明书

用于咽炎扁桃体炎上呼吸道感染的炎宁液体制剂的检测法

技术领域

[0001] 本发明属于中药领域，具体涉及一种炎宁液体制剂的质量检测方法，更具体的是涉及一种炎宁液体制剂中活性成分的检测方法。

背景技术

[0002] 炎宁相关制剂由鹿茸草、白花蛇舌草、鸭跖草(2∶1∶1)等中草药组成，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准——中药成方制剂》第5册(WS3-B-0956-91)所颁布的中成药标准中，功能清热解毒，消炎止痢，用于上呼吸道感染，扁桃体炎，尿路感染，急性菌痢，肠炎。

[0003] 炎宁液体制剂是由哈尔滨市康隆药业有限责任公司研发的并且具有专利保护的改进剂型(授权公告号为CN102335272B)，研究表明炎宁液体制剂更利于人体吸收，起效快，服用方便并且适用人群广。

[0004] 在现有的炎宁液体制剂质量标准中，只对熊果酸进了鉴别，且效果不是很明显，在含量测定中仅仅测定了芦丁的含量。另外，上述质量标准并不能对炎宁液体制剂的质量进行有效的控制。以上问题不利于生产厂家和监督部门对产品质量的整体控制。为了更进一步保证该产品的质量及更有利于对该产品质量的监督、管理，亟需对该药品的检测方法进行改进，从而更进一步保证该产品的质量和疗效。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的是提供一种炎宁液体制剂的质量检测方法，其通过HPLC方法对炎宁液体制剂中的阿克替苷、槲皮素和异荭草素的含量进行测定。

[0006] 在本发明的一个实施方案中，所述检测方法具体为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇：乙腈：0.4％磷酸溶液＝40：20：40为流动相，检测波长为360nm，流速为0.8ml/min，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得所述炎宁液体制剂中阿克替苷、槲皮素和异荭草素的含量。

[0007] 在本发明的进一步实施方案中，所述槲皮素的检测方法还包括对照品溶液和供试品溶液的制备，所述对照品溶液的制备方法为精密称取阿克替苷、槲皮素和异荭草素标准品，加流动相制成1mL含0.080mg阿克替苷、0.100mg槲皮素和0.150mg异荭草素的对照品溶液。所述供试品溶液的制备方法为取所述炎宁液体制剂5mL，置25mL容量瓶中，加甲醇15mL，超声波处理5分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，0.45μm滤膜滤过即得。

[0008] 本发明针对现有质量控制标准简单，产品质量不易控制的缺点，根据所述炎宁液体制剂中各味药材特性及其制备工艺，研究拟定了具体可行的含量测定方法，以有效地控制炎宁液体制剂的质量，从而确保该制剂的临床疗效，并有效地降低治疗成本。

具体实施方式

[0009] 下面将进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

[0010] 以下实施例中，检测使用的炎宁液体制剂均购自哈尔滨市康隆药业有限责任公司。

[0011] 实施例1炎宁液体制剂的检测方法控制的炎宁液体制剂对扁桃体炎的治疗效果。

[0012] 本临床试验纳入受试人群为：小儿急性扁桃体炎(充血性)(肺经风热证)，纳入标准为：1、符合西医小儿急性充血性扁桃体炎的诊断标准，病程不超过48h者；2、符合中医肺经风热证诊断标准；3、年龄3-12岁；4、体温≤38.5℃。

[0013] 本临床试验采用小儿咽扁颗粒平行对照，试验组为炎宁液体制剂，口服，3-5岁一次3mL，一日4次；6-12岁一次5mL，一日4次；连用5天。对照组小儿咽扁颗粒，口服，3-5岁一次4g，一日3次；6-12岁一次8g，一日3次；连用五天。

[0014] (1)病例分布：

[0015] 计划入组72例，实际入组72例(试验组36例，对照组36例)。对照组剔除1例，剔除率为2.78％。

[0016] 进入FAS分析71例(试验组36例，对照组35例)；进入PPS分析71例(试验组36例，对照组35例)；进入SAS分析71例(试验组36例，对照组35例)。

[0017] 表1病例分布情况

[0018]

[0019] (2)疗效分析主要症状(咽痛、恶风发热)改善情况

[0020] FAS分析：两组主要症状评分改善情况有统计学意义(P＜0.05)，试验组优于对照组。两组治疗前后均数±标准差分别为试验组(6.39±2.13)、对照组(5.09±2.49)，试验组中位数为8.00，对照组中位数为6.00。FAS分析和PPS分析结果相近。

[0021] FAS分析：两组主要症状(咽痛、恶风发热)评分等级程度有统计学意义(P＜0.05)，试验组优于对照组。治疗后试验组痊愈32例，显效0例，有效3例，无效1例，痊愈率为88.89％，有效率97.22％，无效率2.78％；对照组痊愈24例，显效0例，有效6例，无效5例，痊愈率为68.57％，有效率85.71％，无效率14.29％。两组主要症状疗效情况组内差异有统计学意义(P＜0.05)。FAS分析和PPS分析结果相近。

[0022] 表2两组患者疗后主要症状评分改善情况比较(FAS)

[0023]

[0024] 表3两组患者疗后主要症状疗效情况比较(PPS FAS)

[0025]

[0026] 注：P<0.05表示具有统计学意义

[0027] (3)中医证候疗效：

[0028] 中医证候疗效判定标准

[0029] ①痊愈：中医临床症状、体征消失或基本消失，证候积分减少≥95％；

[0030] ②显效：中医临床症状、体征明显改善，证候积分减少≥70％；

[0031] ③有效：中医临床症状、体征均有好转，证候积分减少≥30％；

[0032] ④无效：中医临床症状、体征无明显改善，甚或加重，证候积分减少＜30％。

[0033] FAS分析，中医证候评价例数试验组36例，对照组35例。治疗后试验组痊愈27例，显效5例，无效4例，痊愈率75％，显效率88.89％，无效率11.11％。对照组痊愈17例，显效7例，无效11例，痊愈率48.57％，显效率68.57％，无效率31.43％。两组中医证候疗效组内比较有统计学意义(P＜0.05)。试验组优于对照组。FAS分析和PPS分析结果相近。

[0034] 表4两组治疗后中医证候评分疗效比较(PPS FAS)

[0035]

[0036] 注：P<0.05表示具有统计学意义

[0037] (4)不良事件与不良反应

[0038] 试验中未发生死亡，未发生严重不良事件，未发生不良事件，未发生不良反应。详见表5和表6

[0039] 表5两组病例不良事件总结表

[0040]

[0041] 注：括号内为百分数。

[0042] 表6两组病例不良反应总结表

[0043]

[0044] 注：括号内为百分数。

[0045] (5)经济性分析

[0046] 经济性评价标准：

[0047] 成本-效果分析：成本效果比＝平均成本/有效率(C/E)；

[0048] 增量成本-效果分析：增量成本-效果比＝平均成本增量/有效率增量。采用相应的统计方法进行统计分析。

[0049] 主要症状有效率经济性效果(PPS分析)：

[0050] 炎宁液体制剂药物的成本效果比为369.52，代表获得单位效果所需要的成本为369.52元，即表示在本研究的小儿扁桃体病人中使用A药，每增加1例主要症状有效人数，所花费的平均成本为369.52元；小儿咽扁颗粒药物的成本效果比为391.65，代表获得单位效果所需要的成本为391.65元，即表示在本研究的小儿扁桃体的病人中使用B药，每增加1例主要症状有效人数，所花费的平均成本为391.65元。

[0051] 试验药与对照药增量成本效果比为204.78，即与对照药相比较，试验药的主要症状有效率每提高1％，成本需要增加2.0478元。详见表7。

[0052] 表7两组主要症状有效率成本效果分析结果(PPS)

[0053]

[0054] 表8两组主要症状有效率敏感性分析结果(PPS)

[0055]

[0056] 注：两组药物成本下降幅度大于等于40％时，试验组的成本低于对照组，有效率高于对照组，是优势方案。

[0057] 实施例2炎宁液体制剂的检测方法控制的炎宁液体制剂对上呼吸道感染的治疗效果

[0058] 本临床试验纳入受试人群为：急性上呼吸道感染(外感风热证)。本临床试验采用疏风解毒胶囊平行对照，试验组炎宁液体制剂，口服，一次10mL，一日3次，连用3天；对照组疏风解毒胶囊，口服，一次4粒，一日3次，连用3天。

[0059] (1)病例分布

[0060] 计划入组72例，实际入组72例(试验组36例，对照组36例)。脱落2例(试验组0例，对照组2例)，脱落率为5.56％，剔除1例(试验组1例，对照组0例)，剔除率为1.39％。

[0061] 进入FAS分析69例(试验组35例，对照组34例)；进入PPS分析69例(试验组35例，对照组34例)；进入SAS分析69例(试验组35例，对照组34例)。详见表9。

[0062] 表9各中心病例分布情况

[0063]

[0064] (2)疗效分析 主要症状(恶风、发热咽痛、口渴)改善情况

[0065] FAS分析集试验组35例，对照组34例。两组主要症状评分分值变化治疗前后均数±标准差分别为试验组(8.17±2.97)、对照组(6.35±4.68)，试验组中位数为8.00，对照组中位数为6.00。两组主要症评分分值变化改善情况试验组高于对照组，两组比较无统计学意义(P＝0.0670)。FAS分析和PPS分析结果相近。

[0066] FAS分析集，两组主要症状评分等级改善情况组间差异有统计学意义(P＝0.0009)，试验组优于对照组。治疗后试验组痊愈33例，有效1例，无效1例，痊愈率为
94.29％，有效率97.14％，无效率2.86％；对照组痊愈21例，有效1例，无效12例，痊愈率为
61.76％，有效率64.71％，无效率35.29％。FAS分析和PPS分析结果相近。详见表10～12。

[0067] 表10主要症状(恶风、发热、咽痛、口渴)评分改善情况(FAS)

[0068]

[0069] 表1两组患者疗后主要症状疗效情况比较(PPS FAS)

[0070]

[0071] P<0.05表示具有统计学意义

[0072] 表12两组患者疗后主要症状有效率情况比较(FAS)

[0073]

[0074] 注：括号内为百分数；对FAS数据集有卡方＝11.8671，P值＝0.0006。

[0075] (3)中医证候疗效

[0076] FAS分析集显示两组中医证候疗效组间比较有统计学意义(P＜0.05)。试验组优于对照组。治疗后试验组痊愈33例，有效1例，无效1例，痊愈率94.29％，有效率97.14％，无效率2.86％。对照组痊愈21例，显效1例，有效1例，无效11例，痊愈率61.76％，显效率64.71％，有效率67.65％，无效率32.35％。FAS分析和PPS分析结果相近。详见表13～表15。

[0077] 表13两组治疗后中医证候评分疗效比较(PPS FAS)

[0078]

[0079] 注：P<0.05表示具有统计学意义

[0080] 表14两组中医证候评分有效率情况比较(FAS)

[0081]

[0082] 注：括号内为百分数。对PPS数据集有卡方＝10.4438，P值＝0.0012。

[0083] 表15两组中医证候评分显效率情况比较(FAS)

[0084]

[0085] 注：括号内为百分数；对PPS数据集有卡方＝9.3303，P值＝0.0023。

[0086] (4)不良事件与不良反应

[0087] 试验中未发生死亡，未发生严重不良事件，未发生不良事件，未发生不良反应。详见表16～表17。

[0088] 表16两组患者不良事件发生率

[0089]

[0090] 注：括号内为百分数。

[0091] 表17两组患者不良反应发生率

[0092]

[0093] 注：括号内为百分数。

[0094] (5)经济性分析

[0095] 试验组药物的成本效果比为221.03，代表获得单位效果所需要的成本为221.03元，即表示在本研究的上呼吸道感染病人中每增加1例主要症状有效人数，所花费的平均成本为221.03元；对照组药物的成本效果比为327.55，代表获得单位效果所需要的成本为327.55元，即表示在本研究的上呼吸道感染病人中每增加1例主要症状有效人数，所花费的平均成本为327.55元。

[0096] 试验药与对照药增量成本效果比为8.48，即与对照药相比较，试验药的主要症状有效率每提高1％，成本需要增加8.48元。详见表18～19。

[0097] 表18两组主要症状有效率成本效果分析结果(PPS)

[0098]

[0099] 表19两组主要症状有效率敏感性分析结果(PPS)

[0100]

[0101] 实施例3炎宁液体制剂的检测方法控制的炎宁液体制剂对咽炎的治疗效果[0102] 本临床试验纳入受试人群为：急性咽炎(肺经风热证)。本临床试验采用蓝芩口服液平行对照，试验组炎宁液体制剂，口服，一次10mL，一日3次，连用5天；对照组蓝芩口服液，口服，一次2支，一日3次，连用5天。

[0103] (1)病例分布

[0104] 计划入组72例，实际入组72例(试验组36例，对照组36例)。脱落3例(试验组1例，脱落率为2.78％；对照组2例，脱落率为5.56％)，无剔除病历。

[0105] 进入FAS分析69例(试验组35例，对照组34例)；进入PPS分析68例(试验组34例，对照组34例)；进入SAS分析69例(试验组35例，对照组34例)。详见表1～表4。

[0106] 表20各病例分布情况

[0107]

[0108] 表21试验病例情况

[0109]

[0110] 注：试验组2038号患者为脱落病例，未进FAS，PPS，SAS集；试验组2010号患者用药依从性差，未进PPS集，进入了FAS集和SAS集。对照组2037号和2055号患者为脱落病例，未进FAS，PPS，SAS集；

[0111] (2)疗效分析 主要症状改善情况

[0112] 主要症状改善情况：FAS分析集试验组35例，对照组34例。两组主要症状评分分值变化治疗前后均数±标准差分别为试验组(0.51±1.77)、对照组(1.94±3.22)，试验组和对照组中位数均为0.00。两组主要症评分分值变化改善情况试验组高于对照组，两组比较无统计学意义(P＝0.0270)。FAS分析和PPS分析结果相近。

[0113] FAS分析集，两组主要症状评分等级改善情况组间差异有统计学意义(P＝0.0286)，试验组优于对照组。治疗后试验组痊愈32例，显效0例，有效0例，无效3例，痊愈率为91.43％，有效率91.43％，无效率8.57％；对照组痊愈24例，显效0例，有效0例，无效10例，痊愈率为70.59％，有效率70.59％，无效率29.41％。FAS分析和PPS分析结果相近。详见表22～表25。

[0114] 表22两组患者治疗后主要症状(咽痛、咽部红肿)评分情况(FAS)

[0115]

[0116]

[0117] 表23两组患者疗后主要症状疗效情况比较(PPS FAS)

[0118]

[0119] 注：P<0.05表示具有统计学意义

[0120] 表24两组患者疗后主要症状有效率情况比较(FAS)

[0121]

[0122] 注：括号内为百分数；对FAS数据集有卡方＝4.8986，P值＝0.0269。

[0123] 表25两组患者疗后主要症状显效率情况比较(FAS)

[0124]

[0125] 注：括号内为百分数；对FAS数据集有卡方＝4.8986，P值＝0.0269。

[0126] (3)中医证候疗效

[0127] FAS分析集显示两组中医证候疗效组间比较有统计学意义((P＜0.05)。试验组优于对照组。治疗后试验组痊愈32例，显效0例，有效0例，无效3例，痊愈率91.43％，有效率91.43％，无效率8.57％。对照组痊愈24例，显效0例，有效0例，无效10例，痊愈率70.59％，有效率70.59％，无效率29.41％。FAS分析和PPS分析结果相近。详见表26～表28。

[0128] 表26两组治疗后中医证候评分疗效比较(PPS FAS)

[0129]

[0130] 注：P<0.05表示具有统计学意义

[0131] 表27两组中医证候评分有效率情况比较(FAS)

[0132]

[0133] 注：括号内为百分数。对FAS数据集有卡方＝4.8986，P值＝0.0269。

[0134] 表28两组中医证候评分显效率情况比较(FAS)

[0135]

[0136] 注：括号内为百分数；对FAS数据集有卡方＝4.8986，P值＝0.0269。

[0137] (4)不良事件与不良反应

[0138] 试验中未发生死亡，未发生严重不良事件，试验组无不良事件，对照组1例不良事件(轻度尿路感染，发生在试验结束时，与药物关系为肯定无关，经随访消失。)，未发生不良反应。详见表29～表31。

[0139] 表29两组病例不良事件总结表

[0140]

[0141] 注：括号内为百分数。

[0142] 表30两组患者不良事件详表

[0143]

[0144] 表31两组病例不良反应总结表

[0145]

[0146] (5)经济性分析

[0147] 炎宁液体制剂的成本效果比为242.69，代表获得单位效果所需要的成本为242.69元，即表示在本研究的咽炎病人中，使用试验药，每增加1例主要症状有效人数，所花费的平均成本为242.69元；蓝芩口服液的成本效果比为282.66，代表获得单位效果所需要的成本为282.66元，即表示在本研究的咽炎病人中，使用对照药，每增加1例主要症状有效人数，所花费的平均成本为282.66元。

[0148] 试验药与对照药的增量成本效果比为107.29，表示与对照药相比，试验药的主要症状有效率每提高1％，成本需要增加1.0729元。详见表38－39。

[0149] 表32两组主要症状有效率成本效果分析结果(PPS)

[0150]

[0151] 表33两组主要症状有效率敏感性分析结果(PPS)

[0152]

[0153]

[0154] 注：考虑炎宁液体制剂成本-效果比大于蓝芩口服液，此处敏感性分析只考虑炎宁液体制剂药价下调，以探索炎宁液体制剂成本-效果比小于蓝芩口服液的情况。

[0155] 由上述试验例可知，通过本发明的检测方法对炎宁液体制剂的质量进行控制，其对扁桃体炎、上呼吸道感染和咽炎治疗的有效率均大于90％，均无不良反应及不良事件发生，且从经济效果性可看出，本品的成本低于对照组，有效率高于对照组。

[0156] 实施例4炎宁液体制剂的质量检测

[0157] (1)对照品溶液的制备：精密称取阿克替苷、槲皮素和异荭草素标准品，加流动相制成1mL含0.080mg阿克替苷、0.100mg槲皮素和0.150mg异荭草素的对照品溶液。

[0158] (2)供试品溶液的制备：精密量取炎宁液体制剂5mL，置25mL容量瓶中，加甲醇15mL，超声波处理5分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，0.45μm滤膜滤过即得。

[0159] (3)HPLC检测：Waters CORTECS C18(柱长100mm，内径4.6mm)色谱柱；流动相为甲醇：乙腈：0.4％磷酸溶液＝40：20：40；，检测波长为360nm，流速为0.8ml/min，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定。

[0160] 通过峰面积测量及计算获得阿克替苷、槲皮素和异荭草素的具体含量，结果如下：

[0161]  阿克替苷 槲皮素 异荭草素
含量 0.374mg/ml 0.512mg/ml 0.764mg/ml

[0162]

[0163] 对比例1：本发明按照中国专利CN201310103392说明书实施例部分公开的HPLC色谱条件，对本发明的供试液和对照品溶液进行了检测及计算，具体结果如下：

[0164]

[0165] 对比例2：对实施例4的流动相进行调整，具体调整为甲醇：乙腈：0.4％磷酸溶液＝40：30：30；其他色谱条件同实施例4，经测算具体结果如下：

[0166]

[0167] 实施例5方法学考察

[0168] (1)线性范围

[0169] 按照实施例4的测定方法，精密量取混合对照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，4.0ml，分别置5ml量瓶，加70％甲醇稀释至刻度，摇匀，结合母液制得混合对照品系列溶液，过滤，分析，平行进样2次，以对照品浓度为横坐标(X)，以对照品峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准工作曲线和计算线性范围。

[0170]

[0171] (2)精密度试验

[0172] 按照实施例4的测定方法，取同一对照品溶液在上述色谱条件下连续进样6次，计算化合物相对峰面积RSD，结果表明方法精密度良好。

[0173]

[0174] 按照对比例1的检测方法，进行上述精密度测试，结果如下：

[0175]

[0176] 按照对比例2的检测方法，进行上述精密度测试，结果如下：

[0177]

[0178] (3)重复性试验

[0179] 取同一批号炎宁液体制剂6份，制备供试品，在上述色谱条件下分析，计算化合物含量RSD，结果表明方法重复性良好。

[0180]

[0181] 按照对比例1的检测方法，进行上述重复性测试，结果如下：

[0182]

[0183] 按照对比例2的检测方法，进行上述重复性测试，结果如下：

[0184]

[0185] 本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。