一种唾液中丙烯醛-DNA加合物的测定方法

摘要

一种唾液中丙烯醛‑DNA加合物的测定方法，即α‑Acr‑dG和γ‑Acr‑dG的测定方法，包括采用OG‑500唾液采集管收集唾液，对唾液进行DNA提取，DNA溶液进行酶水解并依次加入稳定同位素内标和DNA水解酶。水解液经Strata‑X小柱固相萃取，收集洗脱液，室温下氮吹至干，复溶于100 μL的30%甲醇水溶液，引入LC‑MS/MS系统分析，可准确检测出α‑Acr‑dG和γ‑Acr‑dG的含量水平。本发明采用稳定同位素作为内标定量分析物可以减少样品前处理过程中引起的误差，串联质谱法更好的提高了方法的选择性、准确性和灵敏度。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了目标物的分离度。

权利要求

1.一种唾液中丙烯醛-DNA加合物的测定方法，所述丙烯醛-DNA加合物是6-羟基-1,N2-丙醇-2'-鸟嘌呤（α-Acr-dG）和8-羟基-1,N2-丙醇-2'-鸟嘌呤（γ-Acr-dG），其特征在于：包括以下具体步骤：a、唾液采集：用Oragene·DNA唾液采集器对人体唾液进行标准化采集；

b、唾液DNA的提取：Oragene唾液混合液于50℃水浴孵育至少1h后，加入Oragene 净化液，涡旋振荡，冰浴孵育10 min；于室温下离心；移取上层清液于一新的微量离心管中，加入纯乙醇，轻轻震荡数秒；静置使DNA分子完全沉淀，离心并去上清液；加入70%的乙醇水溶液清洗DNA团块；用超纯水复溶DNA；用NanoDrop 2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA一个吸收单位（OD）相当于50 μg/mL；

c、DNA的酶水解及纯化富集： 将上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl2缓冲液中，加入20 μL混合内标；添加30U脱氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和15U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h；水解液经Strata-X固相萃取，收集洗脱液液氮吹至干，复溶于100 μL 30%甲醇水溶液，即为样品待测液；

d、标准工作液的配制：用甲醇配制不同浓度的丙烯醛-DNA加合物标准工作溶液；

e、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量，在LC-MS/MS测定中，选取Thermo AcclaimTM Polar Advantage II C18 色谱柱，规格4.6×150 mm，3 μm，流动相体系选取A：0.01%甲酸甲醇，B：10 mM乙酸铵水溶液，梯度洗脱程序：0-2 min：25% A，2-17 min：

35% A，17-25 min：25% A；流速为0.38 mL/min；分析时间为25 min，进样量为5 μL；

串联质谱检测器具体条件如下：电喷雾离子源ESI，多反应监测正离子扫描方式；喷雾电压：5500 V，离子源温度：550℃，气帘气的量为20 psi，雾化气为70 psi，干燥气为75 psi，碰撞气为9 psi，射入电压：10 V, 碰撞能：9 eV，驻留时间：100 ms；Acr-dG的定量离子对为324.3/208.2，定性离子对为324.3/190.1，内标[15N5]Acr-dG的离子对329.2/213.2。

2.根据权利要求1所述的唾液中丙烯醛-DNA加合物的测定方法，其特征在于：步骤c中所述的混合内标为10 ng/mL的[15N5]α-Acr-dG和[15N5]γ-Acr-dG。

说明书

一种唾液中丙烯醛-DNA加合物的测定方法

技术领域

[0001] 本发明属于唾液样本的理化检验技术领域，主要涉及唾液DNA中α-Acr-dG和γ-Acr-dG加合物的测定技术领域，具体说是一种采用液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）测定唾液中主要丙烯醛-DNA加合物的方法。

背景技术

[0002] 丙烯醛是一种活泼的α，β-不饱和醛，广泛存在于环境基质中，主要产生于有机物的不完全燃烧，如工业废气、卷烟烟气、机动车尾气和烹饪油烟等。丙烯醛具有两个亲电基团，不需要经过机体的代谢就能与体内亲核物质进行反应，如DNA中的碱基，产生DNA加合2
物。研究最多的为丙烯醛与鸟嘌呤的加合（Acr-dG），即6-羟基-1,N-丙醇-2'-鸟嘌呤（α-Acr-dG）和8-羟基-1,N2-丙醇-2'-鸟嘌呤（γ-Acr-dG）。γ-Acr-dG是主要的结构形式，含量高于α-Acr-dG，两者都可引起基因突变，以G→T突变为主（α-Acr-dG突变概率高于γ-Acr-dG）。

[0003] 唾液是一种非侵入式的样本采集方式，对受试者不造成影响样本易获得，是现成可用的DNA来源。口腔是烟气等有害成分直接暴露的靶器官，相关研究表明唾液中DNA的损伤与口腔癌相关。唾液中较丰富的细胞类型为口腔上皮细胞与白细胞，因其生命周期较短，唾液中DNA加合物的含量更加能显示致癌物的近期暴露情况，唾液在检测卷烟和食品致癌物产生的DNA加合物方面具有很大的应用前景。

[0004] 目前，关于DNA加合物的分析检测方法报道的较多，主要有32P-后标记技术、酶联免疫技术（ELISA）、高效液相色谱法（HPLC-UV）和液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）。其中LC-MS/MS由于其较高的灵敏度和选择性被广泛应用于DNA加合物的检测分析。目前，在唾液中α-Acr-dG和γ-Acr-dG的同时分析方法尚未见报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的正是基于上述现有技术状况而采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术建立的唾液中丙烯醛-DNA加合物（α-Acr-dG和γ-Acr-dG）的测定方法。该方法具有准确、灵敏度高等特点，可用于唾液DNA中丙烯醛-DNA加合物的定性定量分析。

[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

[0007] 一种唾液中丙烯醛-DNA加合物的测定方法，即α-Acr-dG和γ-Acr-dG的测定方法，包括以下具体步骤：

[0008] a、唾液采集：用Oragene·DNA唾液采集器（OG-500）对人体唾液进行标准化采集。

[0009] b、唾液DNA的提取：Oragene唾液混合液于50℃水浴孵育至少1h后，加入Oragene 净化液，涡旋振荡，冰浴孵育10 min；于室温下离心；移取上层清液于一新的微量离心管中，加入纯乙醇，轻轻震荡数秒；静置使DNA分子完全沉淀，离心并去上清液；加入70%的乙醇水溶液清洗DNA团块。用超纯水复溶DNA。用NanoDrop 2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA一个吸收单位相当于50 μg/mL。

[0010] c、DNA的酶水解及纯化富集：将上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl2缓冲液（pH=7）中，加入20 μL混合内标，加入30U脱氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和15U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h。水解液经Strata-X固相萃取，收集洗脱液液氮吹至干，复溶于100 μL 30%甲醇水溶液，即为样品待测液。此过程的目的是为了使双链DNA酶解成单核苷酸状态，通过固相萃取和氮吹浓缩纯化分离并富集所需的DNA加合物。所述混合内标为10 ng/mL的 [15N5]α-Acr-dG和[15N5]γ-Acr-dG。

[0011] d、标准工作液的配制：用甲醇分别配制不同浓度的丙烯醛-DNA加合物标准工作溶液。

[0012] e、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。

[0013] 色谱条件：选取Thermo AcclaimTM Polar Advantage II C18 色谱柱（4.6×150 mm，3 μm），流动相体系选取A：0.01%甲酸甲醇和B：10 mM乙酸铵水溶液，洗脱条件为梯度洗脱： 0-2 min：25% A，2-17 min：35% A，17-25 min：25% A；流速为0.38 mL/min。分析时间为25 min，进样量为5 μL。

[0014] 质谱条件：电喷雾离子源（ESI），多反应监测正离子扫描方式；喷雾电压：5500 V，离子源温度：550℃，气帘气的量为20 psi，雾化气为70 psi，干燥气为75 psi，碰撞气为9 psi，射入电压：10 V, 碰撞能：9 eV，驻留时间：100 ms。Acr-dG的定量离子对为324.3/208.2，定性离子对为324.3/190.1，内标[15N5]Acr-dG的离子对329.2/213.2。

[0015] 本发明方法的线性范围和检出限：

[0016] 将系列标准工作溶液注入LC-MS/MS，得到标准工作曲线、线性回归方程以及相关系数。α-Acr-dG和γ-Acr-dG标准曲线的点为0.02，0.05，0.1，0.2，0.3，0.5，1.0和2.0 ng/mL，目标物的线性良好，相关系数均大于0.9990。利用加标稀释得到方法的定量限和检出限，目标峰十倍信噪比对应的浓度为定量限，三倍信噪比对应的浓度为检出限。分析物的标准曲线及定量限和检出限见表1。

[0017] 表1 目标物的标准工作曲线及LOD和LOQ

[0018]

[0019] 本发明方法加标回收率和重复性：

[0020] 采取唾液DNA样本中加标的方法获得方法的加标回收率，总共选取了三个添加水平，每个添加水平重复测定3次，得到的方法的回收率和重复性，结果见表2。目标物的回收率在95.3%-110.7%之间，RSD小于4%，证明方法的准确性和重复性结果较好。

[0021] 表2 分析物的加标回收率和重复性

[0022]

[0023] 本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对唾液中丙烯醛-DNA加合物的色谱条件进行了优化，并对LC -MS/MS的相关检测条件进行了优化。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：

[0024] ①与传统的液相色谱方法比较，由于选取了串联质谱，使得方法的选择性和灵敏度提高，更有利于唾液中低含量的丙烯醛-DNA加合物的测定。

[0025] ②本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。

[0026] ③本发明方法采用稳定同位素作为内标定量分析物可以减少样品前处理过程中引起的误差，串联质谱法更好的提高了方法的选择性与准确性和灵敏度。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间，减少了有机溶剂的消耗量。

[0027] ④本方法采用Oragene·DNA唾液采集器（OG-500）对人体唾液进行标准化采集，DNA的提取量较多。

附图说明

[0028] 图1 丙烯醛-DNA加合物的总离子流图。

[0029] 图2 实际唾液样本中丙烯醛-DNA加合物及其内标的色谱图。

具体实施方式

[0030] 本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。

[0031] 一种唾液中丙烯醛-DNA加合物的测定方法，其测试过程是用OG-500唾液采集管收集唾液，对唾液进行DNA的提取，DNA溶液进行酶水解并依次加入稳定同位素内标和DNA水解酶。水解液经Strata-X小柱固相萃取，收集洗脱液，室温下氮吹至干，复溶于100 μL的30%甲醇水溶液，引入LC-MS/MS系统分析。

[0032] 实例1：

[0033] 1.仪器与试剂：

[0034] AB SCIEX 三重四级杆串联质谱仪（美国加州应用生物系统公司），Agilent 1200高效液相色谱（美国安捷伦公司），NanoDrop 2000超微量分光光度计（美国赛默飞科技公司），恒温培养箱（美国赛默飞科技公司），氮气浓缩干燥仪（瑞典拜泰齐公司），Milli-Q水纯化系统（德国默克集团），Analyst 1.5.1数据采集与处理软件。

[0035] 脱氧核糖核酸酶Ⅰ、碱性磷酸酶（美国纽英伦生物技术公司），磷酸二酯酶Ⅰ、乙酸铵、甲酸、和小牛胸腺DNA（美国西格玛公司），甲醇（韩国德山试剂公司），Strata-X聚合物小柱（33 μm, 30 mg/1mL，广东菲罗门科学仪器有限公司），Oragene·DNA唾液采集器（OG-500，加拿大 DNA Genotek公司）。标准品α-Acr-dG、γ-Acr-dG和内标物 [15N5]α-Acr-dG 、[15N5]γ-Acr-dG。试剂均为色谱纯。

[0036] 2．样品处理：

[0037] 唾液采集：用Oragene·DNA唾液采集器（OG-500）对人体唾液进行标准化采集。

[0038] 唾液DNA的提取：Oragene唾液混合液于50℃水浴孵育至少1h后，加入Oragene 净化液，涡旋振荡，冰浴孵育10 min；于室温下离心；移取上层清液于一新的微量离心管中，加入纯乙醇，轻轻震荡数秒；静置使DNA分子完全沉淀，离心并去上清液；加入70%的乙醇水溶液清洗DNA团块。用超纯水复溶DNA。用NanoDrop 2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA一个吸收单位（OD）相当于50 μg/mL。

[0039] DNA的酶水解及纯化富集：将上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl2缓冲液（pH=7）中，加入20 μL混合内标；加入30U脱氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和15U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h。水解液经Strata-X固相萃取，收集洗脱液液氮吹至干，复溶于100 μL 30%甲醇水溶液，即为样品待测液。所述混合内标为10 ng/mL的 [15N5]α-Acr-dG和[15N5]γ-Acr-dG。

[0040] 3．测定方法：吸取不同浓度的标准溶液和前处理之后的唾液DNA样品各5 µL，注入LC-MS/MS系统进行分离分析，测得样本中丙烯醛-DNA加合物的含量。

[0041] 实例2：如实施例1所述，利用本研究建立的方法对5个唾液样本中丙烯醛-DNA加合物进行了检测（每个样本平行检测三次）。依据标准曲线和峰面积计算获得各个样品中DNA加合物的浓度，根据公式：

[0042]计算获得各个样品中DNA加合物相对于核苷酸的含量，结果乘以108换算成DNA加合物个数/
108个核苷酸。实验结果见表3。

[0043] 表3 唾液样本中丙烯醛-DNA加合物的含量

[0044]