一种丙烯醛‑DNA加合物的测定方法，即DNA中α‑Acr‑dG和γ‑Acr‑dG的测定方法，包括采用丙烯醛溶液暴露小牛胸腺DNA，DNA溶液进行酶水解并依次加入稳定同位素内标和DNA水解酶。水解液经Strata‑X小柱固相萃取，收集洗脱液，引入LC‑MS/MS系统分析，可准确检测出α‑Acr‑dG和γ‑Acr‑dG的含量水平。本发明为全新的DNA中丙烯醛‑DNA加合物的测定方法，采用稳定同位素作为内标定量分析物可以减少样品前处理过程中引起的误差，串联质谱法更好的提高了方法的选择性、与准确性和灵敏度。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间，减少了有机溶剂的消耗量。
1.一种丙烯醛-DNA加合物的测定方法，所述丙烯醛-DNA加合物是6-羟基-1,N2-丙醇-
2'-鸟嘌呤（α-Acr-dG）和8-羟基-1,N2-丙醇-2'-鸟嘌呤（γ-Acr-dG），其特征在于：包括以下具体步骤：
a、丙烯醛暴露小牛胸腺DNA：取400 μg小牛胸腺DNA，加入配制好的丙烯醛溶液，对照组加入同等体积的PBS溶液；将上述溶液放入37℃恒温培养箱中24 h；使用2倍体积的冰乙醇沉淀DNA并终止反应，离心去掉上清液，用70%的乙醇水溶液清洗DNA样品，得到的DNA团块晾干并加入200 μL超纯水复溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA一个吸收单位（OD）相当于50 μg/mL；
b、DNA的酶水解及固相萃取（SPE）：将上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl2缓冲液中，加入20 μL混合内标，加入60U脱氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和30U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h，水解液经1 mL甲醇活化和1 mL 纯水平衡的Strata-X固相萃取小柱，用1 mL超纯水和1 mL 10%的甲醇水淋洗，最后用1 mL 50%的甲醇水洗脱，收集洗脱液即为样品待测液；
c、标准工作液的配制：用甲醇配制不同浓度的α-Acr-dG和γ-Acr-dG标准工作溶液；
d、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量，在LC-MS/MS测定中，选取Extend-C18色谱柱，规格1.8 μm，4.6×100 mm，流动相体系选取0.01%甲酸甲醇A和10 mM乙酸铵水溶液B，梯度洗脱条件具体为：0-2 min：25% A，2-7 min：35% A，7-10 min：25% A；流速为0.38 mL/min，分析时间为10 min，进样量为5 μL；
串联质谱检测器具体条件为：电喷雾离子源（ESI），多反应监测正离子扫描方式；喷雾电压：5500 V，离子源温度：600℃，气帘气的量为20 psi，雾化气为36 psi，干燥气为46 psi，碰撞气为9 psi，射入电压：10 V，碰撞能：9 eV，驻留时间：100 ms；监测离子对为α-Acr-dG：324.3→208.2定量离子对，324.3→190.1定性离子对；内标[15N5]α-Acr-dG为329.2→213.2；γ-Acr-dG：324.3→208.1定量离子对，324.3→190.2定性离子对；内标[15N5]γ-Acr-dG为329.2→213.1。
2.根据权利要求1所述的丙烯醛-DNA加合物的测定方法，其特征在于：步骤a中的丙烯醛溶液用0.1 M的PBS溶液配制，浓度0.001-1 mM。
3.根据权利要求1所述的丙烯醛-DNA加合物的测定方法，其特征在于：步骤b中所述的混合内标为100 ng/mL的 [15N5]α-AcrdG 和[15N5]γ-AcrdG。
一种丙烯醛-DNA加合物的测定方法
技术领域
[0001] 本发明属于DNA样本的理化检验技术领域，主要涉及DNA中6-羟基-1,N2-丙醇-2'-鸟嘌呤（α-Acr-dG）和8-羟基-1,N2-丙醇-2'-鸟嘌呤（γ-Acr-dG）加合物的测定技术领域，具体说是一种采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱仪（LC- MS/MS）测定DNA中丙烯醛-DNA加合物的方法。
背景技术
[0002] 丙烯醛是一种广泛存在于环境基质中的污染物。它们主要产生于有机物的不完全燃烧，如工业生产、卷烟烟气、机动车尾气和烹饪油烟等。活泼的醛基不需要经过机体代谢就能够直接攻击生物体内亲核基团，如核酸中的鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶形成DNA加合物。丙烯醛形成的主要DNA加合物包括6-羟基-1,N2-丙醇-2'-鸟嘌呤（α-Acr-dG）和8-羟基-1,N2-丙醇-2'-鸟嘌呤（γ-Acr-dG）。这两种DNA加合物均可引起G→ T突变。
[0003] 目前，关于DNA加合物的分析检测方法报道的较多，主要有32P-后标记技术、酶联免疫技术（ELISA）、高效液相色谱法（HPLC-UV）和液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）。其中LC-MS/MS由于其较高的灵敏度和选择性被广泛应用于DNA加合物的检测分析。
发明内容
[0004] 本发明的目的正是基于上述现有技术状况而采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术建立的丙烯醛-DNA加合物（α-Acr-dG和γ-Acr-dG）的测定方法。该方法具有快速、准确、灵敏度高等特点，可用于DNA中丙烯醛-DNA加合物的定性定量分析。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0006] 一种丙烯醛-DNA加合物的测定方法，即DNA中α-Acr-dG和γ-Acr-dG的测定方法，具体步骤如下：
[0007] a、丙烯醛暴露小牛胸腺DNA：取400 μg小牛胸腺DNA，加入配制好的丙烯醛溶液（丙烯醛溶液用0.1 M的PBS溶液配制，浓度0.001-1 mM），对照组加入同等体积的PBS溶液。将上述溶液放入37℃恒温培养箱中24 h；使用2倍体积的冰乙醇沉淀DNA并终止反应，离心去掉上清液，用70%的乙醇水溶液清洗DNA样品，得到的DNA团块晾干并加入200 μL超纯水复溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA一个吸收单位相当于50 μg/mL。
[0008] b、DNA的酶水解及固相萃取（SPE）：将上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl2缓冲液（pH=7）中，加入20 μL混合内标，加入60U脱氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和30U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h。水解液经1 mL甲醇活化和1 mL 纯水平衡的Strata-X固相萃取小柱，用1 mL超纯水和1 mL 10%的甲醇水淋洗，最后用1 mL 50%的甲醇水洗脱，收集洗脱液即为样品待测液。此过程的目的是为了使双链DNA酶解成单核苷酸状态，通过固相萃取和氮吹浓缩纯化分离并富集所需的DNA加合物。所述混合内标为100 ng/mL的 [15N5]α-AcrdG 和[15N5]γ-AcrdG。
[0009] c、标准工作液的配制：用甲醇配制不同浓度的α-Acr-dG和γ-Acr-dG标准工作溶液。
[0010] d、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。
[0011] 色谱条件：选取Extend-C18（1.8 μm，4.6×100 mm）色谱柱，流动相体系选取A：0.01%甲酸甲醇和B：10 mM乙酸铵水溶液，洗脱条件为梯度洗脱：0-2 min：25% A，2-7 min：
35% A，7-10 min：25% A；流速为0.38 mL/min。分析时间为10 min，进样量为5 μL。
[0012] 质谱条件：电喷雾离子源（ESI），多反应监测正离子扫描方式；喷雾电压：5500 V，离子源温度：600℃，气帘气的量为20 psi，雾化气为36 psi，干燥气为46 psi，碰撞气为9 psi，射入电压：10 V，碰撞能：9 eV，驻留时间：100 ms。监测离子对为α-Acr-dG：324.3→15
208.2定量离子对，324.3→190.1定性离子对；内标[ N5]α-Acr-dG为329.2→213.2；γ-Acr-dG：324.3→208.1定量离子对，324.3→190.2定性离子对；内标[15N5]γ-Acr-dG为
329.2→213.1。
[0013] 各分析物及内标的MRM参数见表1。分析过程由Applied Biosystems Analyst version 1.5.1 软件来控制。
[0014] 表1 多反应监测模式下分析物及其内标的MRM参数
[0015]
[0016] *为定量离子
[0017] 本发明方法的线性范围和检出限：
[0018] 将系列标准工作溶液注入LC-MS/MS，得到标准工作曲线、线性回归方程以及相关系数。α-Acr-dG和γ-Acr-dG标准曲线的点为0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，5.0和10 ng/mL，内标[15N5]α-AcrdG 和[15N5]γ-AcrdG的浓度为2 ng/mL。目标物的线性良好，相关系数均大于0.9996。利用加标稀释得到方法的定量限和检出限，目标峰十倍信噪比对应的浓度为定量限，三倍信噪比对应的浓度为检出限。分析物的标准曲线及定量限和检出限见表2。
[0019] 表2 目标物的标准工作曲线及LOD和LOQ
[0020]
[0021] 本发明方法加标回收率和重复性：
[0022] 采取小牛胸腺DNA样本中加标的方法获得方法的加标回收率，总共选取了三个添加水平，每个添加水平重复测定3次，得到的方法的回收率和重复性，结果见表3。目标物的回收率在97.3%-105.0%之间，RSD小于5%，证明方法的准确性和重复性结果较好。
[0023] 表3 分析物的加标回收率和重复性
[0024]
[0025] 本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，DNA中丙烯醛-DNA加合物的色谱条件进行了优化，并对LC-MS/MS的相关检测条件进行了优化。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：
[0026] ①与传统的液相色谱方法比较，由于选取了串联质谱，使得方法的选择性和灵敏度提高，更有利于DNA中低含量丙烯醛-DNA加合物的测定。
[0027] ②本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度及重复性好的优点。
[0028] ③本发明方法采用稳定同位素作为内标定量分析物可以减少样品前处理过程中引起的误差，串联质谱法更好的提高了方法的选择性与准确性和灵敏度。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间，减少了有机溶剂的消耗量。
附图说明
[0029] 图 1 α-Acr-dG和γ-Acr-dG及其内标在100 μM丙烯醛溶液，37℃染毒24h的色谱图。
[0030] 图 2 不同丙烯醛暴露剂量下，小牛胸腺DNA中α-Acr-dG和γ-Acr-dG含量。
具体实施方式
[0031] 本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。
[0032] 一种DNA中丙烯醛-DNA加合物的测定方法，其测试过程是用丙烯醛溶液对小牛胸腺DNA进行暴露，对DNA溶液进行酶水解并加入稳定同位素内标和DNA水解酶。水解液经Strata-X小柱固相萃取，收集洗脱液，引入LC-MS/MS系统分析。
[0033] 实例1：
[0034] 1. 仪器与试剂：
[0035] AB SCIEX 三重四级杆串联质谱仪（美国加州应用生物系统公司），Agilent 1200高效液相色谱（美国安捷伦公司），NanoDrop 2000超微量分光光度计（美国赛默飞科技公司），恒温培养箱（美国赛默飞科技公司），Milli-Q水纯化系统（德国默克集团），Analyst 1.5.1数据采集与处理软件。
[0036] 脱氧核糖核酸酶Ⅰ、碱性磷酸酶（美国纽英伦生物技术公司），磷酸二酯酶Ⅰ、乙酸铵、甲酸、和小牛胸腺DNA（美国西格玛公司），甲醇（韩国德山试剂公司），Strata-X聚合物小柱（33 μm, 30 mg/1mL，广东菲罗门科学仪器有限公司）。标准品α-Acr-dG、γ-Acr-dG和内标物[15N5]α-Acr-dG 、[15N5]γ-Acr-dG。试剂均为色谱纯。
[0037] 2．样品处理：
[0038] 丙烯醛暴露小牛胸腺DNA：取400 μg小牛胸腺DNA，加入1 mL不同浓度的丙烯醛溶液（0.001，0.01，0.05，0.1，0.5和1.0 mM），对照组加入同等体积的PBS溶液。将上述溶液放入37℃恒温培养箱中24 h；使用2倍体积的冰乙醇沉淀DNA并终止反应，离心去掉上清液，用70%的乙醇水清洗DNA样品，得到的DNA团块晾干并加入200 μL超纯水复溶，用NanoDrop
2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA一个吸收单位相当于50 μg/mL。
[0039] DNA的酶水解及固相萃取（SPE）：将上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl2缓冲液（pH=7）中，加入20 μL混合内标，加入60U脱氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和30U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h。水解液经1 mL甲醇活化和1 mL 纯水平衡的Strata-X固相萃取小柱，用1 mL超纯水和1 mL 10%的甲醇水淋洗，最后用1 mL 50%的甲醇水洗脱，收集洗脱液即为样品待测液。所述混合内标为100 ng/mL的 [15N5]α-AcrdG和[15N5]γ-AcrdG。
[0040] 3．测定方法：
[0041] 吸取不同浓度的标准溶液和前处理之后的小牛胸腺DNA样品各5 µL，注入LC-MS/MS系统进行分离分析，测得样本中丙烯醛-DNA加合物的含量。
[0042] 实例2：如实施例1所述，利用本研究建立的方法对不同浓度丙烯醛（0.001，0.01，0.05，0.1，0.5和1.0 mM）暴露的小牛胸腺DNA中丙烯醛-DNA加合物进行了检测（每个样本平行检测三次）。依据标准曲线和峰面积得出各个样品中DNA加合物的浓度，根据公式[0043]
计算获得各个样品中DNA加合物相对于核苷酸的含量，结果乘以108换算成DNA加合物个数/
108个核苷酸。数据结果显示α-Acr-dG和γ-Acr-dG的量与丙烯醛暴露剂量成效应关系（SPSS，P＜0.005，图2）。
