通过在高温成熟孢子接种和铁离子介导的Harber-Weiss反应提高雨生红球藻中的虾青素生产的方法

摘要

本发明涉及通过两阶段光培养方法提高雨生红球藻中的虾青素生产的方法，并且更具体而言，涉及通过在高温在自养条件下接种成熟的孢囊并添加铁离子来提高雨生红球藻中的虾青素生产的方法。根据本发明，在户外培养中在自养条件下使用阳光生产虾青素中，包括接种成熟的孢囊然后是添加铁离子的两阶段光培养方法可将LROS(O2‑和H2O2)(其在高温条件下大量产生)有效转化成MROS(O2和OH·)，以放大胞内脂质氧化信号，由此解决大量LROS(O2‑和H2O2)的产生抑制虾青素合成的问题。因此，此方法可更有效地提高虾青素的生产，并且此虾青素是一种可用于多个产业领域的强抗氧化剂物质。

权利要求

1.一种用于通过雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的培养提高虾青素生产的方法，所述方法包括以下步骤：(a)接种雨生红球藻的成熟的孢囊，并且营养培养经接种的孢囊；并(b)通过在自养条件下以100-300μE/m2/s的光照射培养的孢囊来诱导所述雨生红球藻中的虾青素生产，其中所述自养条件是添加铁并且氮限制的条件,其中在28至33℃的温度进行所述培养，并且所述铁离子的浓度是40-80μM。

2.权利要求1的方法，其中所述自养条件包括供应3-4％二氧化碳作为用于光合作用的无机碳源。

3.权利要求1的方法，其中步骤(a)包括照射35μE/m2/s以下的光。

4.权利要求1的方法，其中所述铁离子是选自下组的至少一种：Fe2SO4、FeCl2、FeCl3和Fe2(SO4)3。

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5.权利要求1的方法，其中所述铁离子基于反应性氧种类O2和H2O2的含量，以100-600摩尔的量添加。

6.权利要求1的方法，其中通过将雨生红球藻细胞中的反应性氧种类O2-和H2O2转化成反应性氧种类O2和OH而提高虾青素的含量。

说明书

通过在高温成熟孢子接种和铁离子介导的Harber-Weiss反应

提高雨生红球藻中的虾青素生产的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及通过两阶段光培养方法提高雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)中的虾青素生产的方法，并且更具体而言，涉及通过在高温自养条件下接种成熟的孢囊(cyst)并添加铁离子来提高雨生红球藻中的虾青素生产的方法。

背景技术

[0002] 一般地，红色酮式类胡萝卜素(ketocarotenoid)虾青素(3,3'-二羟基-β,β'-胡萝卜素-4,4'-二酮)是一种具有与β-胡萝卜素的化学结构等同的化学结构的类胡萝卜素色素，并且是一种具有去除毒性反应性氧种类(reactive oxygen species)的能力的抗氧化剂物质。虾青素具有比现存的抗氧化剂物质的那些抗氧化活性显著更高的抗氧化活性，因为它与β-胡萝卜素相比具有独特的分子结构，该分子结构在两个末端具有一个额外的羟基基团(-OH)和酮基团(═O)。虾青素的抗氧化剂活性为代表性的抗氧化剂维生素E的抗氧化剂活性的约500倍并且为β-胡萝卜素的抗氧化剂活性的约20倍。由于此类高抗氧化剂活性，虾青素被广泛用作药物、食物添加剂、和用于动物和鱼苗的饲料添加剂。此外，预期对于虾青素的需要及其应用范围会快速增加。

[0003] 此类虾青素在酵母菌株红法夫酵母(Phaffia rthodozyma)和短杆菌属(Bervibacterium)中生产，并且在海洋动物和淡水动物中也丰富分布。然而，未应用从贝类，如对虾或螯虾(crawfishes)提取虾青素，因为虾青素的含量较低，并且提取过程是复杂的。此外，红法夫酵母显示高生长速率，但是具有虾青素的产率低的问题。

[0004] 因而，已经进行了多种研究以在使用微藻雨生红球藻通过光照固定二氧化碳时提高虾青素的生产，所述微藻雨生红球藻就虾青素的积累含量和产率而言是地球上最好的。

[0005] 在现有技术中，KR2005-0005341A公开了通过培养能够生产虾青素的菌株生产高含量的虾青素的方法。如其中所述，进行了研究以通过增加光照来提高虾青素的生产。然而，在此情况中，存在的缺点在于需要具有特殊构造的反应器，并且需要高能量成本以照射大量光。另外，KR2010-0105193A公开了一种通过照射生产虾青素的方法，但是存在有照射成本显著的问题。

[0006] 同时，强光对于刺激雨生红球藻中的虾青素合成是最重要的因素，其是在自养条件下诱导虾青素生产所需的，所述自养条件仅使用二氧化碳作为细胞生长和虾青素合成所需的碳源。如果将太阳用作光源，那么可以更划算的方式进行将作为温室气体的主要原因的二氧化碳转化为虾青素的方法，并且通过强光刺激虾青素合成，而引起的多种问题在于外部细菌的污染由于吸收阳光的微藻光反应器中的培养基的温度升高而被加速。

[0007] 因此，为了在阳光下户外将二氧化碳转化为虾青素的方法中在产业上使用雨生红球藻(其具有积累虾青素的卓越能力)，尤其迫切需要解决与虾青素在自养条件下在高温的缓慢产生相关的问题。

[0008] 因而，本发明人已经做出大量努力以寻找通过在阳光下户外培养雨生红球藻来提高虾青素的生产产率的方法，并且因此已发现通过两阶段光培养方法(其中在自养条件下在高温接种成熟的孢囊，接着添加铁离子)显著提高雨生红球藻细胞中的虾青素生产，由此完成本发明。

发明内容

[0009] 本发明的一个目的是提供用于通过雨生红球藻的培养提高虾青素生产的方法，所述方法包括以下步骤：(a)接种雨生红球藻的成熟的孢囊，并且营养培养经接种的孢囊；和2
(b)通过在自养条件下以100-300μE/m/s的光照射培养的孢囊来诱导所述雨生红球藻中的虾青素生产，其中所述自养条件是添加铁并且氮限制的条件。

[0010] 为了实现上述目的，本发明提供了用于通过雨生红球藻的培养提高虾青素生产的方法，所述方法包括以下步骤：(a)接种雨生红球藻的成熟的孢囊，并且营养培养经接种的2
孢囊；并(b)通过在自养条件下以100-300μE/m/s的光照射培养的孢囊来诱导所述雨生红球藻中的虾青素生产，其中所述自养条件是添加铁并且氮限制的条件。

[0011] 附图简述

[0012] 图1是示意图，其显示了通过在自养条件下在高温(30℃和36℃)的铁离子介导的Haber-Weiss反应来提高雨生红球藻的虾青素生产率的诱导方法。

[0013] 图2显示了测量在自养条件下在虾青素合成期间不同温度(23℃、30℃、和36℃)和铁离子添加对雨生红球藻的生物量和虾青素生产率的影响的结果。

[0014] 图3描绘了光学显微图像，其显示了不同温度(23℃、30℃、和36℃)和铁离子添加对自养条件下虾青素合成18天的雨生红球藻中的虾青素积累程度的影响。(比例尺＝40μm)。

[0015] 图4显示了测量不同温度(23℃、30℃、和36℃)和铁离子添加对自养条件下虾青素的18天期间雨生红球藻的DCF含量、SOD活性和MDA含量的影响的结果。

[0016] 图5显示了在自养条件下在23℃的温度在虾青素合成刺激期间，由人工释放O2-的甲基紫精的浓度和铁离子(Fe2+)的增加引起的雨生红球藻的虾青素积累能力降低，以及通过金属离子介导的Fenton反应的虾青素积累能力的维持和增加程度。

[0017] 图6显示了在23℃在绿色阶段中培养细胞，并且在自养条件下在高温(23.4至33.5℃)将铁离子添加到培养物细胞后测量雨生红球藻中的虾青素生产的结果。

[0018] 图7显示了在高温(23℃、30℃、和33℃)接种成熟的孢囊(红色孢囊)后测量绿色阶段中的雨生红球藻的营养生长的结果。

[0019] 图8显示了在夏天高温自养条件下在绿色阶段中培养15天，接着在存在铁离子的情况下在红色阶段中培养63天后，检查雨生红球藻中的虾青素生产生产的增加的结果。

[0020] 图9显示了通过户外在中等温度和高温条件(23至28℃和28至33℃)下的两阶段(绿色和红色阶段)光培养诱导雨生红球藻的虾青素生产率的增加的方法和诱导方法的结果。

[0021] 实施本发明的最佳方式

[0022] 除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。一般地，本文中使用的命名和实验方法(其将在下文描述)是那些在本领域中已知并且通常采用的。

[0023] 在本发明中，为了通过在自养条件下在高温提高雨生红球藻的虾青素生产率来产生大量的虾青素，通过接种成熟的孢囊并在包含铁离子的自养条件下以100-300μE/m2/s的光照射雨生红球藻细胞来诱导雨生红球藻细胞中虾青素的生产。

[0024] 本发明中使用的微藻雨生红球藻具有自然界中现存的生物体中最高的虾青素积累，但是具有的缺点在于虾青素的生产率在使用二氧化碳作为单一碳源的自养条件下较低。

[0025] 特别地，如韩国等国家的夏天太阳牵涉高温(30至40℃)连同强光。当在此类高温在自养条件下在雨生红球藻细胞中合成虾青素时，发生虾青素的生物合成显著下降的现象。由于虾青素的浓度和生产率的连续下降，细胞不能抵抗极端的环境应激，导致细胞死亡。此问题通过在高温(30至40℃)活跃生长的细菌的污染而变得更加严重。

[0026] 因此，在一个方面中，本发明涉及用于通过雨生红球藻的培养提高虾青素生产的方法，所述方法包括以下步骤：(a)接种雨生红球藻的成熟的孢囊，并且营养培养经接种的孢囊；和(b)通过在自养条件下以100-300μE/m2/s的光照射培养的孢囊来诱导所述雨生红球藻中的虾青素生产，其中所述自养条件是添加铁并且氮限制的条件。

[0027] 在本发明中，在25至40℃的温度进行培养，但不限于此。

[0028] 一般地，春天的中等温度是17.5至27.7℃，而夏天高温是23.4至33.5℃。因此，优选的是，本发明中的中等温度是23至28℃，并且高温是28至33℃，但是本发明的范围不限于此。

[0029] 在本发明中，自养条件优选包括供应3-4％二氧化碳作为用于光合作用的无机碳源，但不限于此。

[0030] 本发明中的步骤(a)优选包括照射35μE/m2/s以下的光，但不限于此。

[0031] 在本发明中，步骤(a)意指“绿色阶段”，并且术语“绿色阶段”意指低应激培养条件，其中在包含氮的自养条件下供应3-4％二氧化碳时照射35μE/m2/s以下的光。

[0032] 本发明中的步骤(b)意指“红色阶段”，并且术语“红色阶段”意指高应激培养条件，其中在限制氮的自养条件下供应3-4％二氧化碳时照射100-350μE/m2/s的光。

[0033] 在本发明中，铁离子优选是选自下组的至少一种：Fe2SO4、FeCl2、FeCl3和Fe2(SO4)3，但不限于此。另外，铁离子的浓度是40-80μM，但不限于此。

[0034] 在本发明中，优选地，铁离子基于反应性氧种类O2-和H2O2的含量以100-600摩尔的量添加，但不限于此。

[0035] 在本发明中，通过将雨生红球藻细胞中的反应性氧种类O2-和H2O2转化成反应性氧种类O2和OH来提高虾青素的含量。

[0036] 一般地，当将微藻暴露于高温环境时，发生从用于光合作用的叶绿体泄漏类囊体，并且在严重情况中，发生叶绿体的崩解。然后，类囊体的氧气摄取率增加，并且不经由开尔文循环(Calvin cycle)减少的电子通过梅勒(Mehler)反应(O2摄取+电子→O2-)与氧结合以在类囊体中产生大量的O2-。然后，细胞表达超氧化物歧化酶(SOD)以保护细胞组分免于大量的产生的O2-，并且产生的O2-在叶绿体的崩解中被SOD(超氧化物歧化酶)转化成H2O2。结果，高温环境在微藻细胞中产生大量的H2O2。

[0037] 由于H2O2容易通过扩散穿过细胞膜，与O2-不同，从叶绿体释放的H2O2将细胞氧化相关的信号传递给其它细胞器官，包括核酸、线粒体和液泡，并在此时，胡萝卜素形成相关的基因之间的H2O2敏感性酶可被直接失活。结果，雨生红球藻中虾青素的合成可受到抑制。

[0038] 同时，报告了植物中的类胡萝卜素仅在质体中合成。然而，雨生红球藻通过应激反应在质体外部的脂质囊泡(小球)中积累类胡萝卜素包括虾青素。如上文提及，由于H2O2容易通过扩散穿过细胞膜，与O2-不同，铁离子介导的Fenton反应(Fe2++H2O2→Fe3++OH·)甚至在质体外部充分发生。因此，雨生红球藻细胞很可能刺激虾青素合成以保护它们免于严重脂质氧化，这是由于经由铁离子介导的Haber-Weiss反应产生的大量OH·。

[0039] 另外，报告了与O2-和H2O2相比，O2和OH·是高度反应性的。OH·具有非常短的0.3msec的寿命(1.7-20μm的扩散长度)，而H2O2是一种强的两电子氧化剂(E＝1.77V,pKa 
11.6)，但与生物分子具有低反应性，并因此通过经由过渡金属如Fe2+或酶诱导H2O2转化为O2和OH·而发生H2O2对细胞的损伤。O2-也具有中高的还原电位(E＝0.94V)，但仍然具有与生物学分子的低反应性。

[0040] 因此，通过诱导铁离子介导的Haber-Weiss反应从在高温培养条件(30至40℃)中在细胞中产生的大量LROS(O2-和H2O2)相当多地转化的MROS(O2和OH·)很可能氧化多种细胞组分，包括PUFA(不饱和脂肪酸)，导致MDA含量的增加。此外，在室温(23℃)，没有用FeSO4处理的细胞中的MDA和类胡萝卜素的含量高于用FeSO4处理的细胞中的那些含量，这指示可通-过控制Haber-Weiss反应中的铁离子浓度和LROS(O2 和H2O2)加速脂质氧化，并且铁离子和LROS(O2-和H2O2)之间的含量比率的控制必须是对于在自养条件下雨生红球藻细胞中的虾青素产生而言非常重要的因素。因此，可精密控制细胞中的O2-和H2O2的含量。

[0041] 在本发明的一个例子中，优选铁离子基于反应性氧种类O2-和H2O2的含量以100-600摩尔的量添加。若铁离子基于反应性氧种类O2-和H2O2以小于100摩尔的量添加，则会有积累虾青素的效率降低的问题，并且若铁离子基于反应性氧种类O2-和H2O2以超过600摩尔的量添加，则会有发生副反应而抑制虾青素合成的问题。

[0042] 在本发明中，可通过将雨生红球藻细胞中的反应性氧种类O2-和H2O2转化为反应性氧种类O2和OH来提高虾青素的含量。

[0043] 在本发明的另一个实例中，为了更有效提高虾青素的生产，在高温培养条件下在绿色阶段中接种成熟的孢囊(红色孢囊)，并且检查雨生红球藻细胞中的虾青素生产。结果，可见在高温培养条件(28至30℃)下在绿色阶段中接种成熟的孢囊(红色孢囊)并且在红色阶段中添加铁离子可以显著提高雨生红球藻细胞中的虾青素的生产和产率。

[0044] 如本文中使用，术语“自养条件”意指使植物能够采取无机物质作为营养物并且使用无机物质合成有机物质的培养基条件，并且也表示为“自养培养条件”。一般地，在自养条件下供应二氧化碳作为用于光合作用的无机碳源，并且培养基组成可含有Ca(NO3)2或CaCl2·2H2O、KNO3或KCl、甘油磷酸二钠·5H2O、MgSO4·7H2O、三氨基甲烷、硫胺素、生物素、维生素B12、PIV金属溶液、Na2EDTA、FeCl3·6H2O、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O和Na2MoO4·2H2O，但不限于此。实施例

[0045] 在下文中，本发明会参考实施例更为详细描述。对于本领域普通技术人员会显而易见的是，这些实施例仅是例示目的，并且不应解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围会通过所附权利要求及其等同方案限定。

[0046] 材料

[0047] 本发明中使用的菌株是购自国立环境研究所(National Institute for Environmental Studies)(筑波，日本)的雨生红球藻NIES-144。

[0048] 本发明的实施例中使用的培养基是两种培养基(NIES-C培养基和NIES-N培养基)，并且下文表1中显示了这些培养基的组成。

[0049] 在下文表1中，

[0050] -NIES-C培养基：自养培养基(目的：生长)

[0051] -NIES-N培养基：自养培养基(目的：生长抑制、光诱导、和虾青素生产)[0052] -CO2供应：3％(v/v)

[0053] -光条件：20μE/m2/s(对于营养生长)；150μE/m2/s(对于诱导生长)[0054] -FeSO4:450μM

[0055] -MV(甲基紫精)：10-11M、10-9M和10-7M(人工O2-发生剂)

[0056] -H2DCFDA(羧基-2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(carboxy-2',7'-dichlorofluorescein diacetate))5μM

[0057] -DCF：通过由反应性氧种类(O2-和H2O2)氧化H2DCFDA产生的物质

[0058] -SOD(超氧化物歧化酶)：SOD是一种在细胞中将O2-转化成H2O2的酶。

[0059] -MDA(丙二醛)：MDA是一种通过由氧气(O2)和反应性氧种类(O2-、H2O2和OH·)氧化胞内PUFA(多不饱和脂肪酸)产生的次生代谢物，并且细胞中的MDA量是一种间接指示细胞的氧化程度的氧化标志物。

[0060] 表1

[0061]

[0062] 实施例1：自养条件下多种高温培养条件和铁离子介导的Haber-Weiss反应对雨生红球藻中的虾青素和生物量的积累的影响

[0063] 为了检查自养条件下多种高温培养条件和铁离子介导的Haber-Weiss反应对雨生红球藻中的虾青素和生物量的积累的影响，进行以下实验。

[0064] 在缺乏有机碳源的NIES-C培养基中，使用低强度光(20μE/m2/s)和仅二氧化碳作为单一碳源培养细胞。当达到指数期时，将培养基中的细胞(OD680＝约0.8)转移到NIES-N培养基以抑制细胞的生长，并且在以下条件之每种下对生物量的量和虾青素的积累程度分析2
18天：一般室温培养条件(23℃)连同强光(150μE/m /s)；高培养温度(30℃和36℃)；和在每个温度添加和不添加诱导铁离子介导的Haber-Weiss反应的FeSO4(450μM)的条件。

[0065] 1-1：生物量

[0066] 如图2(A)中显示，与23℃的雨生红球藻的生物量生产率相比，根据自养条件下的温度增加的雨生红球藻的生物量生产率在30℃降低30％，并且在36℃降低57％，而当培养温度是30℃并且添加Fe2+以诱导Haber Weiss反应时，与不添加Fe2+并且培养温度是23℃时相比雨生红球藻的生物量生产率增加9％，并且与不添加Fe2+并且培养温度是30℃时相比雨生红球藻的生物量生产率增加41％。

[0067] 另外，当培养温度是36℃，并且添加Fe2+以诱导Haber-Weiss反应时，与不添加Fe2+并且培养温度是23℃时相比雨生红球藻的生物量生产率增加3％，并且与不添加Fe2+且培养温度是30℃时相比雨生红球藻的生物量生产率增加77％。

[0068] 1-2：虾青素的积累

[0069] 如图2(B)中显示，与23℃培养温度的雨生红球藻的虾青素生产率相比，根据自养条件下的温度增加的雨生红球藻的虾青素生产率在30℃降低23％，并且在36℃降低42％。而当培养温度是30℃并且添加Fe2+以诱导Haber Weiss反应时，与不添加Fe2+并且培养温度是23℃时相比雨生红球藻的虾青素生产率增加17％，并且与不添加Fe2+并且培养温度是30℃时相比增加66％。

[0070] 另外，当培养温度是36℃，并且添加Fe2+以诱导Haber-Weiss反应时，与不添加Fe2+并且培养温度是23℃时相比雨生红球藻的虾青素生产率降低7％，并且与不添加Fe2+并且培养温度是30℃时相比增加152％。

[0071] 此外，进行虾青素合成，并且通过光学显微图像分析雨生红球藻细胞中的虾青素的积累程度。因此，如图3中显示，发现了高温条件不适合于自养条件下雨生红球藻中的虾青素生产，并且在高温引入Haber-Weiss反应有效维持雨生红球藻的虾青素生产率。

[0072] 实施例2：自养条件下的多种高温培养条件和铁离子介导的Haber-Weiss反应对雨生红球藻中的虾青素合成的初始阶段中的胞内反应性氧种类含量、SOD活性、脂质氧化和类胡萝卜素含量的影响

[0073] 为了检查在自养条件下在高温对雨生红球藻中的虾青素生物合成的抑制，进行以下实验。

[0074] 首先，在缺乏有机碳源的NIES-C培养基中，使用低强度光(20μE/m2/s)和仅二氧化碳作为单一碳源培养细胞。当达到指数期时，将培养基中的细胞(OD680＝约0.8)转移到NIES-N培养基以抑制细胞的生长，并且在以下虾青素合成条件之每种中在培养的2天期间分析胞内反应性氧种类含量(DCF含量)、SOD活性、脂质氧化程度(MDA含量)和类胡萝卜素积累：一般室温培养条件(23℃)连同强光(150μE/m2/s)；高培养温度(30℃和36℃)；和在每个温度添加和不添加诱导铁离子介导的Haber-Weiss反应的FeSO4(450μM)的条件。

[0075] 结果，如图4(A)中显示，DCF含量(反应性氧种类含量-O2-和H2O2)在高温条件(30℃和36℃)下快速增加，但是在高温条件下添加FeSO4(450μM)以诱导Haber-Weiss反应时快速下降。

[0076] 另外，如图4(B)中显示，虾青素合成过程期间的SOD(超氧化物歧化酶)一般显示增加的趋势。然而，SOD活性在高温条件(30℃和36℃)下快速增加，但是在高温培养条件下添加FeSO4(450μM)以诱导Haber-Weiss反应时显著下降。这看起来是由于细胞中产生的大量O2-经由铁离子介导的Haber-Weiss反应被有效转化成O2。

[0077] 此外，如图4(C)中显示，MDA(丙二醛)含量在高温条件(30℃和36℃)下与DCF含量(O2-，H2O2)成正比增加。然而，MDA含量当在高温条件(30℃和36℃)下添加FeSO4(450μM)以诱-导Haber-Weiss反应时进一步增加。这看起来是由于在高温产生的反应性氧种类(O2 和H2O2)通过铁离子介导的Haber-Weiss反应被快速转化成O2和OH·，并且与胞内PUFA(不饱和脂肪酸)快速起反应以加速MDA的形成。

[0078] 实施例3：在室温(23℃)在自养条件下O2-的人工产生和铁离子介导的Haber-Weiss反应对雨生红球藻中的虾青素合成的初始阶段中的胞内虾青素积累的影响

[0079] 为了检查由在室温(23℃)在自养条件下虾青素合成期间雨生红球藻细胞中的LROS(O2-和H2O2)增加引起的对虾青素合成的抑制，进行以下实验。在缺乏有机碳源的NIES-C培养基中，使用低强度光(20μE/m2/s)和仅二氧化碳作为单一碳源培养细胞。当达到指数期时，将培养基中的细胞(OD680＝约0.8)转移到NIES-N培养基以抑制细胞生长，并将多种浓度(10-11至10-7M)甲基紫精连同强光(150μE/m2/s)添加至细胞以人工产生O2-。另外，在以下虾青素合成条件之每种下在培养4天时分析细胞中的虾青素的积累程度：在一般室温培养温度(23℃)添加和不添加诱导铁离子介导的Haber-Weiss反应的FeSO4(450μM)的条件。

[0080] 结果，如图5中显示，雨生红球藻甚至对非常少量的甲基紫精敏感，从而其虾青素积累能力在产生大量O2-的条件下会降低，而通过添加铁离子将LROS(O2-，H2O2)快速转化为MROS(O2，OH·)提高了雨生红球藻的虾青素积累能力。这表明虾青素合成期间需要胞内O2-和H2O2含量的精密控制(minute control)以在室温(23℃)在自养条件下在雨生红球藻细胞中有效产生虾青素。

[0081] 实施例4：通过在高温在自养条件下接种成熟的孢囊并添加铁离子的虾青素生产的增加

[0082] 4-1：绿色阶段中接种成熟的孢囊

[0083] 在此实施例中，发现了通过两阶段光培养方法提高雨生红球藻中的虾青素生产。

[0084] 检查春天(中等温度条件：17.5至27.3℃)和夏天(高温条件：23.4至33.5℃)的平均光强度和温度的变化，并且检查户外使用雨生红球藻更划算地除去生物学二氧化碳的方法条件，而将春天和夏天的光强度维持在相同水平，并且没有特定地控制温度。

[0085] 对在绿色阶段(低应激培养条件，其中在包含氮的自养条件下供应3-4％二氧化碳2
时照射35μE/m/s以下的光)中在23℃培养的绿色营养细胞，在作为夏天户外高温条件的红色阶段(高应激培养条件，其中在缺乏氮的自养条件下供应3-4％二氧化碳时照射100-350μE/m2/s的光)中添加铁离子，并且对细胞中的虾青素生产检查36天。

[0086] 结果，显示了雨生红球藻细胞中的虾青素生物合成在50μM的铁离子浓度有效进行(图6)，而不含铁离子的光生物反应器中的雨生红球藻细胞中的虾青素生物合成被抑制。

[0087] 为了更有效提高虾青素的生产，在室内实验室规模检查是否可以在高温培养条件下在绿色状态中通过接种成熟的孢囊(红色孢囊)来营养培养雨生红球藻细胞达21天。结果，显示了当在高温培养条件下接种成熟的孢囊(红色孢囊)时，绿色阶段成功进行，即使迟滞期比23℃的培养温度条件下的迟滞期长约2天(图7)。

[0088] 4-2：在绿色阶段中接种成熟的孢囊和在红色阶段中添加铁离子

[0089] 基于实施例4-1的结果，在夏天高温在自养条件下在绿色阶段中接种成熟的孢囊(红色孢囊)并且在红色阶段中添加铁离子后检查雨生红球藻细胞中的虾青素生产。绿色阶段培养进行15天，且红色阶段培养进行63天。

[0090] 结果，显示了当进行成熟的孢囊(红色孢囊)的接种和50μM铁离子的添加时，雨生红球藻细胞中的虾青素生产(mg/L/天)在春天的中等温度条件下为2.24mg/L/天，并且在高温条件下为3.29mg/L/天，其增加了147％(图8)。

[0091] 图9显示了通过在户外中等温度和高温条件(23至28℃和28至33℃)下的两阶段(绿色和红色阶段)光培养诱导雨生红球藻的虾青素生产率的增加的方法和诱导方法的结果。如其中显示，与在中等温度绿色阶段和缺乏铁离子的红色阶段培养条件(2.24mg/L/天达57天)相比，在高温自养绿色阶段中接种成熟的孢囊(红色孢囊)并且在红色阶段中添加铁离子显示虾青素的生产和产率的显著增加(5.53mg/L/天达27天)。

[0092] 工业实用性

[0093] 如上文所述，根据本发明，在户外培养中在自养条件下使用阳光的虾青素生产中，包括接种成熟的孢囊然后添加铁离子的两阶段光培养方法可将在高温条件下大量产生的LROS(O2-和H2O2)有效转化成MROS(O2和OH·)以放大胞内脂质氧化信号，由此解决大量LROS(O2-和H2O2)的产生抑制虾青素合成的问题。因此，此方法可更有效提高虾青素的生产，并且此虾青素是一种可用于多个工业领域的强抗氧化剂物质。

[0094] 虽然本发明已经参考具体特征详细描述，但是对于本领域技术人员会显而易见的是，本描述仅用于优选的实施方案，而不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围会通过所附权利要求及其等同方案限定。