氨磺乐灵浸渍刺葡萄种子的倍性诱变方法

摘要

本发明公开了一种氨磺乐灵浸渍刺葡萄种子的倍性诱变方法，包括以下步骤：（1）将氨磺乐灵溶于二甲基甲酰胺中，再用水稀释至氨磺乐灵的质量浓度为0.0025%‑0.0035%，得氨磺乐灵溶液；（2）将处于露白阶段的刺葡萄种子浸渍于氨磺乐灵溶液中12‑36小时，即完成刺葡萄种子的倍性诱变。本发明通过浸渍法成功诱导刺葡萄种子获得刺葡萄四倍体，浸渍溶液为氨磺乐灵，最合适的浓度为0.003%左右，诱变率高达60%以上。

权利要求

1.一种氨磺乐灵浸渍刺葡萄种子的倍性诱变方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将氨磺乐灵溶于二甲基甲酰胺中，再用水稀释至氨磺乐灵的质量浓度为0.0025%-

0.0035%，得氨磺乐灵溶液；

（2）将处于露白阶段的刺葡萄种子浸渍于氨磺乐灵溶液中12-36小时，即完成刺葡萄种子的倍性诱变。

2.如权利要求1所述的倍性诱变方法，其特征在于，所述氨磺乐灵溶液中二甲基甲酰胺的质量浓度为0.04%-0.08%。

3.如权利要求1所述的倍性诱变方法，其特征在于，所述刺葡萄种子浸渍于氨磺乐灵溶液中的温度为24-28℃。

4.如权利要求1所述的倍性诱变方法，其特征在于，所述刺葡萄种子的浸渍时间为20-

28小时。

5.如权利要求1所述的倍性诱变方法，其特征在于，所述氨磺乐灵溶液中氨磺乐灵的质量浓度为0.003%。

6.如权利要求1所述的倍性诱变方法，其特征在于，在刺葡萄种子浸渍于氨磺乐灵溶液的过程中，晃动或搅动氨磺乐灵溶液。

说明书

氨磺乐灵浸渍刺葡萄种子的倍性诱变方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种氨磺乐灵浸渍刺葡萄种子的倍性诱变方法。

背景技术

[0002] 刺葡萄(V.davidii.Foex)属东亚种群，2n＝38，是我国南方主要野生葡萄之一，主要分布在长江以南亚热带温湿雨林丛山中，能较好适应高温多湿气候条件，对葡萄常患病害白腐病、炭疽病、黑痘病等具有很好抗性，适应性强，这一独特表现为南方葡萄无公害化种植描绘了广阔前景，也为葡萄耐湿性砧木及新品种选育等方面提供了优秀资源与材料。刺葡萄的新蔓、嫩叶与果实色彩非常丰富，观赏效果与价值比普通葡萄更高，是公园、庭院等处优良垂直观赏绿化植物。大多数刺葡萄果粒的皮色为兰黑色或兰紫色，药用效果与价值比一般葡萄更显著，更有利于人们身体健康。与栽培于长江以南的其它葡萄相比，刺葡萄更适于葡萄的加工与酿酒，其附加产品更丰富，附加值更高。因刺葡萄具有上述几方面独特表现，长江以南许多地方的农民已把野生刺葡萄家植化并获得了极大成功。

[0003] 刺葡萄果粒较小，果内含种子较多。已有利用秋水仙素处理刺葡萄已萌动种子和生长芽，诱其染色体加倍而成功获得刺葡萄多倍体的研究报道。但秋水仙素是一剧毒植物碱，操作过程中稍有不慎，即对处理对象和操作者带来极大危害。氨磺乐灵(oryzalin；CAS为19044-88-3，分子式：C12H18N4O6S，分子量：346.36)，又叫黄草消(除草剂)、安磺灵、氨磺灵、消草磺灵等，当前生产上主要用于杂草的芽前除草。它和秋水仙素一样，是一种抗微管物质，当它们与正在分裂的植物细胞接触后，能有效抑制微管的聚合过程，阻碍纺锤丝形成，从而诱使植物细胞核内染色体成功加倍。近年来，国外已有将氨磺乐灵作用于苹果、梨、猕猴桃等植物染色体，并成功使这些植物染色体加倍的报道，认为氨磺乐灵是除秋水仙素外又一适合植物染色体加倍的化学试剂，与秋水仙素相比，氨磺乐灵具有低毒性、低浓度、低成本、高效率诱导染色体加倍等特点，是一种新型的植物倍性诱变剂。

[0004] 邵果园等人在《中国南方果树》2013，42(6)：24-27上公开了“氨磺乐灵在园艺植物倍性育种上的应用”，该文章主要介绍了氨磺乐灵作用于苹果、猕猴桃、梨、百合等植物染色体并诱使其加倍。而葡萄属植物，特别是刺葡萄，与上述植物在植物学分类、生长特征与生长习性等方面存在很大差别。

[0005] 现在国内还没有将氨磺乐灵运用于刺葡萄并诱导刺葡萄染色体加倍的成功报道，本研究的意义是首次利用氨磺乐灵(Oryzalin)作用于已萌动的刺葡萄种子并对其进行倍性诱导，为得到粒大优质，少籽或无籽的刺葡萄多倍体新品种提供优良的种质资源与新品系。

发明内容

[0006] 本发明解决的技术问题是，将氨磺乐灵应用于刺葡萄种子的倍性诱变，并探索合适的倍性诱变条件。

[0007] 本发明的技术方案是，提供一种氨磺乐灵浸渍刺葡萄种子的倍性诱变方法，包括以下步骤：

[0008] (1)将氨磺乐灵溶于二甲基甲酰胺中，再用水稀释至氨磺乐灵的质量浓度为0.0025％-0.0035％，得氨磺乐灵溶液；

[0009] (2)将处于露白阶段的刺葡萄种子浸渍于氨磺乐灵溶液中12-36小时，即完成刺葡萄种子的倍性诱变。

[0010] 进一步地，所述氨磺乐灵溶液中二甲基甲酰胺的质量浓度为0.04％-0.08％。

[0011] 进一步地，所述刺葡萄种子浸渍于氨磺乐灵溶液中的温度为24-28℃。

[0012] 进一步地，所述刺葡萄种子的浸渍时间为20-28小时。

[0013] 进一步地，所述氨磺乐灵溶液中氨磺乐灵的质量浓度为0.003％。

[0014] 进一步地，在刺葡萄种子浸渍于氨磺乐灵溶液的过程中，晃动或搅动氨磺乐灵溶液。

[0015] 根据现有技术的内容，发明人尝试将0.1％的氨磺乐灵溶液直接用于刺葡萄种子的倍性诱变，发现诱变效果很差，诱变率很低，不到10％。

[0016] 本发明利用浸渍法，使用氨磺乐灵溶液处理刺葡萄种子，成功地对刺葡萄种子实现倍性诱变。本发明的主要创新在于：1、氨磺乐灵溶液浓度对刺葡萄种子诱变率的影响很大，本发明通过实验探索出诱导刺葡萄种子发生倍性变异的合适氨磺乐灵溶液浓度为0.0025％-0.0035％(本发明中的浓度均指质量浓度)，最佳浸渍浓度为0.003％；该用量与秋水仙素的用量相比，浓度低了一百多倍。2、已萌动并处于露白阶段的刺葡萄种子的细胞分裂旺盛，本发明在此阶段进行浸渍，并通过合理地控制浸渍的时间，染色体加倍的概率提高，使得刺葡萄种子成功获得倍性变异。3、将二甲基甲酰胺(DMF)代替二甲基亚砜(DMSO)做氨磺乐灵淡黄色晶状粉末的溶剂，可以增强氨磺乐灵溶液对刺葡萄种子的渗透作用，可以在低氨磺乐灵溶液浓度条件下实现较好的渗透，提高刺葡萄种子细胞内染色体诱变效果，避免了刺葡萄种子受更高药剂浓度的浸渍作用，降低了种子的死亡率(萌动种子在0.003％氨磺乐灵溶液中浸渍24h，种子死亡率仅为45％)。

[0017] 本发明的有益效果是，本发明通过浸渍法成功诱导刺葡萄萌动种子而获得了刺葡萄四倍体，浸渍溶液为氨磺乐灵，最合适的浓度为0.003％左右，诱变率高达60％以上；氨磺乐灵于生产上普遍做一种除草剂在使用，而秋水仙素是一种从百合科植物中提取的剧毒植物碱，所以无论从浓度、毒性、成本、诱导效率高低等几方面看，植物倍性诱导试验中如能更多地利用氨磺乐灵替代秋水仙素作诱变剂，低浓度、低毒性、低成本、高诱导效率的优势将非常明显。

附图说明

[0018] 图1表示刺葡萄二倍体染色体(2n＝2x＝38)(×5500)；

[0019] 其中，“×”表示显微镜放大位数；

[0020] 图2表示刺葡萄四倍体染色体(2n→4x＝76)(×5500)；

[0021] 图3表示对照(2n)刺葡萄气孔(×800)；

[0022] 图4表示变异体(4n)刺葡萄气孔(×800)。

具体实施方式

[0023] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。

[0024] 实施例1

[0025] 氨磺乐灵作用于已萌发的刺葡萄种子的倍性诱变试验设计方案见表1：该试验以浸渍法进行。以清水浸渍为对照，设3次重复，共12个处理；每发芽盒中盛装各处理溶液500ml，浸渍催芽效果大致相同的已萌发至露白阶段的刺葡萄种子100粒，浸渍时间分别为
12h、24h、36h。作为氨磺乐灵有机溶剂的DMF在处理溶液中的含量为0.04％-0.08％。

[0026] 种子浸渍试验在25℃恒温摇床(旋转频率：40∽400rpm；摆振幅度：Φ25mm)中进行。

[0027] 刺葡萄种子浸渍处理完成后，用清水洗净种子，分别播种于大棚内，统计成活率，观测刺葡萄生长发育情况与诱变效应。

[0028] 表1 氨磺乐灵浸渍刺葡萄种子的倍性诱变试验设计

[0029]

[0030] 观测于播种葡萄种子后，伴随刺葡萄植株的生长进行。

[0031] 各处理死亡率统计方法：

[0032] 死亡率＝死亡种子数/播种种子数(100粒)×100％

[0033] 各处理诱变率统计方法：

[0034] 诱变率＝产生的变异植株数/镜检植株数×100％。

[0035] 叶片形态与含水量观测方法

[0036] 分别采集已停止生长，具有明显变异特征叶片(2n→4x＝76)与对照叶片(2n＝2x＝38)各50片，用电子数显卡尺测量各处理叶片厚度，求平均值；用有机玻璃直尺测量各处理叶片的长度与宽度，分别求平均值；用电子天平称取各处理叶片鲜重(W鲜)；利用烘干法在烘箱里先70℃、后105℃将各处理叶片烘至恒重(W干)，利用数学方法计算变异体叶片(4n)与对照叶片(2n)含水量：叶片含水量＝(W鲜–W干)/W鲜×100％。

[0037] 气孔观测方法

[0038] 晴天上午8∶30～10∶00，分别取已停止生长、具有明显变异特征叶片(4n)与对照叶片(2n)各10片。用毛笔醮火胶棉溶液于叶背主脉两侧涂一薄层，2～4min后用镊子揭下溶胶，去掉叶背绒毛。然后再于主脉两侧涂抹一层，取下凝胶印膜，置于显微镜下观察并拍照。

[0039] 枝蔓粗度与节间长短观测方法

[0040] 分别选取已停止生长或进入缓慢生长，具有明显变异特征的枝蔓(4n)与对照枝蔓(2n)各5条，分别测量第3～12节(50节)节间粗度，求平均值；用有机玻璃直尺分别测量第3～12节(50)节间长度，求平均值。

[0041] 果实内在与外在品质观测方法

[0042] 2015年9月15日，从具有明显变异特征枝蔓与对照枝蔓上剪取果穗各15穗，用电子天平分别称取果穗重量，计算4n与2n果穗与果粒平均重量；用便携式手持数显糖度计分别测量上述二者可溶性固形物含量，求平均值。

[0043] 结果分析

[0044] 本实施例在采用去壁低渗法对选取的茎尖进行镜检的同时，观测了染色体数目(图1，2)。单元视野中观察到对照刺葡萄染色体数目为2n＝2x＝38，而刺葡萄变异类型的染色体数目大多为2n→4x＝76，有少量的为2n＝2x＝38+4、2n＝2x＝38+6等类型。

[0045] 经过浸渍处理的刺葡萄种子播于“0.618侧腰开孔”营养钵中25d后，对它们形成植株能力强弱等方面进行了观测与统计。从表2可看出，不论是对照还是不同浓度的氨磺乐灵处理，随处理时间的延长，形成植株能力呈下降趋势，种子死亡率呈上升趋势。其中，以第12处理即被0.004％氨磺乐灵处理36h的处理，死亡率最高，达91％。

[0046] 从图1和图2结合表2看出，以氨磺乐灵不同浓度和不同时间浸渍已萌发刺葡萄种子后，除对照以外的各处理均产生了倍性变异植株，且变异植株体内染色体大多由2n＝2x＝38变成了2n→4x＝76。其中，以第8处理即被0.003％氨磺乐灵浸渍萌动种子24h的处理，倍性诱变效果最佳，倍性诱变率达61.1％。

[0047] 表2 不同浸渍浓度与时间的氨磺乐灵对刺葡萄种子倍性诱变效果

[0048]

[0049] 注：表中小写英文字母表示p≦0.05

[0050] 氨磺乐灵对刺葡萄叶片的形态影响

[0051] 采集具有明显变异特征的叶片(4n)50片、对照(2n)叶片50片，从形态、大小、叶片厚度等方面进行了观测与分析：从叶片形态方面观察，对照刺葡萄叶片(2n)为阔卵形，受氨磺乐灵影响产生的倍性变异叶片(4n)为心形；变异体叶片的叶色比对照的更浓绿，变异体叶片叶面较脆且更粗糙；已产生倍性变异的叶片比对照的更厚(见表3)；对照叶片虽比已产生倍性变异的叶片长且宽，但从测得的叶片含水量高低方面分析，发生倍性变异的叶片比对照的含水量要低，干物质含量相对较高(见表3)。

[0052] 表3 刺葡萄对照(2n)与倍性变异体(2n)叶片形态比较

[0053]

[0054] 注：表中小写英文字母表示p≦0.05

[0055] 氨磺乐灵对叶片气孔形态与大小的影响

[0056] 把从变异体与对照叶的叶背取下的凝胶印膜置于显微镜下进行观测：变异体叶片气孔(4n)的长度和宽度均大于对照(2n)，说明变异体叶片的气孔比对照大。看图3和图4，变异体叶片的气孔密度比对照的小(见图3、4)。

[0057] 氨磺乐灵对刺葡萄枝蔓粗度与节间长度的影响

[0058] 从表4可以看出，刺葡萄变异四倍体的节间长度与对照二倍体的相比，节间明显变短，是对照的54.40％；枝蔓节间粗度也明显变细，仅对照的50.10％。这与同源多倍体的生长速率一般低于二倍体有关。

[0059] 表4 氨磺乐灵对刺葡萄枝蔓粗度与节间长度的影响

[0060]

[0061] 注：表中小写英文字母表示p≦0.05

[0062] 湖南生物机电职业技术学院藤本园中栽植的变异四倍体刺葡萄果实成熟期与对照二倍体的无明显差异，二者都于8/下旬～9/上中旬成熟。成熟后果粒颜色都为蓝黑色，颜色深浅并无显著区别。从表6可以看出，4n果穗与果粒虽比2n都稍大，稍重，但都未达到显著水平。变异四倍体的可溶性固形物含量达19.39％，比对照的11.15％明显要高。

[0063] 表5 氨磺乐灵对果实外形与可溶性固形物的影响

[0064]

[0065] 注：表中小写英文字母表示p≦0.05

[0066] 实施例2

[0067] 考察氨磺乐灵浓度的小变幅范围与浸渍的短时间差对刺葡萄已萌动种子的倍性诱变效果：以0.0025％、0.003％、0.0035％浓度的氨磺乐灵，分别浸渍刺葡萄种子20h、24h、28h(见表6)，虽其诱变率都在46％以上，但比最佳条件(0.0003％、24h)诱变率低。

[0068] 表6 小变幅浓度的氨磺乐灵与短时间差的浸渍对刺葡萄种子倍性诱变效果[0069]