一种滁菊叶片离体高效再生的方法

摘要

本发明公开一种滁菊叶片离体高效再生的方法，包括以下步骤：1)取材：选取滁菊叶片作为外植体；2)切片3)愈伤组织的诱导4)愈伤组织的增殖；5)愈伤组织的分化；6)不定芽的增殖和伸长；7)生根：待不定芽伸长至2～3cm,并伴有2～3个完全伸展的叶子时进行生根培养。本发明具有取材方便、材料丰富；再生效率高，愈伤组织诱导率高达100％，分化率高达95％，生根率高达100％；再生速度快，繁殖系数高，且能实现对获得的无菌苗叶片的进行进一步的扩大繁殖，为优良滁菊株系的快速繁殖和品种改良提供了重要的技术支持的优点。

权利要求

1.一种滁菊叶片离体高效再生的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)取材：选取滁菊叶片作为外植体；

2)切片：将步骤1)中的滁菊叶片进行切片；

3)愈伤组织的诱导:将步骤2)中的切片接种于愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导培养；

4)愈伤组织的增殖：将步骤3)中诱导的切片愈伤组织接种于增殖培养基中进行愈伤组织的增殖；

5)愈伤组织的分化：将步骤4)中增殖后的愈伤组织切块并转接于分化培养基中进行愈伤组织的分化；

6)不定芽的增殖和伸长：将步骤5)中分化出不定芽的愈伤组织转接于不定芽增殖和伸长培养基中进行不定芽的增殖和伸长培养；

7)生根：待不定芽伸长至2～3cm,并伴有2～3个完全伸展的叶子时进行生根培养；

其中，所述步骤3)中愈伤组织诱导培养基包括MS+0.1～3.0mg/L TDZ+0.01～0.05mg/L 

6-BA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8；

所述步骤4)中愈伤组织增殖培养基为MS+0.2～2.0mg/L TDZ+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8；

所述步骤5)中愈伤组织的分化培养基为MS+0.2～1.0mg/L TDZ+0.05～0.2mg/L 6-BA+

0.1～1.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8；

所述步骤6)中不定芽增殖和伸长培养基为MS+0.5～2.0mg/L 6-BA+0.05～0.2mg/L TDZ+0.2～2.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8；

所述步骤7)中的生根培养基为1/2MS+0.05～0.3mg/L IBA+0.05～0.5mg/L IAA+20g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8。

2.根据权利要求1所述的一种滁菊叶片离体高效再生的方法，其特征在于：所述步骤1)的滁菊叶片为田间滁菊优良株系当年生幼嫩枝条的叶片或离体再生所获得的滁菊无菌苗完全伸展的叶片。

3.根据权利要求2所述的一种滁菊叶片离体高效再生的方法，其特征在于：所述滁菊叶片离体高效再生的方法还包括表面消毒；表面消毒：将步骤1)中取材于田间的当年生幼嫩枝条的叶片经75％的无水乙醇擦拭一遍后，无菌工作台中用无菌水冲洗2～3遍；然后用

75％的无水乙醇消毒10～25s后，用无菌水清洗2～3遍；然后用0.1％HgCl2溶液消毒1～

3min,无菌水冲洗5～6遍。

4.根据权利要求1所述的一种滁菊叶片离体高效再生的方法，其特征在于：光照培养14～16d后，将步骤3)中诱导的叶片愈伤组织接种于增殖培养基中进行愈伤组织的增殖。

5.根据权利要求1所述的一种滁菊叶片离体高效再生的方法，其特征在于：光照培养10～14d后，将步骤4)中增殖后的愈伤组织切成(0.4～0.5)×(0.4～0.5)cm2大小的切块并转接于分化培养基中进行愈伤组织的分化。

6.根据权利要求1所述的一种滁菊叶片离体高效再生的方法，其特征在于：光照培养21～28d后，将步骤5)中分化出不定芽的愈伤组织转接于不定芽增殖和伸长培养基中进行不定芽的增殖和伸长培养。

说明书

一种滁菊叶片离体高效再生的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种滁菊叶片离体高效再生的方法。

背景技术

[0002] 滁菊(Dendranthema morifolium CV.‘chuju’),为滁州市特有的传统产品，为重要的中草药及经济作物，有滁州贡菊之称。属药、茶兼用佳品，具有极高的药用和保健价值，在中国已有几百年的栽培历史。长期饮用滁菊具有清热解毒、舒筋活血、护肝明目、增强人体免疫力等功能，同时对冠心病、高血压疗效显著。滁菊名列安徽省“四大”著名道地药材之首和中国“四大”药菊之首。目前，滁菊已经成为滁州当地支柱产业，在滁州地区大面积种植。

[0003] 但目前在生产上，由于滁菊长期采用扦插和分株等传统的无性繁殖手段进行繁殖，使得滁菊普遍存在品种退化、病虫害严重、相关品种改良和更新速度慢等问题，大大限制了以滁菊作为药、茶兼用佳品进行大规模栽培和产业化的应用。因此，加强其品种改良，培育高产、优质且抗虫滁菊优良品种是当前发展滁菊产业最为迫切的任务。目前有关滁菊育种的研究，主要集中在利用杂交手段进行，远不能适应菊农对品种产量和品质的要求。

[0004] 由于利用组织培养技术可在短期内可获得大量的无菌苗，可在实现滁菊的优良种质资源规模化生产的同时，使得加速滁菊的品种改良进程成为可能。目前有关滁菊离体再生的研究较少，其中利用滁菊叶片为外植体进行离体再生的研究已有报道，但普遍存在繁殖系数低、可重复性差、外植体易变黑死亡和分化过程玻璃化现象严重等问题，严重限制了叶片在滁菊离体快繁中的应用。针对上述滁菊种植中所存在的诸多问题，同时为了满足规模化种植和品种改良对滁菊优质种苗的需求，急需开发一种滁菊叶片离体高效再生的方法。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于运用植物组织培养技术，提供一种滁菊叶片离体高效再生的方法。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0006] 一种滁菊叶片离体高效再生的方法，包括以下步骤：

[0007] 1)取材：选取滁菊叶片作为外植体；

[0008] 2)切片：将步骤1)中的滁菊叶片进行切片；

[0009] 3)愈伤组织的诱导:将步骤2)中的切片接种于愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导培养；

[0010] 4)愈伤组织的增殖：将步骤3)中诱导的切片愈伤组织接种于增殖培养基中进行愈伤组织的增殖；

[0011] 5)愈伤组织的分化：将步骤4)中增殖后的愈伤组织切块并转接于分化培养基中进行愈伤组织的分化；

[0012] 6)不定芽的增殖和伸长：将步骤5)中分化出不定芽的愈伤组织转接于不定芽增殖和伸长培养基中进行不定芽的增殖和伸长培养；

[0013] 7)生根：待不定芽伸长至2～3cm,并伴有2～3个完全伸展的叶子时进行生根培养。

[0014] 优选地，所述步骤1)的滁菊叶片为田间滁菊优良株系当年生幼嫩枝条的叶片或离体再生所获得的滁菊无菌苗完全伸展的叶片。

[0015] 优选地，所述滁菊叶片离体高效再生的方法还包括表面消毒；表面消毒：将步骤2)中取材于田间的当年生幼嫩枝条的叶片经75％的无水乙醇擦拭一遍后，无菌工作台中用无菌水冲洗2～3遍；然后用75％的无水乙醇消毒10～25s后，用无菌水清洗2～3遍；然后用0.1％HgCl2溶液消毒1～3min,无菌水冲洗5～6遍。

[0016] 优选地，所述步骤3)中愈伤组织诱导培养基包括MS+0.1～3.0mg/L TDZ+0.01～0.05mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH＝5.8。

[0017] 优选地，光照培养14～16d后，将步骤3)中诱导的叶片愈伤组织接种于增殖培养基中进行愈伤组织的增殖；其中愈伤组织增殖培养基为MS+0.2～2.0mg/L TDZ+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8。

[0018] 优选地，光照培养10～14d后，将步骤4)中增殖后的愈伤组织切成(0.4～0.5)×(0.4～0.5))cm2大小的切块并转接于分化培养基中进行愈伤组织的分化；其中愈伤组织的分化培养基为MS+0.2～1.0mg/L TDZ+0.05～0.2mg/L 6-BA+0.1～1.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8。

[0019] 优选地，光照培养21～28d后，将步骤5)中分化出不定芽的愈伤组织转接于不定芽增殖和伸长培养基中进行不定芽的增殖和伸长培养；其中不定芽增殖和伸长培养基为MS+0.5～2.0mg/L 6-BA+0.05～0.2mg/L TDZ+0.2～2.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8。

[0020] 优选地，所述步骤7)中的生根培养基为1/2MS+0.05～0.3mg/L IBA+0.05～0.5mg/L IAA+20g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8。

[0021] 本发明的优点在于：其一，取材方便、材料丰富；其二，再生效率高，愈伤组织诱导率能高达100％，分化率能高达95％，生根率能高达100％；其三，再生速度快，繁殖系数高，且能实现对获得的无菌苗叶片的进行进一步的扩大繁殖，为优良滁菊株系的快速繁殖和品种改良提供了重要的技术支持。因此，本发明所提供的一种滁菊叶片离体高效再生的方法，不仅为滁菊优良株系的快速繁殖和规模化生产提供了技术支撑，同时也为后期滁菊的品种改良奠定了基础。

附图说明

[0022] 图1为滁菊叶片愈伤组织的诱导

[0023] 图2为愈伤组织的增殖

[0024] 图3为愈伤组织的分化

[0025] 图4为不定芽的增殖和伸长

[0026] 图5为不定芽的生根

具体实施方式

[0027] 以下结合附图对本发明进行详细的描述。

[0028] 实施例1

[0029] 一种滁菊叶片离体高效再生的方法，具体操作如下：

[0030] 1、从大田选取生长良好的多年生滁菊优良株系，选取滁菊当年生新生幼嫩枝条的叶片为外植体。

[0031] 2、经75％无水乙醇擦拭1遍后，于无菌操作台中，用无菌水冲洗3遍，然后用75％酒精消毒10s，无菌水冲洗3遍，之后用0.1％的升汞消毒1min，最后用无菌水冲洗6遍。消毒后将叶片切成0.3×0.3cm2大小的切块备用。

[0032] 3、将叶片切块近轴端向上接种于愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导，经过15d的光照培养，叶片切口处诱导出大量的淡绿色愈伤组织，且愈伤组织的诱导率为83.7％；其中愈伤组织的诱导培养基为MS+0.1mg/L TDZ+0.01mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8；

[0033] 4、将诱导出愈伤组织的叶片转接于增殖培养基中进行愈伤组织的增殖培养，光照培养12d后获得大量的绿色质地疏松的愈伤组织；愈伤组织的增殖培养基为MS+0.2mg/L TDZ+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8；

[0034] 5、将增殖后的愈伤组织，切成0.4×0.4cm2大小的切块并转接于分化培养基中进行愈伤组织的分化培养；光照培养24d后，愈伤组织上分化出大量的绿色不定芽点，且愈伤组织的分化率为89.4％；其中愈伤组织的分化培养基为MS+0.2mg/L TDZ+0.05mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8；

[0035] 6、将分化出不定芽丛的愈伤组织，转接于不定芽增殖和伸长的培养基中进行不定芽的增殖和伸长；光照培养16d后获得大量的伸长的不定芽,其中不定芽增殖和伸长培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+0.05mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8；

[0036] 7、待不定芽伸长至2cm,并伴有2个完全伸展的叶子时，转入生根培养基中进行生根培养；光照培养16d后,不定芽的基部长出大量细长的不定根，且不定根的诱导率高达100％；其中生根培养基为1/2MS+0.05mg/L IBA+0.05mg/LIAA+20g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8。

[0037] 实施例2

[0038] 一种滁菊叶片离体高效再生的方法，具体操作如下：

[0039] 1、从大田选取生长良好的多年生滁菊优良株系，选取滁菊当年生新生幼嫩枝条的叶片为外植体。

[0040] 2、经75％无水乙醇擦拭1遍后，于无菌操作台中，用无菌水冲洗3遍，然后用75％酒精消毒15s，无菌水冲洗2遍，之后用0.1％的升汞消毒2min，最后用无菌水冲洗6遍。消毒后将叶片切成0.3×0.5cm2大小的切块备用。

[0041] 3、将叶片切块近轴端向上接种于愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导，经过14d的光照培养，叶片切口处诱导出大量的淡绿色愈伤组织，且愈伤组织的诱导率为100％(图1)；其中愈伤组织的诱导培养基为MS+1.5mg/L TDZ+0.03mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+
7.0g/L琼脂,pH＝5.8；

[0042] 4、将诱导出愈伤组织的叶片转接于增殖培养基中进行愈伤组织的增殖培养，光照培养10d后获得大量的绿色质地疏松的愈伤组织(图2)；其中愈伤组织的增殖培养基为MS+1.0mg/L TDZ+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8；

[0043] 5、将增殖后的愈伤组织，切成0.4×0.5cm2大小的切块并转接于分化培养基中进行愈伤组织的分化；光照培养21d后，愈伤组织切块上分化出大量的绿色不定芽点(图3)，且愈伤组织的分化率为97.4％；愈伤组织的分化培养基为MS+0.5mg/L TDZ+0.1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8；

[0044] 6、将分化后的愈伤组织，转接于不定芽增殖和伸长的培养基中进行不定芽的增殖和伸长，光照培养14d后获得大量的伸长的不定芽(图4)；其中不定芽增殖和伸长培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8；

[0045] 7、待不定芽伸长至2cm,并伴有2个完全伸展的叶子时，转入生根培养基中进行生根培养；光照培养14d后,不定芽的基部长出大量粗壮的不定根(图5)，且不定根的诱导率高达100％；其中生根培养基为1/2MS+0.1mg/L IBA+0.1mg/L IAA+20g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8。

[0046] 实施例3

[0047] 一种滁菊叶片离体高效再生的方法，具体操作如下：

[0048] 1、从大田选取生长良好的多年生滁菊优良株系，选取滁菊当年生新生枝条的幼嫩叶片为外植体。

[0049] 2、75％无水乙醇擦拭1遍后，于无菌操作台中，用无菌水冲洗2遍，然后用75％酒精消毒25s，无菌水冲洗3遍，之后用0.1％的升汞消毒3min，最后用无菌水冲洗5遍。消毒后将叶片切成0.5×0.5cm2大小的切块备用。

[0050] 3、将叶片切块近轴端向上接种于愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导，经过16d的光照培养，叶片切口处诱导出大量的愈伤组织，且愈伤组织的诱导率为100％；愈伤组织的诱导培养基为MS+3.0mg/L TDZ+0.05mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8；

[0051] 4、将诱导出愈伤组织的叶片转接于增殖培养基中进行愈伤组织的增殖培养，光照培养14d后获得大量的绿色质地紧密的愈伤组织；愈伤组织的增殖培养基为MS+2.0mg/L TDZ+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8；

[0052] 5、将增殖后的愈伤组织，切成0.5×0.5cm2大小的切块并转接于分化培养基中进行愈伤组织的分化；光照培养28d后，愈伤组织上分化出大量的不定芽点，愈伤组织的分化率为79.4％；愈伤组织的分化培养基为MS+1.0mg/L TDZ+0.2mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8；

[0053] 6、将分化后的愈伤组织，转接于不定芽增殖和伸长的培养基中进行不定芽的增殖和伸长,光照21d后，获得大量的伸长的不定芽；不定芽增殖和伸长培养基为MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L TDZ+2.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8；

[0054] 7、待不定芽伸长至3cm,并伴有3个完全伸展的叶子时，转入生根培养基中进行生根培养，光照培养21d后,不定芽的基部长出大量短粗的不定根，且不定根的诱导率高达97.6％；其中生根培养基为1/2MS+0.3mg/L IBA+0.5mg/LIAA+20g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝
5.8。

[0055] 实施例4

[0056] 一种滁菊叶片离体高效再生的方法，具体操作如下：

[0057] 测试了叶片接种方式对滁菊叶片离体再生效率的影响：仅改变叶片切块的接种方式，将消毒后的叶片切块分别以近轴端和远轴端向上的方式，接种于愈伤组织诱导培养基中，于光下培养。其余步骤同实施例2。光照培养14-16d后，统计愈伤组织的诱导情况。结果表明(表1)叶片的接种方式对愈伤组织的诱导起着重要的作用。叶片近轴端向上的接种方式更利于愈伤组织的诱导和后期的分化。

[0058] 表1 接种方式对滁菊叶片离体再生的影响

[0059]

[0060] 注：数据为平均数±标准误，每个处理包含30个外植体，每个处理重复3次。

[0061] 实施例5

[0062] 一种滁菊叶片离体高效再生的方法，具体操作如下：

[0063] 测试了叶片的来源对滁菊离体再生效率的影响：仅改变叶片切块的的来源，将来源于野外优良株系消毒后的叶片切块和快繁获得的滁菊无菌苗叶片，均以近轴端向上的方式，分别接种于愈伤组织诱导培养基中，于光下培养。其余步骤同实施例2。光照培养14-16d后，统计愈伤组织的诱导情况。结果表明(表2)叶片的来源对愈伤组织的诱导无明显差异。

[0064] 表2 叶片来源对滁菊叶片离体再生的影响

[0065]

[0066] 注：数据为平均数±标准误，每个处理包含30个外植体，每个处理重复3次。

[0067] 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。