一种基于DSE快速扩繁建立DSE-植物共生体系的方法

摘要

本发明属于微生物学、植物营养和生态学领域，具体涉及一种基于DSE快速扩繁建立DSE‑植物共生体系的方法。本发明选择蛭石、珍珠岩、豆粕和麸皮的混合物为培养基质，添加经改进的MMN培养液为营养液，对DSE进行快速扩繁，获得含有DSE孢子、菌丝体的菌剂，进而通过接种含有大量DSE孢子和菌丝的菌剂实现快速建立DSE‑植物共生体系的目的；采用本发明所述方法建立DSE‑植物共生体系的时间短、成功率高、效果好，可用于DSE形态学研究、鉴定以及DSE与植物的互作研究等等。

权利要求

1.一种基于DSE快速扩繁建立DSE-植物共生体系的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）DSE快速扩繁：将DSE菌株接种到PDA培养基上，置于25℃培养箱内暗培养活化2周，用Φ5 mm打孔器沿菌落边缘打取DSE菌饼；将DSE菌饼接种至扩繁培养基中，混合均匀，置于

25℃培养箱内暗培养2周，每隔48 h摇瓶振荡一次；采用稀释平板法检测DSE有效繁殖体数量，当DSE有效繁殖体数量≥50 CFU/g 时即得到DSE接种剂，备用；所述扩繁培养基包括改进的MMN培养液和培养基质，所述培养基质为蛭石、珍珠岩、豆粕和麸皮按照体积比为3：2：

1：1的比例混合而成的混合物，所述改进的MMN培养液和培养基质的体积比为2：5；所述改进的MMN培养液为：葡萄糖15 g，麦芽浸粉15 g，CaCl2 0.05 g，MgSO4 0.15 g，NaCl 0.025 g，FeCl3 1wt%、1.2 mL，KH2PO4 0.5 g，硫胺素100 μg，(NH4)2HPO4 0.25 g，柠檬酸0.2 g，蒸馏水1000 mL，pH 5.5；

（2）无菌植物幼苗的培养：将种子用70％乙醇消毒50 s，用0.1%HgCl2消毒7 min，然后用无菌水冲洗3次，将消毒后的种子转移到含有MS固体培养基的培养瓶中25℃培养，待种子萌发形成幼苗时，挑选生长一致的幼苗作为无菌植物幼苗，备用；

（3）DSE-植物共生体系的建立：将DSE接种剂接种至共生培养基中，充分混合后再接入无菌植物幼苗，用无菌的PVA膜封口，置于光照培养箱内培养2周；所述共生培养基包括MS培养基和蛭石，所述MS培养基和蛭石的质量比为3：10；

（4）DSE-植物共生体系的检测：2周后，将植物幼苗从共生培养培养瓶中取出，用蒸馏水冲洗根系，放入10% KOH溶液中，90℃水浴条件下解离30 min，然后经1%盐酸酸化、0.05%曲利苯蓝染色、乳酸甘油脱色后于显微镜下镜检观察根系中DSE的定殖情况，当部分根段看到DSE的深色或蓝色有隔菌丝和典型特征“微菌核”时，表明 DSE-植物共生体系建立成功。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述光照培养箱内培养的条件为：

温度 25℃、光照14 h/d、光照强度1000 8000 Lux。

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说明书

一种基于DSE快速扩繁建立DSE-植物共生体系的方法

技术领域

[0001] 本发明属于微生物学、植物营养和生态学领域，具体涉及一种基于DSE快速扩繁建立DSE-植物共生体系的方法。

背景技术

[0002] 深色有隔内生真菌(Dark Septate Endophytes，DSE)是指能够广泛地存在于植物根的表皮、皮层甚至维管束组织的细胞内或细胞间隙、分类学上比较混杂的一类共生真菌，菌丝呈现棕色或深色且有隔膜，能够在植物细胞内或细胞间隙形成“微菌核(microsclerotia)”结构。DSE被认为具有类似菌根的功能，且和丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi,AMF)相比，这类共生真菌能够在干旱、寒冷和重金属污染地区等环境中广泛分布，并且对提高逆境下宿主植物的耐受性发挥重要作用。

[0003] 目前，对DSE的研究越来越受到重视，如何用较短的时间，高效率的获得DSE-植物共生苗成为DSE研究中的关键技术之一。而目前常用的DSE-植物共生体系的建立方法是在植物幼苗的固态培养基质或培养液中直接接种DSE的菌饼(或菌块)。然而，新接入的菌饼(或菌块)上的DSE菌丝一般很难直接侵入植物根系，通常需要一定时间的生长和繁殖，而植物培养环境及营养条件并不利于DSE生长，因此这种方法下DSE-植物共生体系建立时间较长，也增加了杂菌污染的几率，成功率低。

发明内容

[0004] 本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种基于DSE快速扩繁建立DSE-植物共生体系的方法。

[0005] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

[0006] 一种基于DSE快速扩繁建立DSE-植物共生体系的方法，包括如下步骤：

[0007] (1)DSE快速扩繁：将DSE菌株接种到PDA培养基上，置于25℃培养箱内暗培养活化2周，用Φ5mm打孔器沿菌落边缘打取DSE菌饼；将DSE菌饼接种至扩繁培养基中，混合均匀，置于25℃培养箱内暗培养2周，每隔48h摇瓶振荡一次；采用稀释平板法检测DSE有效繁殖体数量，当DSE有效繁殖体数量达到≥50CFU/g时即得到DSE接种剂，备用；

[0008] (2)无菌植物幼苗的培养：将种子用70％乙醇消毒50s，用0.1％HgCl2消毒7min，然后用无菌水冲洗3次，将消毒后的种子转移到含有MS固体培养基的培养瓶中25℃培养，待种子萌发形成幼苗时，挑选生长一致的幼苗作为无菌植物幼苗，备用；

[0009] (3)DSE-植物共生体系的建立：将DSE接种剂接种至共生培养基中，充分混合后再接入无菌植物幼苗，用无菌的PVA膜封口，置于光照培养箱内培养2周；

[0010] (4)DSE-植物共生体系的检测：2周后，将植物幼苗从共生培养培养瓶中取出，用蒸馏水冲洗根系，放入10％KOH溶液中，90℃水浴条件下解离30min，然后经1％盐酸酸化、0.05％曲利苯蓝染色、乳酸甘油脱色后于显微镜下镜检观察根系中DSE的定殖情况，当部分根段看到DSE的深色或蓝色有隔菌丝和典型特征“微菌核”时，表明DSE-植物共生体系建立成功。

[0011] 上述方案中，步骤(1)所述扩繁培养基包括改进的MMN培养液和培养基质，所述培养基质为蛭石、珍珠岩、豆粕和麸皮按照体积比为3：2：1：1的比例混合而成的混合物，所述改进的MMN培养液和培养基质的体积比为2：5。

[0012] 上述方案中，所述改进的MMN培养液为：葡萄糖15g，麦芽浸粉15g，CaCl2 0.05g/L，MgSO4 0.15g，NaCl 0.025g，FeCl3(1％)1.2mL，KH2PO4 0.5g，硫胺素100μg，(NH4)2HPO4 0.25g，柠檬酸0.2g，蒸馏水1000mL，pH 5.5。

[0013] 上述方案中，步骤(3)所述共生培养基包括MS培养基和蛭石，所述MS培养基和蛭石的质量比为3：10。

[0014] 上述方案中，步骤(3)所述光照培养箱内培养的条件为：温度25℃、光照14h/d、光照强度1000～8000Lux。

[0015] 本发明以多种天然基质为载体快速扩繁DSE，以获得的含有DSE孢子、菌丝体和基质的混合物为菌剂接种植物，从而达到快速建立DSE-植物共生体的目的。DSE为好氧微生物，培养基质要求通气性好。根据这一特性，蛭石和珍珠岩是理想的基质。蛭石经高温膨胀而成，有较好的通透性和保水性，质轻，不腐烂不变质。珍珠岩为页岩，具有无吸收性、不易破碎、不吸收养分、质轻、通气性好的特点。国内外研究表明，DSE能够分泌多种胞外酶，如淀粉酶、蛋白水解酶和纤维素水解酶等，对有机碳源和氮源有较高的利用率。豆粕中蛋白质含量高，脂肪含量低，一般成片状、颗粒或小块，易于粉碎，是提供天然蛋白质源的理想基质。麸皮体轻，质地疏松，表面积大，有多种维生素及钙等无机盐，是培养真菌的良好基质。因此，本发明以蛭石、珍珠岩、豆粕和麸皮的混合物为培养基质进行DSE扩繁，以获得的高质量DSE菌剂对植物进行接种，大大缩短了实验周期并提高了接种的成功率。

[0016] 本发明的有益效果：本发明选择蛭石、珍珠岩、豆粕和麸皮的混合物为培养基质，添加经改进的MMN培养液为营养液，对DSE进行快速扩繁，获得含有DSE孢子、菌丝体的菌剂，进而通过接种含有大量DSE孢子和菌丝的菌剂实现快速建立DSE-植物共生体系的目的；采用本发明所述方法建立DSE-植物共生体系的时间短、成功率高、效果好，可用于DSE形态学研究、鉴定以及DSE与植物的互作研究等等。

具体实施方式

[0017] 为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

[0018] 实施例1

[0019] 柱孢顶囊壳(Gaeumannomyces cylindrosporus)-玉米共生体系的建立[0020] (1)G.cylindrosporus的活化：将4℃冷藏的G.cylindrosporus菌株接种到PDA固体平板上，置于25℃培养箱内培养2周，用Φ5mm打孔器沿菌落边缘打取菌饼。

[0021] (2)扩繁培养基的配制与G.cylindrosporus接种培养：将蛭石、珍珠岩、豆粕和麸皮(体积比为3：2：1：1)混合后装入500mL锥形瓶中，装瓶量为250mL/瓶，然后加入100ml改进的MMN培养液，在121℃、0.1MPa条件下灭菌30min；灭菌完成后每瓶接入5个步骤(1)得到的G.cylindrosporus菌饼，混合均匀后在25℃培养箱内暗培养2周，培养期间每隔48h摇瓶振荡一次。

[0022] (3)G.cylindrosporus有效繁殖体数量检测：称取10g混合基质，装入盛有90mL无菌生理盐水和少量玻璃珠的三角瓶内，在120rpm条件下振荡30min；取1mL上清液加入盛有9mL无菌生理盐水的试管(15mm×150mm)中制备10倍系列稀释液；分别吸取10-2、10-3和10-4三个稀释度的样品100μL涂布于PDA培养基上，每个梯度设5个重复，置于25℃培养箱暗培养
7d，计算平板上G.cylindrosporus的菌落数。在10-2稀释度下G.cylindrosporus的平均菌落数是12，在10-3和10-4稀释度下的平均菌落数分别为2和0。根据菌落计数原则，选取菌落数在10～150CFU的平板进行计数，G.cylindrosporus的有效繁殖体数量为120CFU/g，即可作为接种用G.cylindrosporus菌剂。

[0023] (4)玉米幼苗的培养：将玉米种子用70％乙醇消毒50s，用0.1％HgCl2消毒7min，然后用无菌水冲洗3次；将消毒后的玉米种子转移到含有MS固体培养基的培养瓶(高度14cm，直径：9.65cm，口内径：4.17cm)中25℃培养，待种子萌发形成幼苗时，挑选生长一致的幼苗备用。

[0024] (5)G.cylindrosporus-玉米共生体系的建立：将蛭石和MS培养基按10：3(w/w)比例混合，放入玻璃瓶中在121℃、0.1MPa条件下灭菌30min；然后每个培养瓶中加入20g G.cylindrosporus菌剂，充分混合后接入无菌玉米幼苗2棵，用无菌的PVA膜封口；将培养瓶置于光照培养箱中，以温度25℃、光照14h/d、光照强度1000～8000Lux的条件下培养2周。以不接种G.cylindrosporus菌剂作为对照。

[0025] (6)共生体系检测：培养2周后将玉米幼苗从培养瓶中取出，用蒸馏水冲洗根系，加入到10％KOH溶液中，放在90℃水浴锅内30min；用蒸馏水清洗3次，加入1％的HCl溶液浸泡3～4min，倒去酸溶液加入0.05％曲利苯蓝染色液室温染色过夜。染色后，将根样放到乳酸甘油中脱色12h，随机选取根段放在载玻片上，盖上盖玻片，轻轻敲打盖玻片约1min，使根段组织均匀的分散在载玻片上。在光学显微镜(OLYMPUS BX51，Japan)下观察根系中DSE的定殖情况，发现根内有深色有隔菌丝和典型特征“微菌核”，空白对照未发现DSE定殖，表明G.cylindrosporus–玉米共生体系成功建立。

[0026] 实施例2

[0027] 沙门外瓶柄霉(Exophiala salmonis)-三叶草共生培养体系的建立

[0028] 实验菌株为本实验室保藏的DSE菌株沙门外瓶柄霉(E.salmonis)，具体实验步骤同实施例1。将含有沙门外瓶柄霉孢子和菌丝体的菌剂作为接种物，与三叶草一同接种至共生培养基中培养2周后，在显微镜下均可观察到深色有隔菌丝以及“微菌核”结构，表明沙门外瓶柄霉-三叶草和共生体系成功建立。

[0029] 实施例3

[0030] 枝状枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)-三叶草共生培养体系的建立[0031] 实验菌株为本实验室保藏的枝状枝孢菌(C.cladosporioides)，具体实验步骤同实施例1。将含有枝状枝孢菌孢子和菌丝体的菌剂作为接种物，与三叶草一同接种至共生培养基中培养2周后，在显微镜下均可观察到深色有隔菌丝以及“微菌核”结构，表明枝状枝孢菌-三叶草和共生体系成功建立。

[0032] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。