一种用于鉴别鸽子性别的引物、试剂盒及其鉴别方法

摘要

本发明公开了一种用于鉴别鸽子性别的引物、试剂盒及其鉴别方法，所述引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，该引物具有特异性好，分辨率高，扩增效果好等优点，不需进行酶切，直接进行琼脂糖凝胶电泳。而且，相对于一条特异性产物，两条特异性产物具有更高的辨识度，使得扩增结果可以一眼就可以分辨出来；本发明还提供了利用所述引物鉴别鸽子性别的方法，该方法在利用上述引物特异性扩增的前提下，还能够通过简化样品DNA的获得过程，缩短了鉴别鸽子性别的时间成本和经济成本，利用所述引物鉴别鸽子性别的方法具有广泛的市场利用价值。

权利要求

1.一种用于鉴别鸽子性别的试剂盒，其特征在于，含有序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物；

还包括PCR反应液、DNA提取液；

所述DNA提取液为血液样裂解液和羽毛样裂解液，其中，血液样裂解液选自DMSO、TE缓冲液或者双蒸水；所述羽毛样裂解液为PBS缓冲液。

2.权利要求1所述试剂盒在鉴别鸽子性别中的应用。

3.一种鉴别鸽子性别的PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：S1. 加入权利要求1中所述引物、PCR反应液，加入样品DNA，进行PCR反应；

S2. PCR反应后采用凝胶电泳分析电泳条带大小，进行结果判定：若显示大小分别为

474bp与319bp的两条电泳条带，则为雌性；若显示大小为474bp的一条电泳条带，则为雄性；

S1所述样品DNA通过样品前处理获得，所述样品前处理是指：若选择鸽子羽毛样品，则收集羽毛，并与PBS缓冲液混合完成样品的前处理；若选择鸽子血液样品，则收集血液，并与TE缓冲液、双蒸水或者DMSO混合完成样品的前处理。

4.根据权利要求3所述的PCR方法，其特征在于，所述血液包括静脉血液和羽毛毛囊中的血液。

5.根据权利要求3所述的PCR方法，其特征在于，S1所述PCR反应的体系为：2微升样品DNA，10微升PCR反应液、权利要求1所述引物10μM各1微升，余量为双蒸水，反应体系的总体积为20微升。

说明书

一种用于鉴别鸽子性别的引物、试剂盒及其鉴别方法

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物学检测技术领域，更具体地，涉及一种用于鉴别鸽子性别的引物、试剂盒及其鉴别方法。

背景技术

[0002] 性别鉴定在家禽的育种、养殖成本的控制等生产环节尤为重要。不同性别的个体其营养需求不同，及早区分性别可以对个体区别饲养；对于种鸽养殖，需要合理的性别比例，早期的性别鉴定将有助于实现这一过程。

[0003] 鸽子属于单态鸟，其性别不论是在幼鸟还是在成鸟时期，都很难从外观及其它行为上加以区别。翻肛鉴别法是目前在家禽生产中运用最广泛的方法，但是初生鸽体型小，仅有10g左右，难以在早期进行性别鉴定，只有到5月龄左右才可以用此方法鉴别，且鉴别的结果正确率低，耗时耗力。

[0004] 利用雌雄鸽子在CHD1基因上序列和拷贝数的不同，使用对鸽子伤害尽可能小的材料，如羽毛、血液等，运用两步法PCR（聚合酶链式反应）、琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像系统等技术对鸽子进行性别鉴定。降低检测成本，提高成功率，降低技术门槛，为鸽子的生产甚至家禽的生产带来革命性的改变；现有技术中存在一些鉴定鸽子性别的引物和方法，但公开的引物一些仅仅是扩增出一条带，通过条带大小不同来鉴别鸽子性别，这存在特异性不足，甚至假阴性的可能。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种新的用于鉴别鸽子性别的引物。

[0006] 本发明的第二个目的是提供一种利用鉴别鸽子性别的方法。

[0007] 本发明的第三个目的是提供含有上述引物的试剂盒。

[0008] 本发明的第四个目的是通过所述引物或者试剂盒的应用。

[0009] 本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

[0010] 一种用于鉴别鸽子性别的引物，所述引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

[0011] 发明人通过针对相同的目标区段，设计了多组引物，用于检测这些引物鉴定鸽子性别的特异性，其结果发现，只有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物能够特异性且灵敏的鉴别鸽子性别。

[0012] 因此，本发明还保护一种含有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物的试剂盒。

[0013] 该试剂盒可用于工业生产，从而实现快速鉴别鸽子性别的产业化，优选地，所述试剂盒还包括PCR反应液、DNA提取液。

[0014] 需要说明的是，本发明所述DNA提取液可以是现有技术中存在的能够提取到鸽子DNA（无论是羽毛DNA还是血液DNA） 的提取液，只要能够提取到鸽子DNA用于PCR，都适用于本发明的技术方案。

[0015] 在实际生产中，10日龄甚至更小的鸽子没有足够采集的羽毛。因此可以尝试通过血液样品来检测鸽子的性别，这一时期的乳鸽行动能力及反应能力都比较差，且鸽子的性情比较温顺，因此采血液时不会造成较大的应激，对鸽子造成的危害较小。

[0016] 因此优选地，所述DNA提取液可以是血液样裂解液和羽毛样裂解液；所述血液样裂解液选自DMSO、TE缓冲液或者双蒸水；所述羽毛样裂解液为PBS缓冲液。

[0017] 本发明还提供上述引物或者上述试剂盒在鉴别鸽子性别中的应用。

[0018] 本发明还提供一种鉴别鸽子性别的PCR方法，包括以下步骤：

[0019] S1. 加入SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所述引物，样品DNA，PCR反应液进行PCR反应；

[0020] S2. PCR反应后采用凝胶电泳分析电泳条带大小，进行结果判定：若显示大小分别为474bp与319bp的两条电泳条带，则为雌性；若显示大小为474bp的一条电泳条带，则为雄性。

[0021] 优选地，S2所述样品DNA通过样品前处理获得，所述样品前处理是指：若选择鸽子羽毛样品，则收集羽毛，并与PBS缓冲液混合完成样品的前处理；若选择鸽子血液样品，则收集血液，并与TE缓冲液、双蒸水或者DMSO混合完后样品的前处理。

[0022] 另外，发明人在研究中发现鸽子羽毛毛囊中贮存有足够性别鉴定所用的血液，这使得原本耗时耗力的采血工作变得简单，一个人就可以完成操作且不需要借助任何工具，该方法的可操作性显著增强，因此优选地，所述血液包括静脉血液和羽毛毛囊中的血液。

[0023] 优选地，上述方法中，S1所述PCR反应的体系为：2微升样品DNA，10微升PCR反应液、权利要求1所述引物10μM各1微升，余量为双蒸水，反应体系的总体积为20微升。

[0024] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0025] 本发明通过设计多组引物，筛选出了中用于鉴别鸽子性别的引物，所述引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，该引物具有特异性好，分辨率高，扩增效果好等优点，不需进行酶切，直接进行琼脂糖凝胶电泳。而且，相对于一条特异性产物，两条特异性产物具有更高的辨识度，使得扩增结果可以一眼就可以分辨出来；本发明还提供了利用所述引物鉴别鸽子性别的方法，该方法在利用上述引物特异性扩增的前提下，还能够通过简化样品DNA的获得过程，缩短了鉴别鸽子性别的时间成本和经济成本，利用所述引物鉴别鸽子性别的方法具有广泛的市场利用价值。

附图说明

[0026] 图1为利用引物CHD646扩增雄鸽和雌鸽的PCR结果，其中，M为Marker，1～12为雄鸽样本，13～24为雌鸽样本。

[0027] 图2为利用引物CHD520扩增雄鸽和雌鸽的PCR结果，其中，M为Marker，1～12为雄鸽样本，13～24为雌鸽样本。

[0028] 图3为利用引物CHD243扩增雄鸽和雌鸽的PCR结果，其中，M为Marker，1～12为雄鸽样本，13～24为雌鸽样本。

[0029] 图4 为雄鸽子和雌鸽子在解剖学上的差异。

[0030] 图5为不同裂解液处理样品得到的PCR扩增结果，其中，M为Marker；泳道1～4，5～8，9～12，13～16，17～20分别是用双蒸水、1×TE 缓冲液、pH=8.0的PBS 缓冲液、1%SDS 溶液、2.5M NaCl处理样品得到的PCR扩增的产物。

[0031] 图6为不同浓度TE缓冲液处理血液样PCR扩增电泳结果；其中，M为Marker；泳道1～4，5～8，9～12，13～16，17～20，21～24分别是用0.25×TE，0.5×TE，1×TE，2×TE，4×TE，8×TE 缓冲液处理后PCR扩增的产物，图中灰色框所示为扩增效果最好的处理组。

[0032] 图7为不同浓度DMSO处理血液样PCR扩增电泳结果，其中，M为Marker；泳道1～4，5～8，9～12，13～16，17～20，21～24分别是用0.25%、0.5%、1%、2%、4%、8%DMSO水溶液处理后PCR扩增的产物，红框中所示的为扩增效果最好的处理组。

[0033] 图8为2%DMSO处理血液样对雌鸽DNA进行PCR扩增的结果（A）和2%DMSO处理血液样对雄鸽DNA进行PCR扩增的结果（B）。

[0034] 图9为PBS缓冲液作为裂解液处理羽毛样PCR扩增电泳结果，其中，M为Marker；泳道1～6，7～12分别是6羽雌鸽和6羽雄鸽的羽毛样品经过1×PBS处理后PCR扩增的产物。

[0035] 图10为不同浓度的PBS缓冲液作为裂解液处理羽毛样PCR扩增电泳结果，其中，M为Marker；泳道1～4，5～8，9～12，13～16，17～20，21～24分别是4羽（2羽雌鸽和2羽雄鸽）的羽毛样品经过0.25×PBS、0.5×PBS、1×PBS、 2×PBS、4×PBS、8×PBS 处理后PCR扩增的产物。

[0036] 图11为1×PBS处理羽毛样对雄鸽DNA进行PCR扩增的结果。

[0037] 图12为1×PBS处理羽毛样对雌鸽DNA进行PCR扩增的结果。

[0038] 图13为鸽子羽毛毛囊中获得的新鲜血液。

具体实施方式

[0039] 下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

[0040] 羽毛结构较为完整的鸽子，一般是10日龄左右至成年鸽子。从待测的鸽子身上拔下羽毛2～3根，必须具有毛囊结构，装入无菌塑料封袋中待测，早期使用肝素钠真空采血管从鸽子翅膀采集静脉血样品1～2毫升，后期我们发现乳鸽羽毛毛囊中含有丰富的血液，也可用作鸽子性别鉴定血液样样品。

[0041] 实施例1 引物设计和特异性实验

[0042] 静脉血液样处理方法：前期用移液器取血液5 微升，按照1：30的体积比稀释到含有血液样裂解液的A管中。

[0043] 羽毛毛囊中血液样处理方法：将新采摘的羽毛沿毛羽向毛球按压，可以收集10微升甚至更多的新鲜血液，加入150微升血液样裂解液。

[0044] 羽毛样处理方法：将收集的羽毛沿根部剪下3～4 毫米，置于含有150 微升羽毛样裂解液的B管中，室温放置2分钟。

[0045] PCR扩增程序如下：

[0046] （1）在PCR仪中按照预先设定好的程序，98℃加热10分钟，之后4℃冷却十分钟，将A管或B管取出，1.2×104 g离心10分钟。

[0047] （2）将A管或B管中的上清转移至新PCR管中，取2微升作为PCR反应的模板，之后依次加入10微升PermixTaqTM，、6微升的双蒸水以及每一对上下游引物各1微升，总计20微升体系（每一对上下游引物序列如表1所示）。

[0048] （3）将加好的体系放入PCR仪中按照如下程序进行反应：a. 94℃预变性，加热5分钟；b. 94℃变性，加热30秒；c. 53.5℃退火，反应30秒；d. 72℃延伸，反应30秒；之后从b到d进行38个循环；f. 72℃再延伸反应5分钟，反应结束后跑琼脂糖凝胶电泳，根据条带数量和大小进行结果判定。

[0049]

[0050] CHD646合成的目的片段分别为CHD-Z和CHD-W，其长度分别为646bp和520bp，其PCR扩增结果如图1，从图1中可以看出，无论是公鸽样品，还是母鸽样品均扩增出了两条条带，且条带长度相近，不能够将不同性别的鸽子区分开来，且引物中存在非特异性结合，即产生了错误扩增，片段刚好为520bp左右。

[0051] CHD520合成的目的片段分别为CHD-Z和CHD-W，其长度分别为520bp和394bp，其PCR扩增结果如图2，从图2中可以看出，该引物未能够扩增出可以有效分辨鸽子性别的条带，只在520bp处扩增到了条带。说明该引物的特异性较差，上下游引物GC含量差异大导致退火温度等条件不一致，进而导致了扩增的失败。

[0052] CHD243合成的目的片段为CHD-W，其长度为243bp，本引物设计的思路是根据CHD1基因在ZW染色体上序列的不同，设计一条CHD-W特异的引物进行扩增，公鸽扩增不出条带，母鸽在243bp处有一条条带，从而鉴定鸽子性别。其PCR扩增结果如图3，从图3中可以看出，未扩增出条带的样本不能直接进行判定，既有可能是公鸽也有可能是未能有效扩增的母鸽。进一步实验的结果表明，该引物在最适温度下的扩增结果并不理想，这可能与引物本身的特异性有关，其对低浓度质量较差的模板DNA的扩增效率比较低，因此不适合作为鸽子性别鉴定的引物。

[0053] CHD457合成的目的片段分别为CHD-Z和CHD-W，其长度分别为457bp和308bp，其PCR扩增结果表明：引物存在非特异性结合，即产生了错误扩增，且片段刚好为1000bp左右，该引物不能作为鸽子性别鉴定的引物。

[0054] CHD474合成的目的片段分别为CHD-Z和CHD-W，其长度分别为474bp和319bp，其PCR扩增结果表明：利用该引物PCR扩增雌鸽样品，可在琼脂糖凝胶电泳上显示两条长度分别为474bp与319bp的条带，而雄鸽只能扩增出一条长度为474bp的条带，因此判断出待测样品的性别；CHD474的上游引物和下游引物的序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

[0055] 实施例2 裂解液筛选实验（血液样）

[0056] 样品处理方法同实施例1（这里选用了血液样），PCR扩增程序如下：

[0057] （1）在PCR仪中按照预先设定好的程序，98℃加热10分钟，之后4℃冷却十分钟，将A4
管或B管取出，1.2×10 g离心10分钟。

[0058] （2）将A管或B管中的上清转移至新PCR管中，取2微升作为PCR反应的模板，之后依次加入10微升PermixTaqTM，、6微升的双蒸水以及上下游引物各1微升，总计20微升体系（上下游引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示）。

[0059] SEQ ID NO：1：5'-TTCTGAGGATGGAAATGAGT-3'

[0060] SEQ ID NO：2：5'-AGCAATGGTTACAACACTTC-3'

[0061] （3）将加好的体系放入PCR仪中按照如下程序进行反应：a. 94℃预变性，加热5分钟；b. 94℃变性，加热30秒；c. 53.5℃退火，反应30秒；d. 72℃延伸，反应30秒；之后从b到d进行38个循环；f. 72℃再延伸反应5分钟，反应结束后跑琼脂糖凝胶电泳，根据条带数量和大小进行结果判定。

[0062] 我们通过解剖获得了性别确定的雄鸽子以及雌鸽子样品各30只。图4示的是雄鸽子和雌鸽子在解剖上的差异。

[0063] 本实施例分别用双蒸水、1×TE 缓冲液、pH=8.0的PBS缓冲液、1%SDS溶液、2.5M NaCl作为样品裂解液，其扩增结果如图5所示，结果表明：双蒸水以及1×TE 缓冲液处理的PCR扩增电泳结果有清晰可辨的条带，其他几种溶液没有扩增出明显条带；1×TE缓冲液扩增所得的溶液的条带质量较双蒸水处理好，所以选用TE缓冲液用作进一步试验。

[0064] 接下来选择0.25×TE，0.5×TE，1×TE，2×TE，4×TE，8×TE的缓冲液处理血液样，其扩增结果如图6所示，结果表明1×TE缓冲液具有较好的实验效果。

[0065] 本实施例还尝试用二甲基亚枫（DMSO），结果如图7所示，由此可知二甲基亚砜在从0.25%到8%浓度条件下都能够取得较理想的扩增效果，同时可以确定2%浓度的DMSO作为裂解液最优浓度，用2%浓度的DMSO作为裂解液，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2作为引物，分别用
30只雄鸽和雌鸽验证，结果如图8和9。

[0066] 图8A中，30只雌鸽子的血液样经2% DMSO处理的结果显示，所有的样品都扩增出了清晰明显的两条条带，与图8B中30只雄鸽子扩增出的一条条带对比明显，且条带的长度均符合预期，由此可以认为2% DMSO处理血液样品PCR扩增进行性别鉴定的结果具有准确率百分之百且重复性良好的特点。

[0067] 实施例3 裂解液筛选实验（羽毛样）

[0068] 鸽子羽毛中富含蛋白成分，这给有效地扩增带来很大的难度；我们前期摸索了多种羽毛样裂解液，其中，以PBS缓冲液作为羽毛样裂解液具有很大的可行性，其扩增结果如图9。

[0069] 接下来实验PBS缓冲液的浓度为扩增结果的影响，结果如图10，最终确定1×PBS作为鸽子羽毛样的裂解液。用1×PBS作为裂解液，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2作为引物，分别用30只雄鸽和雌鸽验证，结果如图11和12。

[0070] 由图11和图12我们可以知道，使用1×PBS处理羽毛样品之后经过PCR反应，琼脂糖凝胶电泳，可以扩增出分辨性别的条带。不过，图12中的部分样品的电泳图显示有比较明显的拖带，这可能是由于鸽子羽毛中含有更复杂的成分，以及由于贮藏的时间过久，样品有一定程度上的变质。但是并不影响我们分辨待测样品的性别。同理，在图13中的母鸽样品中，存在有部分未能扩增出474bp条带的样品，这是由于样品的DNA浓度低，优先扩增了较短的片段。在实际操作中。可以直接认定扩增出319bp条带的待测样品即为雌性，故上述结果均可以有效的鉴别鸽子性别。

[0071] 实施例4 试剂盒的组装

[0072] 所述用于鉴定鸽子性别的试剂盒包含PCR反应液（如PermixTaqTM，）、裂解液1、裂解液2以及SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所述引物，其中，裂解液1为血液样的裂解液（DMSO、1×TE缓冲液或者双蒸水），裂解液2为羽毛样的裂解液（1×PBS缓冲液）。

[0073] 所述试剂盒的PCR反应体系为：2微升裂解后的样品作为PCR反应的模板，10微升PermixTaqTM，、6微升的双蒸水以及SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所述引物10μM各1微升，总体积为20微升。

[0074] 所述裂解后的样品通过以下方法得到的：

[0075] 静脉血液样处理方法：前期用移液器取血液5 微升，按照1：30的体积比稀释到含有血液样裂解液的A管中。

[0076] 羽毛毛囊中血液样处理方法：将新采摘的羽毛沿毛羽向毛球按压，可以收集10微升甚至更多的新鲜血液，加入150微升血液样裂解液。

[0077] 羽毛样处理方法：将收集的羽毛沿根部剪下3～4 毫米，置于含有150 微升羽毛样裂解液的B管中，室温放置2分钟。

[0078] 所述试剂盒的PCR反应条件为：a. 94℃预变性，加热5分钟；b. 94℃变性，加热30秒；c. 53.5℃退火，反应30秒；d. 72℃延伸，反应30秒；之后从b到d进行38个循环；f. 72℃再延伸反应5分钟。