生何首乌的HPLC指纹图谱检测方法

摘要

本发明公开了生何首乌的HPLC指纹图谱检测方法，它包括以下步骤：(1)对照品溶液的制备；(2)参照物溶液的制备：(3)对照指纹图谱的建立：(4)供试品溶液的制备；(5)供试品溶液的检测。本发明的指纹图谱出峰多，分离度良好，重复性好，精密度高，为全面监控生何首乌质量提供了有效保障。利用本发明指纹图谱检测方法的提取方法和色谱条件，还可以测得生何首乌中16种成分的含量，从而可以从更多的角度来控制生何首乌的质量。

权利要求

1.生何首乌的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：(1)对照品溶液的制备：取生何首乌药材，粉碎得药材粉末，40～60%乙醇水溶液提取，过滤，得生何首乌对照品溶液；

(2)参照物溶液的制备：取没食子酸、原花青素B1、儿茶素、没食子酸酯、芦荟大黄素苷、虎杖苷、二苯乙烯苷、土大黄苷、白藜芦醇、大黄素苷、大黄素甲醚苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚对照品适量，混合，加入甲醇，得到参照物溶液；

(3)对照指纹图谱的建立：

分别取参照物溶液和由不同批次生何首乌药材制备得到的对照品溶液，注入高效液相色谱仪检测，得到各批次药材和参照物的色谱数据；色谱条件如下：检测波长：254～275nm;

色谱柱：C18色谱柱和C18预柱；

流动相：流动相A为0 .1%甲酸水，流动相B为乙腈；

梯度洗脱程序如下：

对所得色谱数据进行处理，建立生何首乌的对照指纹图谱；

(4)供试品溶液的制备：取待测药材，按照步骤(1)相同的方法制备得到供试品溶液；

(5)按照步骤(3)相同的色谱条件，将供试品溶液注入高效液相色谱仪检测，将所得色谱图与对照指纹图诺进行比对，可鉴别出生何首乌。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述提取超声提取；所述乙醇浓度为50%。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述超声提取的时间为60min。

4.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述提取的温度是40℃。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述药材乙醇水溶液的重量体积比为1g：20mL。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述C18色谱柱为ZORBAX C18色谱柱，长度为250mm，内径为4.6mm，填料的粒径为5um；所述C18预柱为ZORBAX C18色谱柱，长度为

12 .5mm，内径为4.6mm，填料的粒径为5um。

7.根据权利要求1-3、5任一项所述的检测方法，其特征在于：所述色谱条件的柱温为30℃。

8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述色谱条件的柱温为30℃。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述色谱条件的流速为1.0mL／min。

10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述色谱条件的流速为1.0mL／min。

11.一种同时测定生何首乌中16种成分的方法，其特征在于：所述16种成分为没食子酸、原花青素B1、儿茶素、没食子酸酯、芦荟大黄素苷、虎杖苷、二苯乙烯苷、大黄苷、白藜芦醇、大黄素苷、大黄素甲醚苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、和大黄素甲醚；

它包括以下步骤：

a、16种成分标准曲线的建立：

取16种成分混合对照品溶液，按照权利要求1-10任一项检测方法中步骤(3)相同的色谱条件检测，得到16种成分各自的标准曲线；

b、取生何首乌药材，按照权利要求1-10任一项检测方法中步骤(1)相同的方法，制备得到供试品溶液，注入高效液相色谱，以步骤a相同的色谱条件检测，根据步骤a的标准曲线得到生何首乌中16种成分的含量。

说明书

生何首乌的HPLC指纹图谱检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及药物质量控制方法技术领域，尤其涉及生何首乌的HPLC指纹图谱检测方法。

背景技术

[0002] 何首乌为蓼科植物何首乌(Polygonum Multiflorum Thunb.)的干燥块根，其性平，味甘、苦，归心、肝、大肠经，具有解毒、消痈、截疟、润肠通便的功效；为常用中药。其在全国各地分布广泛，主产于河南、湖北、广西、广东、贵州、四川等地。

[0003] 何首乌中的二苯乙烯苷类和蒽醌类成分为其代表性活性成分。其中，二苯乙烯苷具有显著的神经保护作用；蒽醌类成分具有抗炎、抗病原微生物、抗肿瘤、利尿、保肝等作用，其中大黄素具有抗炎、抗病原微生物、抗肿瘤、利尿、保肝等作用，大黄素-8-β-o-吡喃葡萄糖苷则具有益智活性。

[0004] 目前《中国药典》2015年版何首乌项下采用紫外-可见光分光光度法对何首乌的2,3,5,4-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和大黄素含量进行了测定，以测定结果建立了质量标准。

[0005] 然而，考虑到中药材的成分繁多，且各个成分间容易相互影响，仅以一两个有效成分的含量难以全面评价中药的真实质量。因此，目前需要一种可以监控生何首乌中多个成分的检测方法，以更加全面地监控生何首乌的质量状况。

发明内容

[0006] 为解决上述问题，本发明提供了一种生何首乌的HPLC指纹图谱检测方法，它包括以下步骤：

[0007] 生何首乌的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：

[0008] (1)对照品溶液的制备：取生何首乌药材，粉碎得药材粉末，40～60％乙醇水溶液提取，过滤，得生何首乌对照品溶液；优选的乙醇浓度为50％；

[0009] (2)参照物溶液的制备：取没食子酸、原花青素B1、儿茶素、没食子酸酯、芦荟大黄素苷、虎杖苷、二苯乙烯苷、土大黄苷、白藜芦醇、大黄素苷、大黄素甲醚苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚对照品适量，混合，加入甲醇，得到参照物溶液；

[0010] (3)对照指纹图谱的建立：

[0011] 分别取参照物溶液和由不同批次生何首乌药材制备得到的对照品溶液，注入高效液相色谱仪检测，得到各批次药材和参照物的色谱数据；色谱条件如下：

[0012] 检测波长：254～275nm；

[0013] 色谱柱：C18色谱柱和C18预柱；

[0014] 流动相：流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为乙腈；

[0015] 梯度洗脱程序如下：

[0016]

[0017] 对所得色谱数据进行处理，建立生何首乌的对照指纹图谱；

[0018] (4)供试品溶液的制备：取待测药材，按照步骤(1)相同的方法制备得到供试品溶液；

[0019] (5)按照步骤(3)相同的色谱条件，将供试品溶液注入高效液相色谱仪检测，将所得色谱图与对照指纹图谱进行比对，可鉴别出生何首乌及其质量状况。

[0020] 进一步地，步骤(1)中，所述提取超声提取。

[0021] 进一步地，所述超声提取的时间为60min。

[0022] 进一步地，步骤(1)中，所述提取的温度是40℃。

[0023] 进一步地，步骤(1)中，所述药材乙醇水溶液的重量体积比为1g:20mL。

[0024] 进一步地，所述C18色谱柱为ZORBAX C18色谱柱，长度为250mm，内径为4.6mm，填料的粒径为5μm；所述C18预柱为ZORBAX C18色谱柱，长度为12.5mm，内径为4.6mm，填料的粒径为5μm.。

[0025] 进一步地，所述色谱条件的柱温为30℃。

[0026] 进一步地，所述色谱条件的流速为1.0mL/min。

[0027] 进一步地，所述对照指纹图谱如图5所示。

[0028] 本发明还提供了一种同时测定生何首乌中16种成分的方法，所述16种成分为没食子酸、原花青素B1、儿茶素、没食子酸酯、芦荟大黄素苷、虎杖苷、二苯乙烯苷、大黄苷、白藜芦醇、大黄素苷、大黄素甲醚苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、和大黄素甲醚；

[0029] 它包括以下步骤：

[0030] a、16种成分标准曲线的建立：

[0031] 取16种成分混合对照品溶液，按照前述检测方法中步骤(3)相同的色谱条件检测，得到16种成分各自的标准曲线；

[0032] b、取生何首乌药材，按照前述检测方法中步骤(1)相同的方法，制备得到供试品溶液，注入高效液相色谱，以步骤a相同的色谱条件检测，根据步骤a的标准曲线得到生何首乌中16种成分的含量。

[0033] 本发明的指纹图谱出峰多、分离度良好、重复性好、精密度高，为全面监控生何首乌的材质量提供了有效的保障。

[0034] 同时，利用本发明指纹图谱检测方法的提取方法和色谱条件，还可以同时测得生何首乌中16种成分—没食子酸、原花青素B1、儿茶素、没食子酸酯、芦荟大黄素苷、虎杖苷、二苯乙烯苷、土大黄苷、白藜芦醇、大黄素苷、大黄素甲醚苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚的含量，从而可以从更多的角度监控生何首乌的药材质量。

[0035] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

[0036] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

[0037] 图1为生何首乌不同梯度洗脱程序的指纹图谱(A-F)。

[0038] 图2为生首乌不同温度条件下超声60min的指纹图谱(A-D)。

[0039] 图3为生首乌不同超声提取时间下的指纹图谱(A-E)。

[0040] 图4为何首乌16个成分的标准品图谱：1：没食子酸，2：原花青素B1，3：儿茶素，4：没食子酸酯，5：芦荟大黄苷，6：虎杖苷，7：二苯乙烯苷，8：土大黄苷，9：白藜芦醇，10：大黄素苷，11：大黄素甲醚苷，12：芦荟大黄素，13：大黄酸，14：大黄素，15：大黄酚，16：大黄素甲醚。

[0041] 图5为何首乌的对照指纹图谱

[0042] 图6为25批市售生首乌的指纹图谱。

具体实施方式

[0043] 试药

[0044] 没食子酸(批号：150226)；原花青素B1(批号：140628)；儿茶素(批号：141224)；没食子酸酯(批号：140730)；芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(简称：芦荟大黄素苷，批号：141225)；虎杖苷(批号：141228)；2,3,5,4-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(简称：二苯乙烯苷，批号：141121)；土大黄苷(批号：141209)；白藜芦醇(批号：150122)；大黄素-8-β-O-吡喃葡萄糖苷(简称：大黄素苷，批号：141209)；大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷(简称：大黄素甲醚苷，批号：150120)；大黄酚(批号：140325)均购置于成都克洛玛生物有限公司。芦荟大黄素(批号：MUST-10112301)；大黄酸(批号：MUST-11032801)；大黄素(批号：MUST-
12022715)；大黄素甲醚(批号：MUST-12022005)均购置于曼斯特生物科技有限公司。

[0045] 药材

[0046] 25批生何首乌药材经成都中医药大学生药鉴定室鉴定为蓼科植物Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根。何首乌药材样品来源见表1。

[0047] 表1何首乌药材样品

[0048]

[0049] 实验仪器

[0050] Agilent 1260高效液相色谱仪器(泵G1312B，DEACB07224；进样器G1329B，DEAAC25245；柱温箱G1316A，DEACN27098；紫外检测器G4212BDEAA307363)；KQ-500DB超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；11D型电子分析天平(Sartorius公司)；BP-2Vortex-Genie 2涡旋振荡器(Scientific Industries，美国)；TG16-WS型台式高速离心机(湘仪离心机有限公司)；隔膜真空泵(天津市津腾实验设备有限公司)。

[0051] 实验试剂

[0052] 无水乙醇(批号：20120306)购置于成都临江化工。甲酸、乙腈、水均为色谱级，购于Fisher公司，其他试剂均为分析纯。

[0053] 实施例1实验条件的筛选

[0054] 1.流动相条件筛选

[0055] 生何首乌同一样本进样条件下，分别将0.1％甲酸水和乙腈作为洗脱流动相的A泵和B泵，以A和B不同时间段的不同体积比例(v/v)进行梯度洗脱条件筛选，梯度洗脱程序见表2，得到对应的生何首乌指纹图谱见图1(A-F)，由图1可知，图1A基本未能分开；图1B、C、D中部分时间点图谱未能分开；图1E中部分时间段基线漂移严重，图1F中呈现出各成分良好的分离，基线基本平稳，因此将该梯度洗脱条件设为生何首乌的指纹谱图分析条件。

[0056] 表2梯度洗脱时间(T)变化以及水相(A泵)比例变化

[0057]

[0058] 2.生首乌提取时温度筛选

[0059] 取相同质量的生何首乌样本4份，加入20倍质量的50％乙醇水，浸泡30min后，分别在20℃、40℃、60℃、80℃条件下超声60min，过滤后进样，在筛选好的梯度洗脱程序下建立不同提取温度的生首乌的指纹图谱，见图2(A-D)。记录各温度下的二苯乙烯苷、大黄素苷、大黄素甲醚苷以大黄素峰面积，以这4种成分封面积的变化为筛选条件，得到表3。结合图2和表3可知40℃条件下，4种成分的峰面积均最大，提示该条件下得到的成分含量最高，因此设置提取温度为40℃。

[0060] 表3不同温度条件下超声60min得到4种成分的峰面积

[0061]

[0062] 3.生首乌提取时间筛选

[0063] 取相同质量的生何首乌样本5份，加入20倍质量的50％乙醇水，浸泡30min后，在筛选得到的40℃条件下超声10min、20min、40min、60min以及80min，过滤后进样，在筛选好的梯度洗脱程序下建立不同提取温度的生首乌的指纹图谱，见图4(A-E)。记录各温度下的二苯乙烯苷、大黄素苷、大黄素甲醚苷以大黄素峰面积，以这4种成分封面积的变化为筛选条件，得到表4。结合图4和表4可知随着时间延长，各成分的峰面积增加，60min时的峰面积达到最大，不再随时间的增加而增加，提示超声60min即可得到的成分含量最高，因此设置提取温度为40℃，超声时间为60min。

[0064] 表4 40℃条件下超声不同时间得到4种成分的峰面积

[0065]

[0066] 实施例2本发明的方法及其方法学验证

[0067] 1样品溶液的制备

[0068] 将25批市售生首乌分别打成粗粉备用。精密称取各粗粉0.25g，置具塞三角瓶中，加20倍量50％乙醇水溶液，浸泡30min后，40℃下超声提取60min，定容到5mL。0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液进样。

[0069] 2.2对照品溶液的制备

[0070] 精密称取对照品没食子酸、原花青素B1、儿茶素、没食子酸酯、芦荟大黄素苷、虎杖苷、二苯乙烯苷、土大黄苷、白藜芦醇、大黄素苷、大黄素甲醚苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚对照品于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，配置成浓度分别为131、98、185、142、78、125、5400、142、94、750、86、71、81、500、25、88μg/mL的储备液，4℃贮存备用。

[0071] 2.3色谱条件

[0072] 色谱柱ZORBAX C18(4.6mm*250mm，5μm)，预柱ZORBAX C18(4.6mm*12.5mm，5μm)；流速1.0mL/min，柱温30℃，进样量5μL，梯度洗脱A为0.1％甲酸水，B为乙腈，流动相系统配比见表5。

[0073] 表5梯度洗脱条件

[0074]

[0075] 2.4指纹图谱的建立

[0076] 采用国家药典委员会推荐的中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件A版进行各个炮制时间样品的相似度分析。

[0077] 3实验结果

[0078] 图4为生何首乌中16种成分的标准品的液相色谱图。

[0079] 3.1方法学考察

[0080] 3.1.1精密度

[0081] 制备浓度依次为低、中、高3个浓度的没食子酸、原花青素B1，儿茶素、没食子酸酯、芦荟大黄素苷、虎杖苷、二苯乙烯苷、土大黄苷、白藜芦醇、大黄素苷、大黄素甲醚苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚质控样品，每个浓度平行3份，按照“2.3”项下色谱条件进行分析。考察日内精密度、连续3天的日间精密度，测定峰面积并计算各成分的RSD％值，见表6。

[0082] 表6何首乌各成分的日内以及日间精密度

[0083]

[0084] 由表6可知，没食子酸、原花青素B1，儿茶素、没食子酸酯、芦荟大黄素苷、虎杖苷、二苯乙烯苷、土大黄苷、白藜芦醇、大黄素苷、大黄素甲醚苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚各成分的日内以及日间精密度RSD％均小于6.00％，方法精密度良好。

[0085] 3.1.2重现性

[0086] 取同一批生首乌药材6份，按照“2.1”项下供试品溶液制备方法制备，以“2.3”项下色谱条件进行测定，测定6份样品中各成分没食子酸、原花青素B1，儿茶素、没食子酸酯、芦荟大黄素苷、虎杖苷、二苯乙烯苷、土大黄苷、白藜芦醇、大黄素苷、大黄素甲醚苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚的峰面积，标准曲线计算各成分的浓度，计算其RSD％，见表7。

[0087] 3.1.3稳定性

[0088] 取同一批生首乌药材，按照“2.1”项下供试品溶液制备方法制备，以“2.3”项下色谱条件进行测定，分别在0、3、6、9、12以及24h进样，测定样品中没食子酸、原花青素B1、儿茶素、没食子酸酯、芦荟大黄素苷、虎杖苷、二苯乙烯苷、土大黄苷、白藜芦醇、大黄素糖苷、大黄素甲醚苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚的峰面积，标准曲线计算各成分的浓度，计算RSD％，见表7。

[0089] 表7何首乌各成分的重现性、稳定性考察

[0090]

[0091] 由表7可知，何首乌各成分，RSD％值均小于2.00％，符合2015版药典规定，表明在该提取方法条件下各成分的重现性好，样品在12h分析时间内稳定性好。

[0092] 3.1.4回收率

[0093] 取已知含量的同一批生首乌药材，分成2份，一份加入等体积的50％乙醇稀释成原有浓度的50％，未稀释的另一份加入已知且相近浓度的没食子酸、原花青素B1，儿茶素、没食子酸酯、芦荟大黄素苷、虎杖苷、二苯乙烯苷、土大黄苷、白藜芦醇、大黄素苷、大黄素甲醚苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚的等体积，HPLC测定稀释后的样品中各成分的浓度以及等体积加入对照品后各成分的的峰面积，代入标准曲线进行计算，采用C％＝C样+标-C样/C标*100％，计算公式计算各成分的回收率％，何首乌各成分的回收率均在90％～110％之间，回收率较高，结果见表8。

[0094] 表8何首乌各成分的回收率考察

[0095]

[0096] 由表8可知，何首乌各成分回收率值均在90.00％～120.00％之间，表明在该分析方法条件具有较好的回收率。

[0097] 3.1.5何首乌各成分标准曲线制备

[0098] 没食子酸、原花青素B1，儿茶素、没食子酸酯、芦荟大黄素-苷、虎杖苷、二苯乙烯苷、土大黄苷、白藜芦醇、大黄素苷、大黄素甲醚苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚储备液进行梯度稀释，得到一系列浓度的标准溶液，按“2.3”项下的液相条件对各成分的峰面积进行测定，得到各成分的标准曲线见表9。

[0099] 表9何首乌各成分的标准曲线及线性范围

[0100]

[0101] 3.2 25批市售生首乌成分的含量测定

[0102] 25批市售生首乌按“2.1”项下进行样品的制备，以“2.3”项下色谱条件进样测定。每个各样品重复测定3次，以均值得到样品中没食子酸、原花青素B1，儿茶素、没食子酸酯、芦荟大黄素苷、虎杖苷、二苯乙烯苷、土大黄苷、白藜芦醇、大黄素苷、大黄素甲醚苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚的含量，结果见表10。

[0103]

[0104]

[0105]

[0106] 3.3指纹图谱相似度计算

[0107] 经实验得到25批何市售生首乌的指纹图谱，将25批何首乌药材样品指纹图谱的AIA格式数据文件导入中药指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A版)，进行相似度计算，以各成分含量均较高的大巴山(编号：S5)产地为指纹图谱为参照图谱，采用中位数法，时间窗宽度为0.1min，采用多点校正匹配，获得生何首乌对照指纹图谱，见图5，计算机辅助相似度评价报告结果见表1。25批何首乌药材样品的指纹图谱见图6.

[0108] 表11 25批市售生首乌相似度计算结果

[0109]

[0110] 通过中药指纹图谱的评价系统建立起来的对照指纹图谱与样品指纹图谱整体性(保留时间和峰面积)进行相似性比较，从而对中药质量进行评价和控制，从而得出一致性和差异性。相似度一般在0.85～1.0之间认为符合要求。从图6可以大致看出各成分在一定的保留时间误差范围内(0.1min)的都能与生成的对照指纹图谱有较好的重叠，相似度介于0.95～0.99之间，而1和13号药材相似度介于0.45～0.70之间，以相似度大于0.85作为判定何首乌药材合格与否的限度，则1和13号药材判定为不合格生首乌样本。

[0111] 综上试验结果可以看出，本发明的指纹图谱出峰多、分离度良好、重复性好、精密度高，为全面监控生何首乌的材质量提供了有效的保障。

[0112] 同时，利用本发明指纹图谱检测方法的提取方法和色谱条件，还可以同时测得生何首乌中16种成分——没食子酸、原花青素B1、儿茶素、没食子酸酯、芦荟大黄素苷、虎杖苷、二苯乙烯苷、土大黄苷、白藜芦醇、大黄素苷、大黄素甲醚苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚的含量，从而可以从更多的角度监控生何首乌的药材质量。