一种杂交乌鳢精子保存液及其应用转让专利
申请号 : CN201610353178.3
文献号 : CN105941391B
文献日 : 2018-11-09
发明人 : 汤保贵 , 何飞飞 , 陈刚 , 张健东
申请人 : 广东海洋大学
摘要 :
本发明提供了一种杂交乌鳢精子保存液，以水为溶剂，每1L保存液中含有以下组分：7.5~8.5g的氯化钠、0.4~0.5g氯化钾、0.1~0.15g氯化钙、0.2~0.6g碳酸氢钠、8~15g葡萄糖，余量为水。本发明提供的杂交乌鳢精子保存液来源简单，操作简便易行，保存采用常规的低温即可，经过保存液保存的精子激活后，保存寿命长，激活率高，精子活力好，为杂交乌鳢的精子保存和生产繁殖提供了保证，具备较好的应用前景。
权利要求 :
1.一种杂交乌鳢精子保存液，其特征在于，1L保存液中含有以下组分：8.2g的氯化钠、
0.47g氯化钾、0.128g氯化钙、0.4g碳酸氢钠 、10g葡萄糖，余量为水；
所述保存液的渗透压为343 mOsm/kg，pH值为7.4。
2.权利要求1所述的保存液在杂交乌鳢精子保存中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将杂交乌鳢精子和所述保存液按照1:9的配比进行稀释，并置于4℃下保存。
说明书 :
一种杂交乌鳢精子保存液及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于鱼类养殖技术领域，更具体地，涉及一种杂交乌鳢精子保存液及其应用。
背景技术
[0002] 杂交乌鳢在分类学上属于鲈形目、鳢亚目、鳢科、鳢属，广东俗称生鱼，是淡水凶猛肉食性鱼类。杂交乌鳢味道鲜美、营养丰富，广受市场欢迎。近年来，市场上主要养殖的品种是乌鳢（♂）与同属的斑鳢（♀）杂交产生的杂交鳢。乌鳢、斑鳢均是分批产卵鱼类，在杂交鳢繁殖过程中，经常面临雌、雄鱼性成熟不同步或者雌性成熟度不足的现象。为了避免精子浪费，对精子进行低温保存，十分必要。一般来说，用液氮进行超低温保存，精子保存时间更长、活力更强。但是对于大多数水产种苗企业来说，获得与贮存液氮不太方便，而且精子超低温保存时对冷冻、复苏程序与相关参数等方面技术要求较高，不易掌握。相对而言，常规低温（4℃）保存只需要普通冰箱，在生产实践上更具有操作意义。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于根据现有鱼类精子保存技术中的不足，提供了一种杂交乌鳢精子保存液。
[0004] 本发明的另一目的在于提供上述保存液在杂交乌鳢精子保存中的应用。
[0005] 根据本发明提供的保存液可以较好地解决乌鳢雄鱼与本种或同属雌鱼人工繁殖时，性腺发育不同步的问题，以及在生产中面临的精子快速失活的问题。
[0006] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：
[0007] 本发明提供了一种杂交乌鳢精子保存液，以水为溶剂，每1L保存液中含有以下组分：7.5 8.5g的氯化钠、0.4 0.5g氯化钾、0.1 0.15g氯化钙、0.2 0.6g碳酸氢钠 、8 15g葡~ ~ ~ ~ ~萄糖，余量为水。
[0008] 优选地，1L保存液中含有以下组分：8.2g的氯化钠、0.47g氯化钾、0.128g氯化钙、0.4g碳酸氢钠 、10g葡萄糖，余量为水；
[0009] 所述保存液的渗透压为343 mOsm/kg，pH值为7.4。
[0010] 将杂交乌鳢精子和所述保存液按照1：9的配比进行稀释，并置于4℃下保存。保存96h后精子平均快速运动时间为177.4秒，总寿命为206.3秒，激活率为94.7%；保存120h后精子平均快速运动时间为141.2秒，总寿命为158.4秒，激活率为82.5%。
[0011] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0012] 本发明提供的杂交乌鳢精子保存液来源简单，操作简便易行，保存采用常规的低温即可，经过保存液保存的精子激活后，保存寿命长，激活率高，精子活力好，为杂交乌鳢的精子保存和生产繁殖提供了保证，具备较好的应用前景。
具体实施方式
[0013] 以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0014] 除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0015] 实施例1：
[0016] 准确称取氯化钠8.2g、氯化钾0.47g、氯化钙0.128g、碳酸氢钠0.4g、葡萄糖10g，溶解于1升蒸馏水中，配制成精子保存液（总渗透压为343 mOsm/kg，pH值为7.4）。
[0017] 实施例2：
[0018] 准确称取氯化钠8.5g、氯化钾0.5g、氯化钙0.15g、碳酸氢钠0.6g、葡萄糖14g，溶解于1升蒸馏水中，配制成精子保存液（总渗透压为380mOsm/kg，调pH值至7.4）。
[0019] 对比例1：
[0020] 准确称取碳酸氢钾 10g、磷酸二氢钠10g、蔗糖42.7g、还原型谷胱甘肽 2g、（总渗透压为664mOsm/kg，调pH值至7.4）。溶解于1升蒸馏水中，配制成精子保存液。
[0021] 对比例2：
[0022] 准确称取氯化钠6.6g、氯化钾0.15g、氯化钙0.15g、碳酸氢钠0.2g、磷酸二氢钠0.1g，溶解于1升蒸馏水中，配制成精子保存液。（总渗透压为242mOsm/kg，调pH值至7.4）。
[0023] 对比例3：
[0024] 准确称取氯化钠7.5g、氯化钾0.2g、氯化钙0.2g、碳酸氢钠10.2g，溶解于1升蒸馏水中，配制成精子保存液。（总渗透压为272mOsm/kg，调pH值至7.4）。
[0025] 实施例3:精子活力测定
[0026] 将杂交乌鳢精子和保存液按照1：9的配比进行稀释，并置于4℃下保存。精子在4℃下保存液中保存96小时后，测定其活力与运动时间。
[0027] 实施例和对比例中精子活力测定：在普通载玻片上滴加0.5ml稀释后精液，加入0.5ml水激活，立即在10×16倍显微镜下观察其活力。结果见表1所示：
[0028] 表1
[0029] 快速运动时间（s） 总寿命（s） 激活率（%）
实施例1 177.4 206.3 94.7
实施例2 152.7 189.4 90.4
对比例1 127.3 140.2 83.7
对比例2 135.6 167.8 85.9
对比例3 110.8 130.5 81.4
实施例1 177.4 206.3 94.7
实施例2 152.7 189.4 90.4
对比例1 127.3 140.2 83.7
对比例2 135.6 167.8 85.9
对比例3 110.8 130.5 81.4
[0030] 从表1中结果可以看出，实施例1中配方的精子保存液对精子保存效果最好。
[0031] 同时我们在保存120h后，继续进行实施例1中精子保存液的精子活力测定：保存120h后精子平均快速运动时间为141.2秒，总寿命为158.4秒，激活率为82.5%。
[0032] 实施例4：
[0033] 1、将已经达到性成熟的雄性杂交乌鳢体表擦拭干净，剖开腹部，取出精巢，并小心地用镊子将表面脂肪剔除，在洁净天平上称重。
[0034] 将精巢置于洁净的石英研钵中，用剪刀将其剪碎、研磨，分批缓缓加入1 49倍体积~的实施例1中精子保存液（具体见表2所示），再用80目纱绢过滤至洁净烧杯中，然后分装于离心管，置于4℃冰箱保存备用。
[0035] 2、保存效果评价
[0036] 精子数目测定：将常规低温保存的稀释精液取出，置于室温下。取0.2ml精液置于生物计数板计数框内，在40×16倍光学显微镜下观察，选取16个大框中的8个记录其精子数。经计算，保存96h后，精子数目为13.9×109个/ml，占鲜精的92%；保存120h后，精子数目为11.9×109个/ml，占鲜精的79%。
[0037] 同时，我们还检测了精子在保存液中不同稀释比例下12h的活力，结果见表2：
[0038] 表2
[0039]稀释比例 快速运动时间(RMT) 寿命(LS)sec 激活率(AR)%
对照组 147.36±1.11 175.42±0.97 87.45±2.09
1:1 141.61±1.63 167.36±1.51 80.89±0.42
1:4 144.56±2.95 175.19±1.09 82.50±0.53
1:9 178.91±1.86 209.20±2.14 94.82±0.22
1:19 166.72±0.93 196.73±1.15 89.08±0.45
1:49 162.33±2.21 188.65±2.48 87.92±0.20
对照组 147.36±1.11 175.42±0.97 87.45±2.09
1:1 141.61±1.63 167.36±1.51 80.89±0.42
1:4 144.56±2.95 175.19±1.09 82.50±0.53
1:9 178.91±1.86 209.20±2.14 94.82±0.22
1:19 166.72±0.93 196.73±1.15 89.08±0.45
1:49 162.33±2.21 188.65±2.48 87.92±0.20
[0040] 注：对照组为不添加保存液。
[0041] 结果显示：稀释比例为1:9时，保存效果最好。