一种3‑氢化松苓酸氰乙酯类药物及其应用

摘要

本发明公开了一种3‑氢化松苓酸氰乙酯类药物及其应用。该类药物中含有以下结构式的化合物：还包括药学上可接受的盐，3‑氢化松苓酸氰乙酯及其衍生物药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料或载体。3‑氢化松苓酸氰乙酯是PI3K/mTOR双重抑制剂，本发明还涉及3‑氢化松苓酸氰乙酯类药物在促进细胞自噬中的用途；以及在制备治疗胃癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、鼻咽癌等肿瘤、阿尔茨海默氏病等神经退行性病变、糖尿病药物中的应用。本发明中的3‑氢化松苓酸氰乙酯类药物为临床提供了一种新的用药选择。

权利要求

1.一种3-氢化松苓酸氰乙酯类药物，其特征在于，该类药物中含有以下结构式的化合物：

2.根据权利要求1所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物，其特征在于：该类类药物还包括药学上可接受的盐，3-氢化松苓酸氰乙酯及其衍生物药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料或载体。

3.根据权利要求1所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物，其特征在于：3-氢化松苓酸氰乙酯的合成方法为：

1)在反应瓶中加入等摩尔的3-氢化松苓酸B、溴乙腈、碳酸钾，并加入适量乙腈作为溶剂，在85℃搅拌反应2h，TCL检测反应完成后，旋干溶剂，加入水和乙酸乙酯，分离萃取三次，回收乙酸乙酯，得固体物；

2)将固体物固法上样，200-300目正相硅胶柱层析分离，以石油醚：乙酸乙酯体积比＝

15:1为流动相，得白色固体粉末为3-氢化松苓酸氰乙酯。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物在促进细胞自噬中的用途。

5.根据权利要求1-3任意一项所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物在促进细胞自噬中的用途，其特征在于：3-氢化松苓酸氰乙酯是PI3K/mTOR双重抑制剂。

6.根据权利要求1-3任意一项所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物在制备治疗胃癌、肝癌、肺癌、前列腺癌或鼻咽癌药物方面的应用。

7.根据权利要求1-3任意一项所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物在制备治疗神经退行性病变药物方面的应用。

8.根据权利要求1-3任意一项所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物在制备治疗阿尔茨海默氏病药物方面的应用。

9.根据权利要求1-3任意一项所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物在制备治疗糖尿病药物方面的应用。

说明书

一种3-氢化松苓酸氰乙酯类药物及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及3-氢化松苓酸氰乙酯类药物及其应用，其作为PI3K/mTOR双重抑制剂对促进细胞自噬能够产生药理作用，可将3-氢化松苓酸氰乙酯类药物用于制备治疗胃癌等癌症、阿尔茨海默氏病类神经退性行病变或糖尿病的药物上。

背景技术

[0002] 3-氢化松苓酸氰乙酯是以三氢化松苓酸B的原料进行合成的酯类化合物，现有技术的缺陷是三氢化松苓酸B的纯化以及3-氢化松苓酸氰乙酯的分离纯化工艺。

发明内容

[0003] 本发明的目的提供一种3-氢化松苓酸氰乙酯类药物及其应用。

[0004] 为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种3-氢化松苓酸氰乙酯类药物，该类药物中含有以下结构式的化合物：

[0005]

[0006] 该类药物还包括药学上可接受的盐，3-氢化松苓酸氰乙酯及其衍生物药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料或载体。

[0007] 其中，3-氢化松苓酸氰乙酯的合成方法为：

[0008] 1)在反应瓶中加入等摩尔的3-氢化松苓酸B、溴乙腈、碳酸钾，并加入适量乙腈作为溶剂，在85℃搅拌反应2h，TCL检测反应完成后，旋干溶剂，加入水和乙酸乙酯，分离萃取三次，回收乙酸乙酯，得固体物；

[0009] 2)将固体物固法上样，200-300目正相硅胶柱层析分离，以石油醚：乙酸乙酯＝15:1(体积比)为流动相，得白色固体粉末为3-氢化松苓酸氰乙酯。其反应式如下。

[0010]

[0011] 本发明还涉及所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物在促进细胞自噬中的用途。

[0012] 本发明还涉及所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物在促进细胞自噬中的用途，其特征在于：3-氢化松苓酸氰乙酯是PI3K/mTOR双重抑制剂。

[0013] 本发明还涉及所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物在制备治疗胃癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、鼻咽癌等肿瘤药物方面的应用。

[0014] 本发明还涉及所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物在制备治疗神经退行性病变药物方面的应用。

[0015] 本发明还涉及所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物在制备治疗阿尔茨海默氏病药物方面的应用。

[0016] 本发明还涉及所述的3-氢化松苓酸氰乙酯类药物在制备治疗糖尿病药物方面的应用。

附图说明

[0017] 图1为3-氢化松苓酸氰乙酯结构鉴定氢谱图。

[0018] 图2为3-氢化松苓酸氰乙酯对HGC-27的细胞凋亡的影响(n＝3， )，其中A:对照组；B：3-氢化松苓酸氰乙酯(10μM)；C：3-氢化松苓酸氰乙酯(20μM)；D：3-氢化松苓酸氰乙酯(40μM)。

[0019] 图3为透射电镜检测3-氢化松苓酸氰乙酯对HGC-27细胞自噬的影响，其中a：对照组(×6000)，b/c：自噬泡(×6000)，d:自噬体亚显微结构(×15000)。

[0020] 图4为3-氢化松苓酸氰乙酯对HGC-27的细胞自噬比例的影响(n＝3， )，其中A:对照组；B：3-氢化松苓酸氰乙酯(10μM)；C：3-氢化松苓酸氰乙酯(20μM)；D：3-氢化松苓酸氰乙酯(40μM)。

[0021] 图5为3-氢化松苓酸氰乙酯和mTOR的分子对接结果图。

具体实施方式

[0022] 下面结合附图1-5、实施例及表格，进一步阐明本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求 书所限定的范围。

[0023] 实验材料：

[0024] 1、实验所用细胞株：人胃癌细胞株HGC-27，人肝癌细胞株HepG2，人肺癌细胞株A549，人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，人前列腺癌细胞株PC3，人鼻咽癌细胞株CNE-2，人结肠癌细胞株HT-29，正常胃粘膜细胞株GES-1，神经细胞母细胞瘤SH-SY5Y，购买于武汉大学中国典型培养物保藏中心，通过实验室传代保存细胞株。

[0025] 使用siRNA基因沉默方式产生人HT-29细胞株PTEN缺失型，该细胞通过实验室传代保存细胞株。

[0026] 2、实验所用试剂及仪器

[0027] 1)主要的实验试剂为：RPMI-1640培养基粉剂，美国Gibco公司产品；DMEM培养基粉剂，美国Gibco公司产品；无支原体新生胎牛血清，杭州四季青生物材料有限公司产品；3-(4,5)-二甲基噻唑-2-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)，美国Sigma公司产品；青霉素、链霉素，华北制药公司产品；HEPES，美国Amresco公司产品；胰蛋白酶，美国Amresco公司产品；二甲基亚砜(DMSO)，美国Amresco公司产品；细胞DNA含量检测试剂盒，凯基生物技术股份有限公司产品；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，凯基生物技术股份有限公司产品；AO，凯基生物技术股份有限公司产品；三羟甲基氨基甲烷(Tris)，美国Sigma公司产品；十二烷基磺酸钠(SDS)，美国Sigma公司产品；(5×)SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，碧云天生物技术研究所产品；SDS-PAGE凝胶迅速制胶试剂盒，碧云天生物技术研究所产品；BCA法蛋白定量试剂盒(加强型)，碧云天生物技术研究所产品；PVDF膜，碧云天生物技术研究所产品；ECL化学发光检测试剂盒，碧云天生物技术研究所产品；Western所用定影液及显影液，武汉谷歌生物科技有限公司产品；细胞总蛋白提取总试剂，武汉谷歌生物科技有限公司产品；Twee-20，武汉谷歌生物科技有限公司产品；p-PI3K-kinase p85αrabbit抗体(Tyr508,sc-12929)，Santa Cruz公司产品；p21rabbit抗体(C-19,sc-397)，Santa Cruz公司产品；p-P70S6K rabbit抗体(Thr389)，美国Cell Signaling公司产品；Beclin-1rabbit抗体(D40C5)，美国Cell Signaling公司产品；Cyclin D1rabbit抗体(92G2)，美国Cell Signaling公司产品；LC3A/B rabbit抗体(D3U4C)，美国Cell Signaling公司产品；p-mTOR rabbit抗体
(Ser4228)，美国Cell Signaling公司产品；β-Action一抗抗体，武汉博士得生物公司产品；
考马斯亮蓝：南京建成生物科技有限公司产品；辣根酶标记的山羊抗兔IgG，北京中杉金桥公司产品；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG，北京中杉金桥公司产品；胶片，柯达公司产品；脱脂奶粉，伊利集团产品；四氧嘧啶，Sigma公司产品；盐酸二甲双胍，北 京京丰制药有限公司产品；其他试剂均为市面所售的分析纯级别。健康雄性SD大鼠和昆明小鼠，购于三峡大学动物实验中心。

[0028] 2)主要的实验仪器为：96孔板和6孔板，购于美国Corning公司；立式压力蒸汽灭菌锅，购于日本HIRAYAMA公司；超纯水仪，购于艾科浦科技公司；Olympus KX41型倒置显微镜，购于美国Thermo公司；3111CO2培养箱，购于美国赛默飞世尔Thermo公司；电泳仪，购于北京市六一生物仪器公司；Stat Fax-2100型酶联免疫检测仪，购于美国Awareness公司；超净工作台，购于苏州净化设备厂；电子天平，购于上海民桥精密仪器有限公司；5415D微型台式高速离心机，购于德国Eppendof公司；微量移液器，购于德国Eppendof公司；-80℃的超低温冰箱，购于青岛海尔特种电器有限公司；脱色摇床STS-1型，购于海门市其林贝尔仪器制造有限公司；EPICS XL-4型流式细胞系统，购于英国Beckman Coulte公司；H-7500透射电子显微镜，购于日本日立公司；ULTRACUTR超薄切片机，购于德国奥地利莱卡公司；升恒温显影盒，购于福建三明市芝山照相器材公司；DB-3不锈钢电热板，购于金坛市富华仪器有限公司；电热恒温培养箱，购于武汉精华科教仪器有限公司；隔水式电热恒温培养箱，购于上海跃进医疗器械公司。

[0029] 3、所用试剂的配制：

[0030] 1)细胞所用普通试剂配制

[0031] RPMI-1640培养基：取购买的1640粉末包装一包，加入白色粉末HEPES 2g和分析纯的NaHCO3 2g，用800mL高压灭菌后的三蒸水溶解混匀，然后加入已配制好的5mL的100U/mL青霉素和链霉素，轻轻摇匀，等到彻底溶解之后，再定容到1000mL，使用0.22μm的微孔滤膜，进行真空过滤除菌，然后分装放在4℃冰箱保存，使用时再加入10％的新生胎牛血清。

[0032] DMEM培养基：取购买的DMEM粉末包装一包，加入白色粉末HEPES 2g和分析纯的NaHCO3 1.7g，然后其配制分装方法与RPMI-1640培养基配制操作步骤相同。

[0033] 磷酸缓冲溶液(PBS)：使用电子天平准确称取NaCl 4.00g，KH2PO4 0.10g，Na2HPO41.45g，KCl 0.10g，然后用储备的双蒸水450mL进行溶解，之后使用双蒸水定容到
500ml，放入高压灭菌锅中，在121℃的高温下灭菌30min，等到降温冷却之后，再放入4℃冰箱保存使用。

[0034] 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液：电子天平准确的称取0.25g的MTT粉剂，加入到50mL的PBS中，充分溶解，直至液体呈清澈的黄色，无沉淀出现。使用0.22μm的微孔滤膜，进行真空过滤除菌，分装好后放入4℃冰箱避光保存。

[0035] 胰酶溶液(0.25％)：先使用干净的称量纸称取胰酶1.00g，加入已经配制好的PBS中溶解，定容到400mL，使用0.22μm的滤膜，进行过滤除菌，然后分装，放在-20℃保存。

[0036] 柠檬酸铅溶液：精确称取0.133g的硝酸铅，0.176g的二水柠檬酸钠，加入到3mL的双蒸水中，用力振荡混匀，直至生成乳白色的柠檬酸铅悬浊液，再加入1N的氢氧化钠0.8mL，使溶液立刻透明，若不透明，应重新配制，最后定容到5mL。此溶液现配现用，应尽量减少与空气的接触。

[0037] AO溶液：准确称取0.5mg的AO粉末，在避光环境下加入500μL的PBS溶解完全，配制成初始浓度为1mg/mL的AO储备液，锡箔纸包好于4℃冰箱保存备用。

[0038] 2)Western blotting所用试剂配制

[0039] 30％的丙烯酰胺：使用干净的称量纸称取29g的丙烯酰胺和1g的甲-双叉丙烯酰胺。加入75mL的双蒸水混合，放在37℃的水浴锅中加热溶解，再定容到100mL，使用0.22μm孔径的滤膜过滤，放在棕色试剂瓶中冷藏避光保存。

[0040] 1.0mol/LTris-HCl(pH6.8)：称取12.11g的Tris溶解在大约45mL的双蒸水中，用45mL的1mol/LHCl调节pH到6.8，然后加双蒸水稀释定容到到100mL。进行过滤以后放在4℃冰箱里保存。

[0041] 1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)：称取18.15g的Tris溶解于大约45mL的双蒸水中，用45mL的1mol/L HCl调pH至8.8，加双蒸水稀释定容到100mL。进行过滤以后放在4℃冰箱里保存。注意的是，这两种缓冲液都必须使用Tris碱来制备，再用HCl调节相应的pH值。

[0042] 10％过硫酸铵(AP)：电子天平称取0.25g的过硫酸铵溶在2.5mL的双蒸水中，每500μL分装一管，然后放在-20℃冷冻保存。

[0043] 10％十二烷基磺酸钠(SDS)：在90mL的双蒸水中加入10g电泳型的SDS，然后在37℃水浴锅加热溶解，再加入双蒸水定容到100mL，分装后放在室温保存。

[0044] 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：称取7.55g的Tris base和47g的甘氨酸，加双蒸水400mL彻底溶解好后，再加入25mL的10％SDS，最后将溶液定容到500mL。

[0045] 5×TBS(pH8.0)：称取3.025g的tris base和21.925g的NaCl溶解在400mL的双蒸水中，待充分溶解之后，再用HCl调pH到8.0，最后定容到500mL。

[0046] 转膜缓冲液：准确称取甘氨酸14.4g，tris 2.42g，加入700mL的双蒸水彻底溶解，然后缓慢加入无水甲醇200mL，混匀后再加双蒸水定容到1000mL，封口保存，防止无水甲醇挥发。

[0047] TBST：向配制的TBS溶液中加入0.05％的Tween-20。

[0048] 封闭液：使用TBST溶液配制5％的脱脂奶粉，混合均匀。

[0049] 考莫斯亮蓝染色液：45mL的甲醇，45mL的双蒸水，10mL的冰醋酸，混合均匀后，加入0.25g的考马斯克亮蓝，充分溶解，放在棕色试剂瓶中保存。

[0050] 12％分离胶：双蒸水1.9mL，30％的丙烯酰胺3.5mL，3.42mL的1.5M Tris-HCl，0.09mL的10％SDS，0.09mL的10％AP，3.6μL的TEMED，总体积9mL。

[0051] 10％分离胶：双蒸水2.33mL，30％的丙烯酰胺3.07mL，3.42mL的1.5M Tris-HCl，0.09mL的10％SDS，0.09mL的10％AP，3.6μL的TEMED，总体积9mL。

[0052] 6％分离胶：双蒸水3.5mL，30％的丙烯酰胺1.9mL，3.42mL的1.5M Tris-HCl，0.09mL的10％SDS，0.09mL的10％AP，7.2μl的TEMED，总体积9mL。

[0053] 浓缩胶：双蒸水4.1mL，30％丙烯酰胺1mL，0.75mL的1.0M Tris-HCl，60μL的10％SDS，60μL的10％AP，6μL的TEMED，总体积6mL。

[0054] 0.02％叠氮钠：配制叠氮钠需佩戴手套和口罩，称取叠氮钠溶于PBS溶液中，然后放在4℃冰箱储存备用。

[0055] 实施例1：

[0056] 3-氢化松苓酸氰乙酯，其系统命名为：(2R)-2-((3S,10S,13R,14R,17R)-3-羟基-4,4,10,13,14-五甲基-2,3,4,5,6,7,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-
17-基)-6-甲基庚-5-烯酸氰甲酯；其结构式为：

[0057]

[0058] 3-氢化松苓酸氰乙酯的合成方法为：

[0059] 1)在反应瓶中加入等摩尔的3-氢化松苓酸B、溴乙腈、碳酸钾，并加入适量乙腈作为溶剂，在85℃搅拌反应2h，TCL检测反应完成后，旋干溶剂，加入水和乙酸乙酯，分离萃取三次，回收乙酸乙酯，得固体物；

[0060] 2)将固体物固法上样，200-300目正相硅胶柱层析分离，以石油醚：乙酸乙酯＝15:1(体积比)为流动相，得白色固体粉末为3-氢化松苓酸氰乙酯。

[0061] 得到的3-氢化松苓酸氰乙酯结构鉴定氢谱见图1。

[0062] 1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.72(3H,s),0.81(3H,s),0.88(3H,s),0.96(3H,s),1.02(3H,s),1.06-1,38(6H,m),1.58(3H,s),1.68(3H,s),1.53～1.88(8H,m)1.91-2.09
(9H,m),2.38 (1H,m),3.23(1H,dd,J＝4Hz,8Hz),4.71(2H,m),5.04(1H,m)。该化合物经核磁共振仪测试，在氢谱(1H-NMR)高场区出现δ0.72(3H,s),0.81(3H,s),0.88(3H,s),0.96(3H,s),1.02(3H,s),1.06-1,38(6H,m),1.58(3H,s),1.68(3H,s)的甲基质子信号峰，分别为3-氢化松苓酸氰乙酯中的七个甲基质子信号。在高场区δ1.5～2.2出现一系列的质子信号，推测为母核三氢化松苓酸B的质子信号。化学位移在δ2.38(1H,m)的质子信号，推测为双键的质子信号。化学位移在4.71(2H,m)的质子信号，推测为连接氰基的亚甲基的质子信号峰。化学位移在δ5.04(1H,m)的质子信号，推测3-氢化松苓酸氰乙酯中羟基的特征质子信号峰。由核磁氢谱数据分析可见，氰乙基与三氢化松苓酸B的羧基以酯键的型式结合成3-氢化松苓酸氰乙酯。

[0063] 3-氢化松苓酸氰乙酯储备液的配制：使用称量纸准确称取3-氢化松苓酸氰乙酯1.5mg，用移液枪准确加入DMSO漩涡震荡30s，最终制成10mM的3-氢化松苓酸氰乙酯初始浓度。使用时，再用含血清的培养基进行稀释即可。

[0064] 实施例2：

[0065] 一、在实施例1的基础上，将所得到的3-氢化松苓酸氰乙酯进行具体的实验，具体方法如下：

[0066] 1、细胞培养

[0067] 人胃癌细胞株HGC-27，人肝癌细胞株HepG2，人肺癌细胞株A549，人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，人前列腺癌细胞株PC3，人鼻咽癌细胞株CNE-2，分别用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，神经细胞母细胞瘤SH-SY5Y，人结肠癌HT-29细胞株，分别用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养，放在37℃且5％CO2的饱和湿度培养箱中进行开放式单层细胞培养。在倒置显微镜下观察细胞密度为80％左右时，进行传代。传代时，先弃去旧培养液，然后用5mL的PBS洗两遍，加入0.25％的胰蛋白酶，放在37℃、5％CO2培养箱中孵育1-5分钟，在显微镜下看到细胞变圆时，用含血清培养基吹打细胞，终止消化，然后将细胞悬液移到对应的离心管中，1300r/min下离心5分钟，在无菌操作台中弃去上清，用2mL含血清的培养基均匀吹打离心管中的细胞，制成单细胞悬液，取1/3细胞于新培养瓶中，并补足培养基至5mL，继续培养。

[0068] 2、细胞转染培养

[0069] 取对数生长期的HT-29细胞，接种1×105-5×105个细胞至有培养基的24孔板中培养孔，使转染时的细胞密度能够达到30-50％。注：1)不同细胞生长速度不同，接种细胞的数量，细胞密度需要依据细胞类型，培养时间，实验目的而定；2)每孔接种的细胞数量 应尽量相同，使细胞均匀分布。将siRNA进行稀释后，加入到培养基中，轻轻混匀，保证转染浓度为50nM。将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24-96h。转染完成后24-72小时均可进行siRNA沉默效果检测。可用Western-blot检测目标蛋白的水平，反应siRNA沉默效果。

[0070] 人结肠癌HT-29细胞株PTEN缺失型和PTEN野生型，分别用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养，放在37摄氏度且5％CO2的饱和湿度培养箱中进行培养。其消化、重悬、传代步骤与其他人胃癌细胞株HGC-27，人肝癌细胞株HepG2等细胞株的培养方法相同。

[0071] 3、流式细胞仪测定3-氢化松苓酸氰乙酯对细胞周期的变化

[0072] 因细胞周期的检测对测定细胞的密度要求较高，密度过低时，流式细胞仪无法做出检测。因此，实验中需要使用50mL的细胞培养瓶培养HGC-27细胞，等到细胞贴壁且生长覆盖程度达到80％以上，开始加入3-氢化松苓酸氰乙酯处理胃癌细胞，设置浓度梯度为10、20、40μM，并且设置细胞对照组，要注意细胞对照组的密度应控制在60％左右，防止细胞在培养后处理时出现老化现象，影响后续的检测结果。然后将培养瓶中的细胞放入5％CO2，37℃培养箱中培养24h。时间终止时，使用不含EDTA的胰酶将细胞消化下来，并收集细胞于离心管中用2000r/min的转速离心5min，然后用PBS轻轻吹散细胞，尽量减少细胞受到的机械损伤。在相同转速下离心，如此反复洗涤2次，调整每组细胞浓度在1×106个/mL为宜，加入体积分数为70％的冷乙醇500μL进行固定，过夜。然后2000转下离心弃去固定液，加入试剂盒中的RNaseA 100μL，移液枪混匀细胞，并在37℃的水浴锅中水浴30min，最后加入400μL的PI均匀染色，放在4℃冰箱且在避光条件下反应30min，即可使用流式细胞仪进行上机检测，记录激发波长在488nm处的红色荧光。

[0073] 4、流式细胞仪测定细胞凋亡率

[0074] 细胞凋亡检测前的细胞处理方法和加药方式与细胞周期检测中的相同。同样要注意细胞在加药前的密度，防止对照组细胞处理时已经发生老化现象。不同的步骤在于胰酶消化细胞后，收集细胞在2000r下离心5min，PBS洗涤2次后，必须调整每组的细胞浓度在1-5×105个/mL范围内。然后用500μL的Binding Buffer悬浮细胞，加入Annexin V-FITC 5μL混匀后，接着加入5μL的Propidium Iodide(PI)混匀，PI本身就是一种核酸染液，它的作用在于能使凋亡晚期和坏死的细胞均透过细胞膜而染上色，然而完整的细胞是不能着色的。然后将处理好的样品放置在室温下，避光条件反应5至15min，1小时之内进行流式细胞仪上机检测，其结果均为有效数据。

[0075] 5、药物作用细胞后的自噬检测

[0076] 流式细胞仪测定细胞自噬比例

[0077] AO是实验应用中的荧光染料，能够在发生自噬的细胞中，将自噬小体进行染色。因此，利用流式细胞仪就可定量检测细胞发生自噬的比例。在大培养瓶中培养HGC-27细胞直至细胞处于对数期，加入不同浓度的3-氢化松苓酸氰乙酯并设置细胞对照组，药物处理细胞24h后，收集细胞，用PBS洗涤2次，然后将初始浓度的AO(1mg/mL)用PBS溶液稀释成0.1mg/L的浓度后，加入10uL的AO溶液于各组细胞中(对照组除外)，在常温下避光反应10-15min以后，立刻用流式细胞仪进行检测分析，实验过程重复3次。

[0078] 透射电子显微镜观察药物作用后的细胞形态

[0079] 在50mL的培养瓶中培养HGC-27细胞，待细胞密度达到60％以上且生长状态良好时，加入浓度为20μM的3-氢化松苓酸氰乙酯，在5％CO2，37℃的饱和湿度培养箱中培养，并设置空白对照组。药物作用24h后，使用0.25％胰酶消化细胞，轻轻用移液枪将细胞吹打下来，切勿对细胞造成机械损伤，用800的转速离心10min收集细胞。使用冷的PBS洗涤细胞2次后，将离心的细胞用500μL的2.5％戊二醛—1％锇酸固定细胞过夜，注意不可将细胞吹散，要缓缓加入。过夜之后将细胞团取出，用刀片切成芝麻大小进行后续实验。首先用双蒸水洗涤切好的细胞团2次，每次10-15min；再依次用50％、70％、80％、90％乙醇和无水乙醇各脱水15min；最后使用100％的丙酮进行两次脱水，而且保证每次10min。完成之后使用包埋剂与丙酮1:1混合液浸透包埋样本，将包埋样本放置37℃烘箱24h，再放入隔水式电热恒温箱48h，然后对包埋好的样本进行修片，并制备超薄切(注意，所切超薄切片需能着上色才可)，之后再用柠檬酸铅染液染色10-15min，即可用电镜观察超薄切片，并做好底片的序号记录，等待洗底片，扫描细胞结果图。

[0080] 6、分子对接计算3-氢化松苓酸氰乙酯与mTOR的结合能力

[0081] 分子对接是基于几何互补、电性互补为原则，利用计算机进行辅助作用，模拟药物和受体的分子或靶点的相互作用。本分子对接是从PDB数据库中选取mTOR晶体结构A链(4JT5_A)，去结晶水，加极性氢、电荷。以其中配体P2X为中心，建立 的对
接盒子。配体分子建立在pH 7.4下的离子化状态并做能量最小化处理。采用Glide SP方法进行分子对接，计算3-氢化松苓酸氰乙酯与mTOR的结合能力。以Gscore的分值表示药物与受体或靶点的结合能力强弱，Gscore的值越负，表示两者的结合能力越强，相互作用越强，反之，则越弱。

[0082] 7、Western blotting检测3-氢化松苓酸氰乙酯对相关蛋白表达的影响

[0083] 收集蛋白样品

[0084] 将HGC-27细胞接种在75cm2的大细胞培养瓶中，等到细胞贴壁生长良好且细胞密度高时，加入3-氢化松苓酸氰乙酯低、中、高剂量的药物浓度处理细胞，24h后分别收集各组细胞，每组细胞使用5mL的PBS洗涤，共2次，弃去洗涤液PBS后，每组加入100μL的细胞裂解液(50mmol/L Tris-Hcl pH8.0、5mmol/LEDTA、1％triton X-100、150mmol/LNaCl、1mmol PMSF)和1μL的磷酸酶抑制剂(防止磷酸化蛋白去磷酸化)。混匀后在制备冰上反复的冻融裂解3次，每次15分钟。12000的转速离心10-15min，取其上清液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒做出蛋白标准曲线图，再一一计算各样品的总蛋白含量。最后将各组蛋白进行计算，定量到同一浓度，定量好的蛋白加入2×蛋白上样缓冲液，在沸水中煮沸5-7min，分装到小型EP管中，放入-80℃冰箱保存备用。

[0085] 配胶

[0086] 首先将实验所用玻璃板用洁净的纱布擦洗，并用双蒸水冲洗2遍，晾干以后备用。按照仪器的安装说明，将玻璃板安装好，用双蒸水进行检漏至无水漏出即可。按照电泳所需蛋白分子量的大小，选择适宜的凝胶浓度。按照试剂配方，配好分离胶置于干净的烧杯中搅拌均匀，然后用移液枪将液体缓缓灌入两玻璃板之间，(注意不能灌入气泡，若出现气泡，则用废弃的进样针迅速赶出气泡)，分离胶灌入4mL后停止灌样，立即用双蒸水封胶。需缓缓加水，直至与玻璃板的上侧水平，切勿加水过急，使分离胶溢出。将分离胶放置在37℃的烘箱中，水平静置30-45min。观察胶与水的交界面是否出现一条折光线，有则表示分离胶已凝固好，可倒掉封闭的水，再用滤纸吸干多余的水，最后灌入已配好且混匀的浓缩胶，插上梳子，室温下凝固1h后即可使用。

[0087] 上样

[0088] 浓缩胶凝固好后，可轻轻的拔出梳子，正确的将凝胶放入电泳槽中，倒入电泳缓冲液，注意电泳液应外侧倒入2/3的体积，内侧应倒满。等待30min后再上样，时间放置越长越有利于胶结构的形成，因为肉眼观察到的胶凝固时，其内部的结构还没有形成好。上样前将各蛋白样品放置在室温溶解，置于振荡器上混合均匀或再次沸水水浴5min，然后使用微量进样针等体积上样到中间泳道，剩余的泳道则用相同体积的1×Loading buffer进行填充。Marker泳道需在Marker上样量的基础上，补充1×Loading buffer至相同的体积。

[0089] 电泳

[0090] 上样结束后，按照接线规则连好电源的正负极，先设置浓缩电压80v，等条带电泳到浓缩胶和分离胶的分界面时，将电压调到120v进行条带分离，接着电泳1h左右，以Marker 为参照，电泳至所有的条带均匀分开后，即可停止电泳。若所需目标蛋白分子量为小分子量，则应先用60v电压电泳，再换至120v的电压，若所需蛋白为大分子量蛋白，电泳时间过长时，应隔段时间更换冰块，防止电泳时间过长，分离胶温度升高，出现融化现象。

[0091] 转膜

[0092] 电泳结束后，将卸下的胶块正面朝上，以Marker作为标记切取所需的凝胶条带，并且事先按照所需凝胶大小对应尺寸，剪取同样大小的PVDF膜一张和滤纸两张备用。凝胶条带放入新配制的转膜缓冲液中浸泡，PVDF膜则依次在无水甲醇、双蒸水、转膜缓冲液中分别浸泡10s、5min、10min，滤纸则在双蒸水、转膜缓冲液中分别浸泡5、10min。然后按照顺序先将凝胶条带放在黑板上，再放滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸，凝胶盖板白板。装入电泳槽中，黑板放电源负极，白板放电源正极，倒入转膜缓冲液。将电泳槽放入准备好的冰水浴中，电泳仪调至稳定电流为200mA，电泳时间在30-90min为宜(大分子蛋白除外)，使Marker条带能够完全转移到纤维素膜上，则转膜完成，停止电泳。可将凝胶条带置于考马斯亮蓝染液中，染色1h后，洗涤条带，观察转膜是否完全。

[0093] 封闭

[0094] 转膜完成后，用镊子轻轻夹取PVDF膜有Marker标记的一端，先用TBST洗涤3次，每次5min，然后将膜放在TBST配好的5％的脱脂牛奶中，摇床上低速摇匀孵育2-2.5h。

[0095] 孵育一抗

[0096] 封闭结束后，先用TBST漂洗纤维素膜3次×10min，然后置于TBST稀释好的一抗孵育瓶中，在4℃冰箱中缓慢摇匀到过夜，第二天再取出放在室温下摇床轻摇1h。

[0097] 孵育二抗

[0098] 一抗孵育完成后，镊子轻轻夹取PVDF膜有Marker标记的一端，用TBST洗涤3次，每次5-10min，然后将PVDF膜放在TBST稀释好的二抗溶液中，室温轻摇1小时，计时器计时。

[0099] 洗涤

[0100] 二抗孵育完毕后，接着用TBST洗涤纤维素膜，洗涤三次，每次10min。

[0101] 暗室曝光

[0102] 准备好暗室曝光前所用的试剂盒仪器，先用镊子将孵育完成的PVDF膜轻轻取出，用虑纸将膜上多余的水吸干。PVDF膜平放置在暗匣中，滴加已经配好的发光液(A液和B液按1:1混合)，并将多余的发光液用滤纸吸走。在暗室条件下等待PVDF膜出现绿色荧光，等待所有荧光出现完为止。将PVDF膜盖上准备好的极薄的透明塑料膜，剪出大小相当的 柯达胶片，盖在膜上，立刻关闭暗匣，若荧光弱则多等待几分钟，若荧光强，则至多等待1min。适应的时间适度曝光及其重要，曝光结束后，将胶片放在显影液中显影1-4min，再放入清水中来回漂洗，最后放在定影液中定影1-4min。PVDF膜需用水清洗后在阴凉处晾干。之后扫描胶片即可，条带可用凝胶图像分析软件Image J.Ink进行定量分析，统计学比较。

[0103] 8、3-氢化松苓酸氰乙酯对神经细胞SH-SY5Y的保护作用

[0104] 3-氢化松苓酸氰乙酯对SH-SY5Y的细胞毒性

[0105] 取对数生长期的SH-SY5Y细胞以5×104个/mL的浓度接种于96孔板，100μL/孔，贴壁生长12h后，加入3-氢化松苓酸氰乙酯的不同浓度(80、40、20、10、5、2.5、1.25μM)，每个浓度设定3个复孔，培养48h后，MTT法检测细胞的抑制率，并计算药物对应的IC50值。

[0106] 3-氢化松苓酸氰乙酯对SH-SY5Y细胞的保护作用

[0107] SH-SY5Y细胞分为2组：空白组和模型组，取对数生长期的SH-SY5Y细胞以5×104个/ml的浓度接种于96孔板，100μL/孔，培养12h后弃去旧培养基，模型组加入不同浓度的H2O2溶液，H2O2浓度为1200μM，1100μM，1050μM，1000μM，950μM，900μM，800μM，750μM，700μM。空白组加入DMEM培养基，最后保证200μL/孔，继续培养12h，MTT比色法检测细胞存活率。选取可导致40％～50％SH-SY5Y细胞死亡的H2O2浓度处理细胞，建立氧化损伤模型。

[0108] 取对数生长期的SH-SY5Y细胞以5×104个/mL的浓度接种于96孔板，培养12h后弃去旧培养基，模型组加入1100μM的H2O2溶液，空白组加入DMEM培养基，最后保证200μL/孔，继续培养12h，然后弃去旧培养基，设置空白组、模型组、阳性组(50μg/mL的维拉帕米)，加药组(3-氢化松苓酸氰乙酯对应的浓度5μM、2μM、1μM),保证每孔200uL。培养6小时以后，每孔加10uL的MTT。4小时以后进行测定。

[0109] 3-氢化松苓酸氰乙酯对AD大鼠的学习及记忆功能的影响(动物实验)

[0110] 阿尔兹海默病(AD)是一种起病隐袭且进行性发展的神经系统退行性疾病，临床上以进行性记忆障碍、失语、失用、失认、视空间损害、执行功能障碍及人格和行为改变为特征。接受Aβ海马内注射的大鼠是相对经典的AD动物模型，在体内能较好的模拟AD的病理过程，与其他实验模型相比，更为切实的反应AD的发病进程。

[0111] 海马内Aβ1-40注射诱导AD实验模型：各组SD大鼠均采用1％戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉，AD模型组、3-氢化松苓酸氰乙酯药物组均于双侧海马CAI区缓慢匀速注射Aβ 1-401μL(10mg/mL),留针5min，对照组则注射等量生理盐水，退针后缝合伤口。

[0112] 选取32只SD大鼠随机分为4组，每组8只。分别为对照组、AD模型组、3-氢化松苓酸氰乙酯药物组(180mg/kg)。手术后，加药组每天灌胃一次，共计20天，对照组和AD模型组给予等量生理盐水。从第17天开始，采用Morris水迷宫测试评估大鼠学习记忆能力，共计4天。

[0113] 按照Morris水迷宫操作说明评估测试大鼠学习和记忆能力。所应用水迷宫参数指标为：圆形水池，直径180cm，高55cm，内壁黑色，设定水深30cm，距池壁35cm处放置圆台(高30cm，直径10cm)。实验历时4天，实验前一天让大鼠自由游泳2min，从第一天起每天上、下午各训练4次。训练时，入水点随机选取，将大鼠面向池壁放入池中，记录各组大鼠寻找平台并爬上平台所用时间(即寻台潜伏期)，相邻两次训练时间间隔为1min。若大鼠在2min内未找到平台，人为引至平台，记为2min。4天训练时间结束后，撤开水下平台，在同一地点将大鼠放入池中，测在2min内，大鼠在原平台象限区域活动时间，与总时间比值，记录跨过原平台位置的次数。

[0114] 9、3-氢化松苓酸氰乙酯的降血糖作用

[0115] 3-氢化松苓酸氰乙酯对HepG2细胞的降血糖作用

[0116] 接种于含10％胎牛血清的1640培养基的HepG2细胞于96孔培养板中，细胞贴壁24h后，同时向孔内加入不同梯度浓度的胰岛素。试验分组：胰岛素药物分为5个组，分别为胰岛素10-5M，10-6M，10-7M，10-8M，10-9M，另设空白对照组每组6个复孔。

[0117] 各浓度胰岛素作用于HepG2细胞24h后，弃旧培养基，用PBS缓慢清洗细胞三次，加1640(无血清)培养基刺激20min，弃培养基，用PBS缓慢清洗细胞三次，加含1％胎牛血清培养基(含各浓度胰岛素)培养24h后，按葡萄糖试剂盒说明分别对上清糖含量进行测定。观察HepG2细胞的胰岛素耐受浓度。

[0118] 接种于含10％胎牛血清的1640培养基于96孔培养板中，细胞贴壁24h后，弃旧培养基，用PBS缓慢清洗细胞三次，加1640(无血清)培养基刺激20min，弃培养基，用PBS缓慢清洗细胞三次，加含1％胎牛血清培养基(含10-7M的胰岛素和各浓度的药物)3-氢化松苓酸氰乙酯药物浓度分别为80μM，40μM，20μM，10μM，5μM培养24h后，按葡萄糖试剂盒说明分别对上清糖含量进行测定。

[0119] 3-氢化松苓酸氰乙酯的降血糖作用(动物实验)

[0120] 糖尿病小鼠模型的建立：选用雄性昆明小鼠适应性喂养1周，高糖高脂饲料(饲料组成：10％猪油、20％蔗糖、5％蛋黄、65％常规饲料)喂养8周，禁食不禁水12h，以100mg/kg 腹腔注射2％四氧嘧啶水溶液，小鼠继续喂养高糖高脂饲料，72h(禁食12h)后，小鼠眼眶后静脉丛取血并测定血糖值，选取空腹血糖(FBG)＞11.1Mm的小鼠作为糖尿病模型小鼠。

[0121] 选取正常小鼠8只作为正常对照组，同时选取造模成功的糖尿病小鼠32只，随机均分为4组，分为模型对照组，二甲双胍阳性药对照组(200mg/kg)，

[0122] 3-氢化松苓酸氰乙酯低、高剂量组(120、240mg/kg)。阳性药、给药组均每日灌胃给药1次，正常组和模型组给予等体积的0.5％CMC-Na溶液，连续灌胃4周。实验期间，除正常对照组给予常规饲料喂养外，其余各组均以高糖高脂饲料喂养。

[0123] 10、统计学方法

[0124] 采用SPSS 13.0软件对数据进行统计和分析，数据都用均数±标准差 的形式表示。组间的差异用单因素方差进行分析，与对照组比较P<0.05为两者的数据差异有显著性结果，与对照组比较P<0.01为两者的数据差异有极显著性结果。

[0125] 二、实验结果：

[0126] 1、3-氢化松苓酸氰乙酯对多种肿瘤细胞的抑制作用

[0127] 使用5～80μM的3-氢化松苓酸氰乙酯处理HGC-27、HepG2、A549、MDA-MB-231、PC3、CNE-2细胞24h后，MTT检测3-氢化松苓酸氰乙酯对各细胞的抑制作用，并计算IC50值，结果见表1和表2。

[0128] 表1 3-氢化松苓酸氰乙酯对不同肿瘤细胞的抑制作用(n＝3， )

[0129]

[0130] 表2 3-氢化松苓酸氰乙酯与紫杉醇对HGC-27细胞的抑制作用

[0131]

[0132] 2、3-氢化松苓酸氰乙酯促进细胞自噬而产生药理作用

[0133] 3-氢化松苓酸氰乙酯对HGC-27的细胞周期影响

[0134] 使用10(B)、20(C)、40(D)μM的3-氢化松苓酸氰乙酯处理HGC-27细胞24h，并设置细胞对照组(A)。经过PI染色以后，检测3-氢化松苓酸氰乙酯对HGC-27细胞的细胞周期产生的影响。从流式细胞仪分析的结果发现，低、中、高剂量组的3-氢化松苓酸氰乙酯作用HGC-27细胞后，对应的G0/G1期的细胞分布分别为(47.5±4.7)％、(53.1±3.3)％、(58.6±3.8)％，与细胞对照组(41.5±4.1)％比较，中剂量组的TAB使胃癌细胞显著性的阻滞于G0/G1期(P<0.05)，高剂量组可极显著性的阻滞细胞于G0/G1期(P<0.01)。其分析结果如表3所示，说明3-氢化松苓酸氰乙酯使胃癌细胞HGC-27阻滞于G0/G1期，从而抑制胃癌细胞HGC-27的生长和增殖。

[0135] 表3 3-氢化松苓酸氰乙酯对HGC-27细胞周期的影响(n＝3， )

[0136]

[0137] 注：*与对照组相比P<0.05；**与对照组相比P<0.01。

[0138] 3-氢化松苓酸氰乙酯对HGC-27细胞凋亡的影响

[0139] 使用10(B)、20(C)、40μM(D)的3-氢化松苓酸氰乙酯处理HGC-27细胞24h，并 设置细胞对照组(A)。使用流式细胞仪检测3-氢化松苓酸氰乙酯对HGC-27细胞的凋亡影响，具体见图2；其中A:对照组；B：3-氢化松苓酸氰乙酯(10μM)；C：3-氢化松苓酸氰乙酯(20μM)；D：3-氢化松苓酸氰乙酯(40μM)，实验中的4个象限分别是：左上(AV﹣,PI﹢)；右上(AV﹢,PI﹢)；左下(AV﹣,PI﹣)；右下(AV﹢,PI﹣)。AV﹢染色表示早期凋亡，PI﹢染色表示坏死。实验结果发现，3-氢化松苓酸氰乙酯没有使胃癌HGC-27细胞发生早期凋亡现象，发现坏死细胞的比例随药物剂量升高逐渐地增加。此结果说明3-氢化松苓酸氰乙酯使胃癌HGC-27死亡的方式可能不是通过细胞凋亡途径。

[0140] 3-氢化松苓酸氰乙酯对HGC-27细胞自噬的影响

[0141] 透射电镜检测3-氢化松苓酸氰乙酯作用后的细胞亚显微结构，具体见图3，其中a：对照组(×6000)b/c：自噬泡(×6000)d:自噬体亚显微结构(×15000)：

[0142] 在对数生长期的HGC-27细胞，设置细胞对照组和3-氢化松苓酸氰乙酯加药组(20μM)，处理细胞24h后，收集细胞，固定、脱水、浸透、包埋、制备超薄切片，最后完成染色，透射电镜观察超薄切片，拍照记录结果。电镜结果显示对照组的细胞，细胞核大而完整，细胞器排列整齐，没有缺失，细胞膜的边缘也清晰可见。反之，3-氢化松苓酸氰乙酯作用后的胃癌细胞HGC-27，细胞核发生缺损或是缺失，大多数的细胞器都受损，大量的双侧膜状态的自噬泡、自噬体出现，而且自噬体中还含有残留的消化物质，更有大量的自噬空泡。实验结果表明3-氢化松苓酸氰乙酯诱导胃癌细胞HGC-27发生自噬。

[0143] AO染色法检测细胞自噬比例，具体见图4，3-氢化松苓酸氰乙酯对HGC-27细胞自噬比例的影响，其中A:对照组；B：3-氢化松苓酸氰乙酯(10μM)；C：3-氢化松苓酸氰乙酯(20μM)；D：3-氢化松苓酸氰乙酯(40μM)。

[0144] 发生自噬的小体可被AO染色，然后使用流式细胞仪可检测其染色的细胞。因此，利用AO染色可定量检出细胞自噬的比例。分别使用低、中、高剂量的3-氢化松苓酸氰乙酯处理HGC-27细胞24h后收集细胞，并设空白对照组。经流式细胞仪检测，结果发现，10、20、40μM的3-氢化松苓酸氰乙酯处理细胞后，10μM的3-氢化松苓酸氰乙酯没有使自噬比例发生明显改变，而20、40μM的3-氢化松苓酸氰乙酯分别使细胞的自噬比例增加到3.49±2.37％，43.85±7.09％，与细胞对照组(0.58±0.56％)比较，细胞自噬比例逐渐升高，而且高剂量组3-氢化松苓酸氰乙酯(40μM)引起的自噬比例与空白组比较具有极显著性的差异(P<0.01)。

[0145] 3-氢化松苓酸氰乙酯作用HGC-27细胞后自噬相关蛋白的检测：

[0146] 使用浓度为10、20、40μM的3-氢化松苓酸氰乙酯处理HGC-27细胞，并且设置细胞 对照组，作用24h以后收集细胞提取总蛋白。Western blotting的检测结果见表4，自噬的关键调控蛋白Beclin-1的表达随药物浓度的升高发生明显的增加，20、40μM的3-氢化松苓酸氰乙酯使Beclin-1的表达出现极显著的升高；LC3也是参与自噬发生的重要基因。检测结果显示，LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的比例发生显著性的降低，说明LC3Ⅰ随3-氢化松苓酸氰乙酯浓度升高逐渐向LC3Ⅱ转化，且低、中、高剂量都具有极显著的差异。Western blotting结果表明3-氢化松苓酸氰乙酯引起自噬关键蛋白发生了改变。

[0147] 表4 3-氢化松苓酸氰乙酯对自噬蛋白表达的影响(n＝3， )

[0148]

[0149] 注：与空白组相比*P<0.05；**P<0.01

[0150] 3、3-氢化松苓酸氰乙酯促进细胞自噬的机制是：3-氢化松苓酸氰乙酯是PI3K/mTOR双重抑制剂。

[0151] 3-氢化松苓酸氰乙酯对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响

[0152] 分子对接实验结果：

[0153] 从PDB数据库中选取mTOR晶体结构A链(4JT5_A)，去结晶水，加极性氢、电荷。以其中配体P2X为中心，建立 的对接盒子。配体分子建立在pH 7.4下的离子化状态并做能量最小化处理。采用Glide SP方法进行分子对接，分子对接作用模式如下：

[0154] 配体位于Gln2161，Ile2163，Thr2164，Ser2165，Pro2169，Leu2185，Lys2187，Leu2192，Asp2195，Met2199，Ile2237，Trp2239，Cys2243，Asp2244，Thr2245，Hid2247，Arg2251，Ser2342，Met2345，Ile2356，Asp2357，Phe2358等氨基酸残基组成的活性口袋中。3-氢化松苓酸氰乙酯的羧基中羰基氧与Lys2187之间有氢键作用。与3-氢化松苓酸氰乙酯对接的Gscore为-5.36。从以上的计算机模拟结果来看，理论上阐明了3-氢化松苓酸氰乙酯与mTOR有很好的亲和能力及相互作用。3-氢化松苓酸氰乙酯和mTOR的分子对接结果图5。

[0155] 3-氢化松苓酸氰乙酯对PI3K/AKT/mTOR信号通路中关键蛋白表达的影响：

[0156] 3-氢化松苓酸氰乙酯浓度为20μM处理HGC-27细胞，并设置细胞对照组，作用24h后收集细胞并提取总蛋白，进行蛋白定量。Western blotting检测了3-氢化松苓酸氰乙酯作 用细胞24h后，信号通路中P-PI3K、P-mTOR以及信号通路下游P-p70S6K蛋白的表达情况。实验结果显示，3-氢化松苓酸氰乙酯作用HGC-27细胞24h后，P-PI3K、P-mTOR、P-p70S6K蛋白表达都出现了显著性的下调，与空白组进行对比有着极显著性的差异。具体见表5。

[0157] 表5 3-氢化松苓酸氰乙酯对不同蛋白表达的影响(n＝3， )

[0158]

[0159] 注：与空白组相比*P<0.05；**P<0.01

[0160] 4、3-氢化松苓酸氰乙酯抑制mTOR具有抗癌作用，且对PTEN缺失型肿瘤效果好。

[0161] 3-氢化松苓酸氰乙酯对PTEN缺失型和野生型的HT-29细胞的抑制作用

[0162] PTEN作为一种抑瘤因子，在PI3K/AKT/mTOR信号通路中起着关键的作用。PTEN的缺失或者是丢失，都可以激活PI3K/AKT/mTOR信号途径。在临床实验中，研究发现，胃癌患者组织中出现大量PTEN缺失的现象，而健康人群中，PTEN都是呈阳性表达，因此，PTEN与PI3K/AKT/mTOR信号通路之间可能有密切关联。

[0163] 取对数生长期的PTEN野生型和PTEN缺失型HT-29细胞接种于96孔板中，培养12h以后，加入3-氢化松苓酸氰乙酯，药物浓度为(80、40、20、10、5、2.5、1.25μM)，培养48h后，MTT法检测细胞的抑制率，计算药物对应的IC50值。结果显示3-氢化松苓酸氰乙酯显著抑制PTEN缺失型HT-29细胞。具体见表6。

[0164] 表6 3-氢化松苓酸氰乙酯对PTEN野生型和缺失型HT-29细胞的半数抑制浓度(IC50)(n＝3， )

[0165]

[0166] 5、3-氢化松苓酸氰乙酯抑制mTOR具有治疗阿尔茨海默氏病(AD)等神经退性性病变作用。

[0167] 3-氢化松苓酸氰乙酯对神经细胞SH-SY5Y的保护作用

[0168] 3-氢化松苓酸氰乙酯对SH-SY5Y的细胞毒性：

[0169] 3-氢化松苓酸氰乙酯不同浓度(80、40、20、10、5、2.5、1.25μM)作用于SH-SY5Y 细胞，培养48h后，MTT法检测细胞的抑制率，计算3-氢化松苓酸氰乙酯对应的IC50值。结果显示药物对SH-SY5Y细胞毒性较小。具体见表7。

[0170] 表7 3-氢化松苓酸氰乙酯对SH-SY5Y的细胞毒性(n＝3， )

[0171]

[0172] 3-氢化松苓酸氰乙酯对SH-SY5Y细胞的保护作用：

[0173] 使用H2O2不同浓度处理细胞，建立氧化损伤模型。实验结果得出在H2O2 1100μM的浓度下，神经细胞的抑制率达到42.71％。将SH-SY5Y细胞分组为空白组、模型组、阳性组(50μg/mL的维拉帕米)，加药组(药物对应的浓度5μM、2μM、1μM),保证每孔200uL。培养6小时以后，每孔加10uL的MTT。4小时以后进行测定。结果显示阳性药50μg/mL维拉帕米能显著性的提高双氧水损伤后SH-SY5Y细胞，对神经细胞有保护作用。3-氢化松苓酸氰乙酯对神经细胞也有保护作用，3-氢化松苓酸氰乙酯浓度为5μM时，表现出极显著的保护作用，2μM时有显著性的保护作用。具体见表8。

[0174] 表8 3-氢化松苓酸氰乙酯对SH-SY5Y细胞的保护作用(n＝3， )

[0175]

[0176] 注：*与模型组相比P＜0.05；**与模型组相比P＜0.01

[0177] 3-氢化松苓酸氰乙酯对AD大鼠的学习及记忆功能的影响(动物实验)：

[0178] 测定各组大鼠在Morris水迷宫实验中4天内的寻台潜伏期，具体见表9，表10，表11。结果显示所有大鼠的寻台潜伏期都表现出缩短的趋势，但是AD模型组大鼠的寻台潜伏期相比于对照组明显延长，而3-氢化松苓酸氰乙酯(180mg/kg)药物组的寻台潜伏期要显著低于AD模型组。撤去平台后记录各组大鼠在原平台象限活动时间与总时间比值，以及跨平台的次数。结果发现，与对照组相比，AD模型组搜索时间比值显著降低，搜索次数也显著减少；3-氢化松苓酸氰乙酯(180mg/kg)药物组有模型组比较，搜索时间比值及搜索次数都出现显著提高，但没有恢复正常值。众多实验结果表明，Aβ海马内注射后可导致 SD大鼠学习及记忆功能受损，3-氢化松苓酸氰乙酯可较好地改善海马内注射Aβ所致的学习记忆功能受损。

[0179] 表9Morris水迷宫实验中各组大鼠寻台潜伏期的变化(n＝4， )

[0180]

[0181] 注：与AD模型组相比*P<0.05；**P<0.01；与对照组相比#P<0.05；##P<0.01

[0182] 表10各组SD大鼠搜索时间所占比值的变化(n＝4， )

[0183]

[0184] 注：与AD模型组相比*P<0.05；**P<0.01；与对照组相比#P<0.05；##P<0.01

[0185] 表11各组SD大鼠搜索次数的变化(n＝4， )

[0186]

[0187] 注：与AD模型组相比*P<0.05；**P<0.01；与对照组相比#P<0.05；##P<0.01

[0188] 6、3-氢化松苓酸氰乙酯抑制mTOR具有治疗糖尿病作用。

[0189] 3-氢化松苓酸氰乙酯的降血糖作用

[0190] 3-氢化松苓酸氰乙酯对HepG2细胞的降血糖作用，具体见表12。

[0191] 选取胰岛素10-5M，10-6M，10-7M，10-8M，10-9M，另设空白对照组，作用于HepG2细胞24h后，弃旧培养基，用PBS缓慢清洗细胞三次，加1640(无血清)培养基刺激20min，弃培养基，用PBS缓慢清洗细胞三次，加含1％胎牛血清培养基(含各浓度胰岛素)培养24h后，按葡萄糖试剂盒说明分别对上清糖含量进行测定。造模结果显示HepG2细胞的胰岛素耐受浓度在10-7M。

[0192] 表12胰岛素对HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响(n＝5， )

[0193]

[0194] 使用同样的方法培养HepG2细胞，加含1％胎牛血清培养基(含10-7M的胰岛素和各浓度的3-氢化松苓酸氰乙酯)，3-氢化松苓酸氰乙酯浓度分别为80μM，40μM，20μM，10μM，5μM培养24h后，按葡萄糖试剂盒说明分别对上清糖含量进行测定。检测结果显示3-氢化松苓酸氰乙酯在40μM浓度下极显著降低葡萄糖含量，具体见表13。

[0195] 表13 3-氢化松苓酸氰乙酯对HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响(n＝5， )

[0196]

[0197] 注：*与胰岛素10-7组相比P<0.05；**与胰岛素10-7组相比P<0.01

[0198] 3-氢化松苓酸氰乙酯的降血糖作用(动物实验)，具体见表14。

[0199] 离心取血清，使用葡萄糖试剂盒测定空腹血糖值。与正常组相比，模型组小鼠血糖显著升高；与模型组小鼠比较，3-氢化松苓酸氰乙酯的低、高剂量组均显著性的降低小鼠血糖值。

[0200] 表14 3-氢化松苓酸氰乙酯对糖尿病小鼠血糖的影响(n＝8， )

[0201]

[0202]

[0203] 注：与模型组相比aP<0.05；bP<0.01；与正常组相比cP<0.05；dP<0.01。