黎豆种皮黑色素的提取方法

摘要

本发明提供黎豆种皮黑色素的提取方法，提取过程为：将黎豆种皮通过水煮除杂后，按照1∶6‑9g/ml的料液比加入NaOH溶液并在氮气环境中浸提10‑14h，之后加入HC1溶液调pH

权利要求

1.黎豆种皮黑色素的提取方法，其特征在于，所述方法为：

提取过程：将黎豆种皮通过水煮除杂后，按照1∶6-9g/mL 的料液比加入浓度为0.5mol/L的NaOH溶液，浸提10-14h，之后加入HC1溶液调pH<2.5，离心收集得到胶状沉淀；

纯化过程：将收集到的胶状沉淀悬浮于15-25倍体积的HCl溶液，在沸水浴中水解2-6 h，冷却后离心收集固体颗粒；

将收集的固体颗粒依次用乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗涤，并在之后利用NaOH溶液和HCl 溶液进行多次沉淀，得到黑色素颗粒；

纯化过程中依次将固体颗粒质量的50倍体积的乙醇、乙酸乙酯、丙酮与固体颗粒混合并震荡30min，然后离心分离。

2.根据权利要求1所述的黎豆种皮黑色素的提取方法，其特征在于，提取过程中按照1∶

7.5g/mL 的料液比加入NaOH溶液。

3.根据权利要求1所述的黎豆种皮黑色素的提取方法，其特征在于，提取过程中浸提时间为12h。

4.根据权利要求1所述的黎豆种皮黑色素的提取方法，其特征在于，提取过程中浸提温度条件为60℃。

5.根据权利要求1所述的黎豆种皮黑色素的提取方法，其特征在于，提取过程中利用浓度为2mol/L HCl溶液调pH为2。

6.根据权利要求1所述的黎豆种皮黑色素的提取方法，其特征在于，纯化过程中将收集的胶状沉淀悬浮于15倍体积的HCl溶液中水解，其中，所用HCl溶液浓度为7mol/L。

7.根据权利要求1所述的黎豆种皮黑色素的提取方法，其特征在于，纯化过程中沸水浴中水解并冷却后在5000r/min离心10min后，收集固体颗粒。

8.根据权利要求1所述的黎豆种皮黑色素的提取方法，其特征在于，所述利用NaOH溶液和HCl 溶液进行多次沉淀具体为：将洗涤后的固体颗粒首先用0.5 mol/L NaOH在超声波辅助下溶解30 min，离心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl调节pH 1～2，沉淀1～2 h后离心，然后再次加入NaOH调节至pH 11使固体颗粒溶解，离心取上清液酸化使之沉淀，如此反复沉淀。

说明书

黎豆种皮黑色素的提取方法

技术领域

[0001] 本发明涉及提取工艺技术领域，尤其涉及黎豆种皮黑色素的提取方法。

背景技术

[0002] 黑色素是广泛存在于动物、植物和微生物中的棕黑到黑色难溶性色素的总称，具有重要的生理特征。在动植物体内黑色素具有防御、保护的功能。现有资料表明，黑色素一般为两种类型，即吲哚型(Eumelanin)和邻苯二酚型(Pheomelanin)。认为动物黑色素多属吲哚型(Eumelanin)，而植物源黑色素多属邻苯二酚型(Pheomelanin)。

[0003] 黑色素可为生物体提供结构性强度或保护生物免紫外线、电离辐射、重金属污染、低温和高温等环境胁迫的伤害。它不仅是一类光保护剂、抗辐射剂、螯合剂、生物抗氧化剂和免疫促进剂,而且还是一类生物半导体材料。近年来的研究还发现,黑色素具有抗蛇毒、抗癌、抑制艾滋病毒复制、治疗帕金森症等作用，具有广泛的开发应用潜力。在食品方面的开发利用最为常见，可以将黑色素制成的食品添加剂，不仅无毒无害，还能对人体其保健作用。在保健功能食品上，可利用黑色素的功效成分生产口服液、营养保健片、多维胶囊等。

[0004] 黎豆(Stizo1obium capitatum Kuntze)又名猫猫豆、毛毛豆、龙爪豆、毛狗豆、小狗豆、狗爪豆、狸豆、虎豆、八升豆，是豆科黎豆属一年生草本植物。原产亚洲南部，分布于热带和亚热带(美洲除外)，我国四川、云南、广西、贵州、湖南、湖北、安徽等省均有栽培，日本也广为栽培。我国对黎豆种皮黑色素的研究开发尚未见报道，目前常用的提纯工艺无法从黎豆种皮中有效提取黑色素。

[0005] 因此，现有技术还有待于进一步改进。

发明内容

[0006] 鉴于现有技术的不足，本发明在于提供黎豆种皮黑色素的提取方法，旨在解决目前无相应技术能从黎豆种皮中有效提取黑色素的问题。

[0007] 本发明的技术方案如下：

[0008] 黎豆种皮黑色素的提取方法，其中，所述方法为：

[0009] 提取过程：将黎豆种皮通过水煮除杂后，按照1∶6-9g/ml的料液比加入NaOH溶液浸提10-14h，之后加入HC1溶液调pH<2.5，离心收集得到胶状沉淀；

[0010] 纯化过程：将收集到的胶状沉淀悬浮于15-25倍体积的HCl溶液，在沸水浴中水解2-6 h，冷却后离心收集固体颗粒；

[0011] 将收集的固体颗粒依次用乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗涤，并在之后利用NaOH溶液和HCL溶液进行多次沉淀，得到黑色素颗粒。

[0012] 所述的黎豆种皮黑色素的提取方法，其中，提取过程中按照1∶7.5g/ml的料液比加入NaOH溶液。

[0013] 所述的黎豆种皮黑色素的提取方法，其中，所用NaOH溶液的浓度为0.5mol/L。

[0014] 所述的黎豆种皮黑色素的提取方法，其中，提取过程中浸提时间为12h。

[0015] 所述的黎豆种皮黑色素的提取方法，其中，提取过程中浸提温度条件为60℃。

[0016] 所述的黎豆种皮黑色素的提取方法，其中，提取过程中利用浓度为2mol/L HCl溶液调pH为2。

[0017] 所述的黎豆种皮黑色素的提取方法，其中，纯化过程中将收集的胶状沉淀悬浮于15倍体积的HCl溶液中水解，其中，所用HCl溶液浓度为7mol/L。

[0018] 所述的黎豆种皮黑色素的提取方法，其中，纯化过程中沸水浴中水解并冷却后在5000r/min离心10min后，收集固体颗粒。

[0019] 所述的黎豆种皮黑色素的提取方法，其中，将纯化过程中依次将固体颗粒质量的50倍体积的乙醇、乙酸乙酯、丙酮与固体颗粒混合并震荡30min，然后离心分离。

[0020] 所述的黎豆种皮黑色素的提取方法，其中，所述利用NaOH溶液和HCL溶液进行多次沉淀具体为：将洗涤后的固体颗粒首先用0.5 mol/L NaOH在超声波辅助下溶解30 min，离心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl调节pH 1～2，沉淀1～2 h后离心，然后再次加入NaOH调节至pH 11使固体颗粒溶解，离心取上清液酸化使之沉淀，如此反复沉淀。

[0021] 有益效果：本发明提供黎豆种皮黑色素的提取方法，所述提取方法操作简单，黎豆种皮黑色素的提取量高并且纯度高，黑色素氧化程度低，提取周期短，此外成本低廉，适合用于进行黎豆种皮黑色素的大规模提取，提高了黎豆的经济价值，拓宽了黎豆的应用领域。

具体实施方式

[0022] 本发明提供黎豆种皮黑色素的提取方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0023] 本发明提供黎豆种皮黑色素的提取方法，所述提取方法为：

[0024] 提取过程包括如下步骤：

[0025] S1：将黎豆种皮进行水煮除杂：称取5.0g 黎豆种皮，将其放入150ml锥形瓶中，加入100 mL蒸馏水煮沸15 min后过滤，以除去水溶性杂质和排除材料中的气体，有利于后续实验。

[0026] S2：按照质量比1∶6-9g/ml的料液比向溶液中加入NaOH溶液浸提10-14h。

[0027] 由于黑色素具有溶于碱性溶液而在酸性溶液中沉淀的性质，并且碱液对黑色素的选择性高，溶解力强，萃取率也高，因此碱溶酸沉法是黎豆种皮黑色素的有效提取方法。而碱液中，NaOH溶液的碱性强，对黑色素的溶解力更强，提取效果好。当NaOH溶液的浓度为1mol/L时，黑色素的溶解力最强，提取效率最高。

[0028] 在一定范围内，黎豆种皮黑色素的提取量随NaOH溶液的量增加而提高，但是当NaOH溶液的量过多时，黎豆种皮黑色素的提取量基本不再改变，此时过多的NaOH溶液会提高提取的成本，造成浪费。当按照质量比1∶6-9g/ml的料液比向溶液中加入NaOH溶液时，黎豆种皮黑色素的提取效率高，成本较低。优选地，当料液比为比1∶7.5g/ml时，黎豆种皮黑色素的提取量达到最高，并且消耗NaOH溶液的量最少。

[0029] 浸提的时间越长，黑色素提取的量越多，但是时间过长时，容易由于微生物的滋生而污染提取物。当浸提时间控制在10-14h，黑色素提取效率高，并且品质好。优选地实施例中，在提取过程中浸提时间为12h，此时能保证最大程度地提取黎豆种皮黑色素。

[0030] 由于随着提取温度的升高，黑色素得率不断上升。但是60℃后，黑色素的氧化程度进一步加深，抗氧化能力不断降低，黑色素含量明显呈下降趋势，粗提物中杂质含量提高，黑色素含量下降，，这将对下一步的纯化带来不便，因此，在提取过程中，浸提温度条件为60℃时，黑色素的提取率最高，有利于后续的纯化。

[0031] S3：向溶液中加入HC1溶液直至将溶液的pH<2.5，收集得到胶状沉淀。当溶液的PH调为小于2.5时，溶液中黑色素溶解度低，极易沉淀下来。优选地，提取过程中利用浓度为2 mol/L HCl溶液调PH为2，溶液中黎豆种皮黑色素溶解度达到最低，提取量最高。

[0032] 纯化方法包括以下步骤：

[0033] S4：将收集到的胶状沉淀悬浮于15-25倍体积的HCl溶液，在沸水浴中水解2-6 h，冷却后离心收集固体颗粒。这能有效分离胶状沉淀与黑色素结合的杂质，并去除一部分能溶于酸的杂质。

[0034] 由于HCl浓度越大,黑色素纯度越高，当HCl浓度过高时,黎豆黑色素的生物活性会受到破坏,而且还会带来不必要的能源损耗，提高成本。优选地，所用HCl溶液浓度为7mol/L，此种条件下分离和溶解杂质的效果最好。

[0035] 优选地，纯化过程中将收集的胶状沉淀悬浮于15倍体积的HCl溶液中水解，此种条件下分离和溶解杂质的效果最好。

[0036] 优选地，纯化过程中沸水浴中水解并冷却后在5000r/min离心10min后，收集固体颗粒。此种条件下获得的固体颗粒的得率最高。

[0037] S5：将收集的固体颗粒依次用乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗涤。这个步骤是用于高效去除固体颗粒中的脂溶性杂质。

[0038] 具体地，将纯化过程中依次将固体颗粒质量的50倍体积的乙醇、乙酸乙酯、丙酮与固体颗粒混合并震荡30min，然后离心分离，这种条件下去除脂溶性杂质的效果最好。

[0039] S6：并在之后利用NaOH溶液和HCL溶液进行多次沉淀，得到黑色素颗粒。

[0040] 上述步骤具体为：将洗涤后的固体颗粒首先用0.5 mol/L NaOH在超声波辅助下溶解30 min，离心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl调节pH 1～2，沉淀1～2 h后离心，然后再次加入NaOH调节至pH 11使固体颗粒溶解，离心取上清液酸化使之沉淀，如此反复沉淀。

[0041] 由于黎豆种皮黑色素在pH 1～2的环境下溶解度最低，以沉淀形式最大程度地析出，而在pH 11时溶解度最高，溶解在溶液上清中。因此，采用上述的条件利用NaOH溶液和HCL溶液进行反复沉淀，能最大程度的去除黎豆种皮黑色素中的剩余杂质，获得高纯度的黎豆种皮黑色素。

[0042] 在纯化后，还可对纯化产物进行以下的处理，进一步提高产物的品质。

[0043] S7：将得到的黑色素颗粒进行冷冻，得到的冷冻后在室温下解冻，用蒸馏水洗涤沉淀，至离心上清液C1－定性检测为阴性后，在室温下真空干燥至恒重，得到黑色素纯品。由于多次沉淀，获得的黑色素颗粒中存在C1－，为避免C1－影响黎豆种皮黑色素的纯度及品质，需要蒸馏水洗涤沉淀去除C1－杂质。

[0044] 为了更详尽的描述本发明的制备方法，以下列举几个实施例更进一步的说明。

[0045] 实施例1

[0046] 本发明提供的黎豆种皮黑色素的提取方法如下：

[0047] 提取过程：将黎豆种皮通过水煮除杂后，按照1∶7.5g/ml的料液比加入0.5mol/L 的NaOH溶液，60℃条件下浸提12h，再加入2 mol/L 的HC1溶液调PH为2，离心收集得到胶状沉淀。

[0048] 纯化过程：将收集到的胶状沉淀悬浮于15倍体积的7mol/L 的HCl溶液，在沸水浴中水解2 h，冷却后在5000r/min条件下离心10min后，收集固体颗粒。

[0049] 依次将固体颗粒质量的50倍体积的乙醇、乙酸乙酯、丙酮与固体颗粒混合并震荡30min，然后离心分离。

[0050] 将洗涤后的固体颗粒首先用0.5 mol/L NaOH在超声波辅助下溶解30 min，离心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl调节pH 1，沉淀1h后离心，然后再次加入NaOH调节至pH 11使固体颗粒溶解，离心取上清液酸化使之沉淀，如此反复沉淀，最后得到黑色素颗粒。

[0051] 将得到的黑色素颗粒冷冻后在室温下解冻，用蒸馏水洗涤沉淀，至离心上清液C1－定性检测为阴性后，在室温下真空干燥至恒重，得到黑色素纯品。

[0052] 实验结果显示，黎豆种皮黑色素的得率有2.49%，黑色素含量纯度为85%。

[0053] 实施例2

[0054] 本发明提供的黎豆种皮黑色素的提取方法如下：

[0055] 提取过程：将黎豆种皮通过水煮除杂后，按照1∶6g/ml的料液比加入0.25mol/L 的NaOH溶液，50℃条件下浸提10h，再加入2 mol/L 的HC1溶液调PH为1，离心收集得到胶状沉淀。

[0056] 纯化过程：将收集到的胶状沉淀悬浮于20倍体积的7mol/L 的HCl溶液，在沸水浴中水解4 h，冷却后在5000r/min条件下离心10min后，收集固体颗粒。

[0057] 依次将固体颗粒质量的50倍体积的乙醇、乙酸乙酯、丙酮与固体颗粒混合并震荡25min，然后离心分离。

[0058] 将洗涤后的固体颗粒首先用0.5 mol/L NaOH在超声波辅助下溶解30 min，离心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl调节pH 1，沉淀1h后离心，然后再次加入NaOH调节至pH 11使固体颗粒溶解，离心取上清液酸化使之沉淀，如此反复沉淀，最后得到黑色素颗粒。

[0059] 将得到的黑色素颗粒冷冻后在室温下解冻，用蒸馏水洗涤沉淀，至离心上清液C1－定性检测为阴性后，在室温下真空干燥至恒重，得到黑色素纯品。

[0060] 实验结果显示，黎豆种皮黑色素的得率有2.33%，黑色素含量纯度为83%。

[0061] 实施例3

[0062] 本发明提供的黎豆种皮黑色素的提取方法如下：

[0063] 提取过程：将黎豆种皮通过水煮除杂后，按照1∶9g/ml的料液比加入1mol/L 的NaOH溶液，70℃条件下浸提14h，再加入2 mol/L 的HC1溶液调PH为2，离心收集得到胶状沉淀。

[0064] 纯化过程：将收集到的胶状沉淀悬浮于25倍体积的7mol/L 的HCl溶液，在沸水浴中水解6h，冷却后在5000r/min条件下离心10min后，收集固体颗粒。

[0065] 依次将固体颗粒质量的50倍体积的乙醇、乙酸乙酯、丙酮与固体颗粒混合并震荡35min，然后离心分离。

[0066] 将洗涤后的固体颗粒首先用0.5 mol/L NaOH在超声波辅助下溶解30 min，离心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl调节pH 1，沉淀1h后离心，然后再次加入NaOH调节至pH 11使固体颗粒溶解，离心取上清液酸化使之沉淀，如此反复沉淀，最后得到黑色素颗粒。

[0067] 将得到的黑色素颗粒冷冻后在室温下解冻，用蒸馏水洗涤沉淀，至离心上清液C1－定性检测为阴性后，在室温下真空干燥至恒重，得到黑色素纯品。

[0068] 实验结果显示，黎豆种皮黑色素的得率有2.28%，黑色素含量纯度为81%。

[0069] 本发明提供的黎豆种皮黑色素的提取方法不仅操作简单，黎豆种皮黑色素的提取量高并且纯度高，黑色素氧化程度低，提取周期短，此外成本低廉，适合用于进行黎豆种皮黑色素的大规模提取，提高了黎豆的经济价值，拓宽了黎豆的应用领域。

[0070] 应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。