一种检测TaAGPL基因等位变异的方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测TaAGPL基因等位变异的引物对及试剂盒，和检测方法。引物对为如下1）或2）所示的引物对：1）SEQ ID：1，SEQ ID：3；2）SEQ ID：2，SEQ ID：3。利用该引物对进行PCR反应，可以简便而有效地鉴定普通小麦小麦胞质型腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的等位变异。本发明方法通过常规的PCR仪和DNA分析仪就可以完成，易于操作，简便而且具有很高的通量。

权利要求

1.一种用于检测TaAGPL基因等位变异的引物对，其特征在于，所述引物对序列如下：

1）SEQ ID：1和SEQ ID：3，或2）SEQ ID：2和SEQ ID：3所示。

2.一种用于检测TaAGPL基因等位变异的试剂盒，其特征在于，其包括如下1）或2）所示的引物对：

1）SEQ ID：1和SEQ ID：3，或2）SEQ ID：2和SEQ ID：3。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述TaAGPL基因为小麦腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述小麦腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因为小麦胞质型腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因。

5.一种检测TaAGPL基因等位变异的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

1）根据TaAGPL基因核苷酸序列的外显子I区与外显子II区序列的保守区域设计引物对；

2）用步骤1）得到的引物对对待测材料进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

3）检测所述PCR扩增产物的多态性，根据所述PCR扩增产物的多态性确定所述待测材料中待测TaAGPL基因的等位变异类型；

其中，所述引物对为如下①或②所示：

①SEQ ID：1和SEQ ID：3；

②SEQ ID：2和SEQ ID：3。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述TaAGPL基因为小麦腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因；所述多态性为长度多态性。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述小麦腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因为小麦胞质型腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因。

8.根据权利要求5-6中任一所述的方法，其特征在于：所述待测材料为小麦。

说明书

一种检测TaAGPL基因等位变异的方法及试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种检测TaAGPL基因等位变异的方法及试剂盒。

背景技术

[0002] 小麦是异源六倍体，在进化中由3个染色体组杂交形成，包含A、B和D共3套染色体组(AABBDD，2n＝6x＝42)。但是A、B与D染色体组之间有大量基因的重复，加上小麦中的重复序列占基因组约80％，特别是针对控制某一重要性状基因的分离鉴定及功能研究容易受到不同染色体的同源基因的影响，阻碍了小麦遗传学及育种改良研究的发展。小麦是世界上最重要的三大粮食作物(小麦、水稻和玉米)之一，世界上每年总产量达到6亿吨以上(http://faostat.fao.org/)。虽然小麦在我国种植面积与总产量居世界首位，但是小麦年均消费量和进口量也是占到很大比例。因此，产量依然是我国小麦育种过程中的一个重要的衡量指标。

[0003] 小麦的产量构成除了栽培(包括光照、温度、肥力)等外界条件影响外，小麦自身的基因型起到了决定性作用；而构成小麦面粉重要的成分是淀粉，淀粉在籽粒开始形成时在胚乳中逐渐积累，因此淀粉合成的多少与籽粒重量有直接的联系。腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase)在植物体内催化由蔗糖得到的葡萄糖-1-磷酸(G-l-P)与ATP反应形成腺苷二磷酸葡萄糖(ADP-glucose)并释放Pi，而ADP-glucose作为淀粉合成酶的底物参与直链淀粉和支链淀粉的合成，是水稻、小麦、玉米、马铃薯等作物淀粉合成的关键酶，其活性大小与淀粉积累速率和灌浆速率呈正相关。小麦淀粉合成关键酶活性及其与子粒淀粉积累速率关系的研究也表明：AGPase活性与直链淀粉、支链淀粉、总淀粉的积累速率及灌浆速率呈极显著正相关。于振文等研究表明，开花后7天、14天、2l天、28天和35天小麦籽粒AGPase活性与各期总淀粉积累速率均呈显著或极显著正相关。

[0004] 小麦等禾谷类作物的胚乳中有两种不同形式的AGPase，它们分别是胞质的和质体的，其中胞质形式占65％～95％的活性，因此胞质体型的AGPase在淀粉合成中起到重要作用。AGPase由两个相同的大亚基和两个相同小亚基组成，其中大亚基(AGPase Large subunit,AGPL)是主要的催化作用调节中心，直接影响淀粉合成底物形成的速率。Olive等利用探针杂交筛选文库的方法得到了小麦中的AGPL基因序列，Ainsworth等利用Southern杂交方法将小麦AGPL基因定位到1A、1B和1D染色体上，Smidansky等将控制合成玉米AGPL的Shunken2(Sh2r6hs)基因进行了修改，改变了AGPL蛋白的变构调节位点氨基酸，增强了AGPase大小亚基的结合稳定性，转入小麦后，小麦产量和总生物量得到增加。早期主要针对TaAGPL基因染色体定位、表达水平的高低与淀粉含量及合成速率的相关性进行了研究，使得对TaAGPL基因表达在小麦籽粒发育过程动态变化和有了丰富的认识。而对小麦中TaAGPL基因在A、B和D三个基因组中的差异及在群体材料中等位变异的分布和相关功能研究甚少，这极大阻碍了对小麦淀粉合成关键基因TaAGPL的不同等位变异与产量相关性状的研究。

发明内容

[0005] 本发明的目的是为解决普通小麦淀粉合成途径中AGPase基因的等位变异检测的技术问题，提供一种检测小麦TaAGPL基因等位变异的方法及提供优势等位变异用于分子标记辅助选择育种。

[0006] 本发明所提供的辅助检测小麦TaAGPL基因等位变异的方法，包括如下步骤：

[0007] 1)根据TaAGPL基因核苷酸序列的外显子I区与外显子II区序列的保守区域设计引物对，外显子I区与外显子II区之间包含的内含子I序列在不同染色体组之间具有多态性，所述引物对中的一条序列位于所述外显子I区中，所述引物对另一条引物序列位于所述外显子II区中；

[0008] 2)用步骤1)得到的引物对对待测材料进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

[0009] 3)检测所述PCR扩增产物的多态性，根据所述PCR扩增产物的多态性确定所述待测材料中TaAGPL基因等位变异类型。

[0010] 上述方法中，所述TaAGPL基因为小麦腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因。

[0011] 上述方法中，所述多态性为长度多态性。

[0012] 上述方法中，所述小麦腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因为小麦胞质型腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因。

[0013] 上述方法中，所述外显子I区和外显子II区之间的序列具有插入缺失造成的长度差异序列。

[0014] 上述方法中，所述待测材料为小麦。

[0015] 上述方法中，所述引物对为如下1)或2)所示：

[0016] 1)SEQ ID：1和SEQ ID：3；

[0017] 2)SEQ ID：2和SEQ ID：3。

[0018] 上述方法中，所述根据PCR扩增产物的多态性确定所述待测材料中待测TaAGPL基因的等位变异的方法为：将所述PCR扩增产物的长度作为所述TaAGPL基因的等位变异类型(即一种长度的PCR扩增产物对应一种基因的等位变异)。

[0019] 所述检测PCR扩增产物的长度多态性的方法为如下Ⅰ或Ⅱ所示：

[0020] Ⅰ、用DNA分析仪对所述PCR扩增产物长度进行检测，检测到的信号峰的所在位置即为所述PCR扩增产物的长度；所述引物对用荧光基团标记；

[0021] Ⅱ、对所述PCR扩增产物进行测序。

[0022] 本发明的另一个目的是提供一种检测TaAGPL基因等位变异的试剂盒[0023] 本发明所提供的检测TaAGPL基因等位变异的试剂盒，为如下1)或2)所示的引物对：

[0024] 1)SEQ ID：1，SEQ ID：3；

[0025] 2)SEQ ID：2，SEQ ID：3；

[0026] 上述试剂盒中，所述TaAGPL基因为小麦腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因。

[0027] 上述试剂盒中，所述小麦腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因为小麦胞质型腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因。

[0028] 本发明具有以下有益效果：本发明为解决普通小麦淀粉合成途径中AGPase基因的等位变异检测的技术问题，提供一种检测方法，有助于快速的鉴定小麦TaAGPL基因变异类型及应用于分子标记辅助育种。该方法基于普通小麦品种中TaAGPL基因的特点：序列间区域保守性及长度多态性(即外显子的序列具有很高的保守性，内含子的序列又具有很高的长度多态性)，在外显子区域设计保守的PCR引物，通过PCR的方法扩增得到TaGAPL基因的DNA片段，通过一定的鉴定方法(3730DNA分析仪)来展示这些片段之间的多态性，进而可以达到鉴定一个小麦品种中TaAGPL基因等位变异的目的。应用该策略可以建立基因分子标记检测体系，对TaAGPL基因进行有效的分离鉴定，也可以对其他杂交后代群体的TaAGPL基因的等位变异类型进行鉴定；这种分子标记体系构建策略也可以进一步推广到对具有类似的序列保守性和长度多态性的功能基因的等位变异的分离鉴定。

[0029] 本发明方法中，根据实验室前期研究的结果以及Genbank中的TaAGPL基因序列所设计的引物，用保守引物进行TaAGPL基因分离鉴定的验证试验证明了该引物的保守性和有效性，也表明了该分子标记体系的准确性和可靠性。

[0030] 本发明方法无需昂贵的仪器和试剂，通过常规的PCR仪和3730DNA分析仪就可以完成，易于操作。本发明方法基于3730DNA分析仪极高的灵敏度和分辨率，可以有效分离并准确鉴定TaAGPL基因不同的等位变异。在本发明方法中，通过一次PCR反应可以检测一个小麦品种中A、B和D组的基因，而且PCR仪和3730DNA分析仪都是自动化和高通量的仪器，一人一天可以分析近三百个小麦品种。本发明方法极大地提高了TaAGPL基因鉴定的效率和准确性。

[0031] 本发明的基于序列保守性和长度多态性的分子标记构建策略，不仅适用于TaAGPL基因分子标记检测体系的构建，同样适用于具有序列保守性和长度多态性的控制重要性状基因的分子标记检测体系的构建。该发明将直接促进TaAGPL基因的等位变异挖掘以及TaAGPL基因对小麦淀粉合成、产量贡献等研究的深入开展。

附图说明

[0032] 图1普通小麦小偃54TaAGPL的核苷酸序列比对示意图。

[0033] 不同背景颜色表示不同的核苷酸相似性。图中背景颜色越深表示核苷酸相似性越高。黑色：核苷酸相似性为100％；深灰色：核苷酸相似性为50％；灰色：核苷酸相似性为30％；白色：核苷酸相似性为0％。

[0034] 图2普通小麦小偃54TaAGPL外显子I与外显子II上引物的位置。

[0035] Exon I,外显子I区；Intron I，内含子I区；Exon II，外显子II区；内含子I(Intron I)中存在插入缺失造成的长度变异。

[0036] 保守引物对为：TaAGPL1由F1g-FAM和R2a-common组成；TaAGPL2由F1h-FAM和R2a-common组成。

[0037] 图3利用保守引物在中国春缺体四体材料中的产物片段分析，利用3730DNA分析仪检测PCR产物，纵轴表示DNA片段大小，横轴表示信号强度，即PCR产物量的多少。图中的箭头所示为PCR产物中的特异DNA片段，对应着一个特异的TaAGPL等位变异，剩余的峰表示分子量标准(LIZ500Standard内标)。

[0038] CS，小麦品种中国春；CSN1AT1D，小麦品种中国春缺体1A四体1D；CSN1BT1D，小麦品种中国春缺体1B四体1D；CSN1DT1B，小麦品种中国春缺体1D四体1B，1A、1B和1D分别表示小麦染色体1A、1B和1D。

[0039] 图4利用保守引物在小麦微核心种质库中检测到的TaAGPL基因的等位变异。利用3730DNA分析仪检测PCR产物。横轴表示DNA片段大小，纵轴表示信号强度，即PCR产物的量的多少；图中的箭头表示PCR产物中的特异DNA片段，对应着一个特异的TaAGPL基因等位变异，长度为314和320的峰表示分子量标准(LIZ500Standard内标)。

[0040] 图5小麦微核心种质库中检测到TaAGPL-1B的五种等位变异的序列验证及多序列比对。

[0041] 断线框住的序列为一个串联重复序列(A)n，加上一种TaAGPL-1A和一种TaAGPL-1D等位变异，共7种TaAGPL基因的等位变异。

[0042] TaAGPL-1B基因每种等位变异分别用线框住。

[0043] 材料名称：Xiaoyan54，小偃54；Dahuangpi，大黄皮；Jimai10-2893冀麦10号；Heshangmai-Yu8679RIL93，和尚麦/豫8679RIL-93；Heshangmai-Yu8679RIL110，和尚麦/豫
8679RIL-110；Shannong01-35，山农01-35；Yu8679，豫8679；Heshangmai-Yu8679RIL22，和尚麦/豫8679RIL-22；Heshangmai-Yu8679RIL41，和尚麦/豫8679RIL-41；Linyou145，临优145；
HanF5-4，韩F5-4；Hongqiangchang，红抢场；Taikongmai，太空麦；Luyuang212，鲁原212；
B1924，B1924；E_en1，鄂恩1号；Lanhuamai，兰花麦；Beijingyemaizi2，北京野麦子2；
Hengshuiyemaizi1，衡水野麦子1；Baodingyemaizi2，保定野麦子2；Jinchun3，晋春3号；
Baihuamai，白花麦；Yunong202，豫农202。

具体实施方式

[0044] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0045] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0046] 实施例1、检测小麦品种中国春中TaAGPL基因等位变异及进行染色体定位[0047] 一、引物设计

[0048] 首先利用MegAlign软件将普通小麦小偃54的TaAGPL的核苷酸(包括cDNA及基因组DNA)序列进行多序列比对，发现在这些基因序列存在两个特点：(1)三个同源基因TaAGPL-1A、TaAGPL-1B和TaAGPL-1D，外显子区域非常保守；(2)内含子区域包含丰富的长度多态性和SNP差异(图1)。由图1发现，在第一内含子(Intron I)中在基因TaAGPL-1A、TaAGPL-1B和TaAGPL-1D之间存在长度差异(表1)。基于这两个特点，提出了一种鉴定TaAGPL基因检测策略：根据保守的区域的编码序列设计基因间保守的PCR引物，通过PCR的方法扩增得到这些TaAGPL基因的DNA片段，然后检测(利用3730DNA分析仪)展示这些DNA片段之间的多态性，进而实现对一个小麦品种中所有TaAGPL基因的分离鉴定。

[0049] 将小偃54中的TaAGPL基因进行了多序列比对，根据其保守的区域(外显子I和外显子II)的编码序列设计PCR引物。为了提高实验的重复性和准确度，设计了2套PCR引物，分别是TaAGPL1(上游引物核苷酸序列如SEQ ID：1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID：3所示)和TaAGPL2(上游引物核苷酸序列如SEQ ID：2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID：3所示)。TaAGPL1和TaAGPL2均有一条通用引物和分别的上游引物，都跨越Intron I(图2)，利用两对引物在小偃54进行扩增，对于TaAGPL-1A基因，目的片段长度分别为330bp和253bp，3730DNA分析仪实际检测长度为323bp和248bp；对于TaGAPL-1D基因，目的片段理论长度为335bp和
258bp，3730DNA分析仪实际检测长度为327bp和253bp；对于TaAGPL-1B基因，目的片段理论长度片段长度为320bp和243bp，3730DNA分析仪实际检测长度为312bp和238bp(表2)。这两套保守引物的所得到的检测结果可以相互验证。以下以片段长度命名的等位变异都以TaAGPL1组合扩增的长度为依据。

[0050] 为了验证引物的保守性，将小偃54中的TaAGPL基因与大麦、玉米和水稻中的AGPL进行了多序列比对，对引物序列进行比对搜索，发现引物F1g-FAM、F1h-FAM与大麦、小麦种的序列一致，与玉米和水稻的AGPL序列存在SNP差异；而R2a-common在所有使用的序列中都一样。说明这两套引物在鉴定小麦TaAGPL基因上具有很高的代表性。最终所得到的引物序列(表3)。

[0051] 表1 小偃54中TaAGPL基因的Intron I长度在三个基因组间多态性

[0052]

[0053] 表2 基于小偃54TaAGPL基因序列设计的引物位置及理论片段长度。引物起始位置是从ATG开始算起。

[0054]

[0055] 表3 TaAGPL基因保守引物序列

[0056]

[0057] 注：*表示的是该引物5’端G碱基被6FAM标记。

[0058] 二、PCR扩增

[0059] 小麦品种中国春及其缺体四体材料来自中国科学院遗传与发育生物学研究所植物细胞与染色体工程国家重点实验室，其中中国春购自河南舞阳县种子公司。。

[0060] CS，小麦品种中国春；CSN1AT1D，小麦品种中国春1A缺体1D四体；CSN1BT1D，小麦品种中国春1B缺体1D四体；CSN1DT1B，小麦品种中国春1D缺体1B四体。

[0061] 利用表3中的引物以中国春及其缺体四体材料幼苗的基因组DNA为模板进行PCR，反应体系如下：

[0062]

[0063] 由于琼脂糖电泳的分辨率比较低，无法充分展示PCR产物的长度多态性。为了进一步检测PCR产物的组成，采用3730DNA分析仪，该仪器具有很高的分辨率，可达1bp，已被广泛应用于DNA片段分析研究中，例如微卫星标记、扩增片段长度多态性和DNA足迹分析。

[0064] 三、PCR扩增产物的A、B和D基因组定位

[0065] 用蒸馏水将PCR产物稀释为原浓度的1/40，取稀释产物5μL到一个新的96孔板中，加入5μL 37.5mM的EDTA、5μL 900mM的醋酸钠和37.5μL100％的乙醇，混匀后避光静置15分钟，2000g离心35分钟，倒置PCR板离心至180g停止，加入52.5μL70％的乙醇，倒置PCR板离心至180g停止，再加入52.5μL70％的乙醇，倒置PCR板离心至180g停止，风干后，每孔再加入8μL甲酰胺(含有0.1μL LIZ-500size standard)(ABI公司产品)，将混合物在95℃条件下变性5分钟，然后在冰上静置10分钟。

[0066] 利用3730DNA分析仪对变性的PCR产物进行检测，检测结果如图3。利用GeneMapper v4.0软件分析检测到的信号峰所对应的DNA片段大小(表4)。在中国春中可以发现保守引物TaAGPL1和TaAGPL2的PCR产物均分别可检测到3个信号峰，且两套引物PCR结果相互对应，即两套保守引物的PCR产物检测图谱之间存在很高的一致性。利用本发明的方法可以从CS中检测到3个信号峰，即3个DNA片段；可以从CSN1AT1D、CSN1BT1D和CSN1DT1B中分别各检测到2个信号峰，每个系缺失的峰对应材料所缺失的染色体，所以将312与238、323与248、327与253分别定位到1B、1A和1D上(表)，且检测结果与小偃54材料中扩增的片段大小相对应(表)。

[0067] 表4 利用分子标记体系从中国春及其缺体四体材料中实际检测到DNA片段的验证[0068]

[0069] 注：N表示DNA目的条带缺失

[0070] 实施例2、检测其他小麦品种TaAGPL基因等位变异

[0071] 利用本发明方法已经有效分析了小麦育种中的骨干亲本(200多份)、现代品种和品系的TaAGPL等位变异类型，用于指导分子育种实践，挑取23份不同等位变异的材料进行了展示及基于PCR的测序验证。

[0072] 一、引物设计

[0073] 采用实施例1中所设计的两对TaAGPL基因保守引物(表3)。

[0074] 二、PCR扩增

[0075] 利用常规的CTAB法提取基因组DNA。

[0076] 利用表1的引物以基因组DNA为模板进行PCR，反应体系如下：

[0077]

[0078] 三、PCR扩增产物种类检测

[0079] 用ddH2O将PCR产物稀释为原浓度的1/40，取稀释产物5μL到一个新的96孔板中，加入5μL 37.5mM的EDTA、5μL 900mM的醋酸钠和37.5μL100％的乙醇，混匀后避光静置15分钟，2000g离心35分钟，倒置PCR板离心至180g停止，加入52.5μL70％的乙醇，倒置PCR板离心至
180g停止，再加入52.5μL70％的乙醇，倒置PCR板离心至180g停止，风干后，每孔再加入8μL甲酰胺(含有0.1μL LIZ-500size standard)(ABI公司产品)，将混合物在95℃条件下变性5分钟，然后在冰上静置10分钟。

[0080] 利用3730DNA分析仪对变性的PCR产物进行检测，检测结果用GeneMapper v4.0进行分析。在262份骨干亲本中共检测到B组等位变异5种，以长度命名为TaAGPL-1B-307，TaAGPL-1B-308，TaAGPL-1B-311，TaAGPL-1B-312，TaAGPL-1B-313，A和D组分别各检测到1种等位变异，TaAGPL-1A-323，TaAGPL-1B-327。筛选45份现代品种或品系，挑取23种作为展示不同的等位变异，如表5所示。由此也说明，TaAGPL-1A和TaAGPL-1D在小麦中的多态性比较低；而TaAGPL-1B则存在丰富的等位变异。

[0081] 表5 挑取23份材料的具有5种不同等位变异结果进行展示

[0082]

[0083] 四、利用TaAGPL不同等位变异的PCR-Sanger法测序验证分析

[0084] 检测到的信号峰所对应的DNA片段大小整理在表5中。将这些材料的PCR产物进行测序后多序列比对(图5)。结果发现，长度的多态性是由不同材料中腺嘌呤脱氧核苷酸A的串联重复次数不同造成的，根据测序结果判定基因的长度多态性与3730DNA分析仪判定的基因片段长度多态性的结果一致，即用测序方法检测出的基因种类数目结果与用3730DNA分析仪方法检测出的基因种类数目是一致的。证明了通过本发明可以精确的鉴定小麦材料中的TaAGPL基因的类型。

[0085] 五、不同等位变异与千粒重的关联分析

[0086] TaAGPL是控制小麦淀粉合成的关键酶的基因，籽粒中淀粉的积累量部分决定了小麦籽粒的千粒重。为了研究这个基因的等位变异是否与千粒重性状相关，对262份小麦骨干材料的三年千粒重数据进行了关联分析。因为基因TaAGPL-1A和TaAGPL-1D等位变异在群体各只有一种等位变异，所以以下分析的等位变异均来自于基因TaAGPL-1B。

[0087] 首先对材料利用本发明中的方法进行基因型鉴定，对群体材料中的5种等位变异类型出现的频率进行了分析。结果发现，具有TaAGPL-1B-312等位变异的材料出现频率最高(143份)，而具有TaAGPL-1B-307与TaAGPL-1B-313等位变异的材料出现频率最少(各9份)。将检测材料按照地方品种和现代品种进行分类之后，发现具有TaAGPL-1B-308等位变异的材料中现代品种占的比例最高(86.67％)，同时发现虽然在具有TaAGPL-1B-312等位变异的材料中现代品种占的比例不高(34.34％)，但是由于具有TaAGPL-1B-312等位变异的材料数目也很多，所以现代品种的数目却是最多的；具有TaAGPL-1B-311等位变异的材料中现代品种中占的比例最低(19.35％)(表6)。以上分析结果说明：1)TaAGPL-1B-308是TaAGPL-1B基因的一个优异等位基因，在现代育种进程中得到了选择，而TaAGPL-1B-311是一个劣势等位基因，具有TaAGPL-1B-311等位变异的表型在育种中被人工筛选掉了，造成了现代品种中这个等位变异的频率很低；2)TaAGPL-1B-312等位变异中还可能存在除长度多态性外的其他变异类型。总之，以上说明TaAGPL基因育种过程中已经经过了人工选择。

[0088] 根据等位变异类型分类，对群体的三年千粒重数据进行了分析，比较了不同年份下，不同等位变异类型的之间的千粒重的平均数差异，采用方法为最小显著差数法(LSD)进行多重比较。结果发现，具有TaAGPL-1B-308等位变异的材料的千粒重的三年数据都表现为高于具有其他等位变异的材料。并且显著的高于具有TaAGPL-1B-311等位变异的材料。而具有其他等位变异材料的千粒重也都普遍高于具有TaAGPL-1B-311材料(表7)。以上可以说明，1)TaAGPL-1B-308等位变异作为控制千粒重的优异等位变异被人工选择遗传下来，而TaAGPL-1B-311等位变异被逐步人工选择淘汰；2)虽然TaAGPL-1B-308等位变异没有在现代品种中出现很高的频率，但是这点正好说明千粒重是一个复杂的性状，可能不是仅仅由TaAGPL基因控制，而与其他基因位点的综合作用下构成了千粒重的因素，但是TaAGPL基因在众多基因中起到了关键的作用，这点可以由TaAGPL在育种过程中被人工选择所解释。

[0089] 总之利用本发明首先设计了两套TaAGPL基因的保守引物对，通过高通量3730DNA分析仪，能够将扩增片段323、312和327分别定位到了A、B和D基因组上，这两套引物相互可以验证；利用保守引物分析了小麦骨干亲本材料及现代品种或品系材料，发现了TaAGPL-1A、TaAGPL-1B和TaAGPL-1D分别有1个、5个和1个等位变异，并且通过对不同等位变异材料PCR-Sanger法测序对长度多态性进行了验证。分析检测材料的三年重复的千粒重数据，证明了TaAGPL-1B-308等位变异与高千粒重相关，在育种过程中受到了正选择，而TaAGPL-1B-
311受到了负选择，说明所开发的标记体系可以用于指导千粒重相关的分子育种实践，为育种家提供一种高效检测方法。

[0090] 表6 不同等位变异的分布频率

[0091]

[0092] 注：-表示基因型缺失。

[0093] 表7 TaAGPL-1B等位变异与千粒重的关联分析

[0094]

[0095] 注：每个“平均值±标准差”的上标小写字母表示在α＝0.05显著水平下多重比较结果。