体外诊断结肠直肠癌的白细胞弹性蛋白酶抑制剂测定方法转让专利
申请号 : CN201610357367.8
文献号 : CN105954515B
文献日 : 2019-02-22
发明人 : C·博利厄 , J-P·沙里耶 , G·肖凯-凯斯狄拉维斯基 , O·梅让-勒图尔纳 , D·罗兰
申请人 : 生物梅里埃公司
摘要 :
本发明涉及通过确定得自疑似患有结肠直肠癌的患者的生物学样品中白细胞弹性蛋白酶抑制剂肿瘤标记物的存在而体外诊断结肠直肠癌的方法。所述方法可用于结肠直肠癌的早期诊断、筛选、治疗随诊以及预后，以及用于结肠直肠癌的复发诊断。
权利要求 :
1.检测白细胞弹性蛋白酶抑制剂、β2-微球蛋白、酰化氨基酸水解酶1和CEA标记物的试剂在制备通过确定得自疑似患有结肠直肠癌的患者的生物学样品中白细胞弹性蛋白酶抑制剂、β2-微球蛋白、酰化氨基酸水解酶1和CEA标记物的存在而体外诊断、早期诊断、筛选、治疗随诊以及复发诊断结肠直肠癌的试剂盒中的用途。
2.权利要求1的用途，特征在于所述生物学样品是远离肿瘤的样品。
3.权利要求1或2的用途，特征在于所述试剂盒还包括确定选自如下标记物的至少一种其它肿瘤标记物的存在的至少一种其他试剂：埃兹蛋白、肝脂肪酸结合蛋白、肠脂肪酸结合蛋白、载脂蛋白AI、载脂蛋白AII和I-丝束蛋白。
4.权利要求1或2的用途，特征在于所述试剂盒还包括确定选自如下标记物的至少一种其它肿瘤标记物的存在的至少一种其他试剂：蛋白酶体20S、半乳凝素-3、L-乳酸脱氢酶B链、钙网蛋白、再生胰岛衍生蛋白3α、肿瘤相关钙离子信号传导蛋白1、细胞骨架角蛋白II型
8、细胞骨架角蛋白I型18、细胞骨架角蛋白I型19、上皮钙粘蛋白、绒毛蛋白、CA19-9、CA
242、CA 50、CA 72-2、睾酮、TIMP-1、Cripto-1、Intelectin-1、蛋白质二硫键异构酶、细胞角蛋白20、翻译控制的肿瘤蛋白、防卫素-A5、防卫素原-A5、防卫素原-A5裂解后的N末端部分；
血液中甲基化DNA；粪便DNA片段中特异性改变，以及粪便人血红蛋白。
5.权利要求4的用途，特征在于所述血液中甲基化DNA为AXL4基因的甲基化DNA或者septin-9基因的甲基化DNA。
6.权利要求4的用途，特征在于所述粪便DNA片段中特异性改变为粪便DNA的特异性突变或者粪便DNA的甲基化模式的特异性改变。
7.权利要求3的用途，特征在于所述试剂盒还包括确定选自如下标记物的至少一种其它肿瘤标记物的存在的至少一种其他试剂：蛋白酶体20S、半乳凝素-3、L-乳酸脱氢酶B链、钙网蛋白、再生胰岛衍生蛋白3α、肿瘤相关钙离子信号传导蛋白1、细胞骨架角蛋白II型8、细胞骨架角蛋白I型18、细胞骨架角蛋白I型19、上皮钙粘蛋白、绒毛蛋白、CA19-9、CA 242、CA 50、CA 72-2、睾酮、TIMP-1、Cripto-1、Intelectin-1、蛋白质二硫键异构酶、细胞角蛋白
20、翻译控制的肿瘤蛋白、防卫素-A5、防卫素原-A5、防卫素原-A5裂解后的N末端部分；血液中甲基化DNA；粪便DNA片段中特异性改变，以及粪便人血红蛋白。
8.权利要求7的用途，特征在于所述血液中甲基化DNA为AXL4基因的甲基化DNA或者septin-9基因的甲基化DNA。
9.权利要求7的用途，特征在于所述粪便DNA片段中特异性改变为粪便DNA的特异性突变或者粪便DNA的甲基化模式的特异性改变。
说明书 :
体外诊断结肠直肠癌的白细胞弹性蛋白酶抑制剂测定方法
[0001] 本申请是申请日为2008年7月10日的第200880025227.4号发明名称为“体外诊断结肠直肠癌的白细胞弹性蛋白酶抑制剂测定方法”的中国专利申请的分案申请。
[0002] 本发明涉及癌学领域。更特别地，本发明提供了通过确定取自患者的生物学样品中白细胞弹性蛋白酶抑制剂(LEI)的存在而体外诊断人类患者中的结肠直肠癌的方法，所述方法可用于早期诊断、筛选、治疗随诊以及预后，还可用于结肠直肠癌的复发诊断。
[0003] 结肠直肠癌(CRC)是主要的公共健康问题。据估计1996年其在世界范围的新发病例为875 000例1。考虑到男女性别，其是最常在西方国家发生的癌症，其通常被分类为癌症所致死亡的前3个主要因素之一。考虑到所有阶段，5年存活率在60％范围内。
[0004] 只有早期诊断才能赋予治愈性治疗的希望。然而，目前还没有血清学筛选检验，也没有早期特异性诊断检验方法。
[0005] 目前在欧洲使用两种不同方法筛选结肠直肠癌：首先，使用临床异常性(paraclinical)检验，其包括检查粪便中是否存在血(Faecal Occult Blood Test-FOBT，例如以 名称销售)。已经证实这个技术的临床实用性。当每2年对在50-74岁之
间的个体使用该技术时，可以使结肠直肠癌导致的死亡率降低15-20％2。为此，一半以上的人群必须定期参与筛选，且必须对阳性检验事件进行结肠镜检查，任选随后进行适当治疗。
间的个体使用该技术时，可以使结肠直肠癌导致的死亡率降低15-20％2。为此，一半以上的人群必须定期参与筛选，且必须对阳性检验事件进行结肠镜检查，任选随后进行适当治疗。
[0006] 然而，这种筛选技术具有如下一些不利之处：
[0007] ·这个检验的主要缺点是其特别是对于腺瘤(癌前异常增生(dysplastic)病变)的灵敏性较差，如果腺瘤较大，将导致1/10的病例发展为癌症。
[0008] ·这个检验也不是非常特异性的。粪便中出现血可以与非肿瘤病变相关：溃疡性结肠炎、痔疮、肛瘘等。在这种情况中，必须进行结肠镜检查，结肠镜检查的缺点在后文描述。
[0009] ·最后， 检验难以解释；因此其必须在专业中心由有资格的能胜任的人员诠释。
[0010] 也已经描述了特异于人血红蛋白的免疫学检验(Feca Heme 等)。与相比，它们大概有进步，但是基本上还存在相同问题。因此，由Enterix公司销
售的InSureTM使得可以检测87％患有CRC的患者，以及47％具有癌前息肉的患者。这是一种检测粪便中人血红蛋白、特别是检测这个分子中的珠蛋白部分的检验方法。
售的InSureTM使得可以检测87％患有CRC的患者，以及47％具有癌前息肉的患者。这是一种检测粪便中人血红蛋白、特别是检测这个分子中的珠蛋白部分的检验方法。
[0011] 第二种筛选方法是在50岁以后对人系统进行结肠镜检查，这样在理论上可以降低由于结肠直肠癌所致死亡率。然而，对于使用内窥镜进行筛选的政策，健康个体对这种检查的可接受性太低而不能降低死亡率(已经建立这个筛选计划的欧洲国家结肠镜检查的顺从水平是大约2％)。结肠镜检查存在并非不显著的结肠穿孔和出血(0.1％)及死亡(1/10 000)的风险，而且对于公共卫生事业也是非常昂贵的。此外，结肠镜检查需要非常严格的预先结肠准备，这在很大程度上解释了顺从性不佳的原因。
[0012] 长久以来已经描述了可以通过免疫测定化验结肠直肠癌的肿瘤标记物。所述肿瘤标记物特别是癌胚抗原(CEA)和CA19-9。
[0013] CEA用于随诊。由于其灵敏性和特异性不足而不可用于筛选或者早期诊断结肠直肠癌。这是因为该标记物由其它类型癌症及在良性病变中表达。无论如何，通过组合CEA与另一种肿瘤标记物如CA19-9或CA72-4可以增加灵敏性而不丧失其特异性。
[0014] CA19-9的生理学改变的原因很罕见，但是其它良性病变(肝胆病症、胰腺病症)或者恶性病症可以导致CA19-9增高。因此，单独这个标记物对于诊断也无意义。然而，由于其血清浓度与肿瘤的大小和存在转移瘤相关，因此其也可以用于治疗随诊或者早期证实复发。
[0015] 另外，已经提议可商购的检验，如：
[0016] 由Ambrilia销售，其是一种快速且相对非侵入性CRC的筛选检验。 检测患有结肠直肠病变个体的直肠粘液中的缩醛磷脂(是磷
脂的一部分的复合脂质)，而ColorectAlertMD检测直肠粘液中的一种复合糖，即T-抗原。
检验包括将直肠粘液涂于检验条带上，阳性或阴性结果基于
Schiff反应。Ambrilia已经研究了1787个个体，证实 检测出
54％的早期结肠直肠癌病例和49％所有阶段组合病例。
脂的一部分的复合脂质)，而ColorectAlertMD检测直肠粘液中的一种复合糖，即T-抗原。
检验包括将直肠粘液涂于检验条带上，阳性或阴性结果基于
Schiff反应。Ambrilia已经研究了1787个个体，证实 检测出
54％的早期结肠直肠癌病例和49％所有阶段组合病例。
[0017] COLARIS，由Myriad Genetics销售，是在血液中检测MLH1和MSH2基因突变以筛选遗传性非息肉性结肠癌(HNPCC综合征)。该检验的结果在3周内获得。Myriad使用目前可利用的最灵敏和最特异性的测序技术。该检验成本昂贵。
[0018] 由AMDL销售，是一种筛选各种类型癌症(肺癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等)的检验。因此其对于CRC不具有特异性。该检验的原理是基于双夹心ELISA技术(测定DR-70抗原)。通过酶反应(抗体与生物素或者链霉抗生物素蛋白结合)进行揭示。生色反应表示癌症的存在。
[0019] 本申请人令人惊奇地证实一种新的肿瘤标记物，其由结肠肿瘤释放至癌组织之外，且是这些肿瘤的特征，由此可以在远离肿瘤的生物学样品及在肿瘤自身中检测到。
[0020] 因此，本发明第一方面是体外诊断结肠直肠癌的方法，其通过确定取自疑似患有结肠直肠癌的患者的生物学样品、优选远离肿瘤的生物学样品中白细胞弹性蛋白酶抑制剂的存在而进行诊断。
[0021] 本发明还涉及这种方法在结肠直肠癌的早期诊断、筛选、治疗随诊及预后中以及在结肠直肠癌的复发诊断中的应用。
[0022] 本发明的方法因此可以通过简便的检验方法特异性且早期诊断结肠直肠癌，所述检验方法包括检查取自患者的生物学样品、优选远离潜在肿瘤的生物学样品中白细胞弹性蛋白酶抑制剂的存在。这是因为本申请人出乎意料地揭示了结肠肿瘤不仅分泌白细胞弹性蛋白酶抑制剂，而且特异性释放其至癌组织之外，这在后文详细描述，且其在本发明方法的生物学样品中的浓度与在健康人体中确定的参考值相比增加。
[0023] 在远离或非远离肿瘤的生物学样品中确定白细胞弹性蛋白酶抑制剂的存在使得可以推断查找的病变。本发明方法的一个优势是可以使用远离潜在肿瘤的样品作为诊断样品，从而可以进行简便且非侵入性诊断，而组织学诊断需要进行侵入性活组织检查。事实上，例如对组织切片进行的组织标记物的研究(免疫组织化学)也许具有预后意义，但是对于筛选或者诊断结肠直肠癌无意义。
[0024] 白细胞弹性蛋白酶抑制剂肿瘤标记物(Swiss Prot No.P30740，也称作LEI、Serpin B1、单核细胞/中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂、M/NEI或EI)在1992年测序3。LEI特异性抑制具有弹性蛋白酶型或者糜蛋白酶型性质的蛋白酶，其通过在SDS作用下形成不可解离的复合物而起抑制作用4。因此LEI抑制由中性粒细胞产生的三种主要的蛋白酶：白细胞弹性蛋白酶、蛋白酶-3和组织蛋白酶G。这些蛋白酶能通过蛋白酶解细胞外或吞噬的底物而使得免疫系统防御生物体。然而，当这些蛋白酶过量时，其可造成炎症反应。因此，LEI在调节和限制细胞蛋白酶诱导的炎症作用中起作用。不过，目前还没有报道过LEI有可能用作癌症的标记物，特别是结肠直肠癌的标记物，以及可在远离肿瘤的样品中对其进行分析。
[0025] 短语“确定肿瘤标记物的存在”是指确定所述蛋白质或者其信使RNA的存在，或者检测其基因上编码或非编码序列中的修饰如甲基化。
[0026] 短语“由结肠肿瘤释放”是指无论机制如何由肿瘤细胞自身或者由邻近的非肿瘤细胞在损伤后的主动或被动分泌或者释放的肿瘤标记物，或者是由肿瘤进展引起的细胞表型的修饰。
[0027] 短语“对其进行本发明方法的生物学样品”是指可能含有感兴趣的肿瘤标记物的任何生物学样品。可以提及的非远离肿瘤的生物学样品例如可以是固体样品如源自患者的肿瘤、该肿瘤的活检组织、淋巴结或者转移瘤的组织，以及纯化自这些固体样品的细胞。可以提及的远离肿瘤的生物学样品例如是生物学液体如全血或其衍生物例如血清或血浆、尿液、唾液和渗出液、骨髓以及粪便，以及纯化自这些液体样品的细胞。优选血液及其衍生物以及粪便、渗出液和纯化自这些液体样品的细胞。
[0028] 本发明的方法可以通过检测除了LEI之外还检测至少一种其它肿瘤标记物而改善，所述标记物也适当地由结肠肿瘤释放至癌组织之外。因此，组合至少两个标记物使得可以改善诊断结肠直肠癌的检验的特异性和灵敏性。
[0029] 因此，本发明另一方面也包括确定选自如下两组标记物(单独或组合考虑)的至少一种其它肿瘤标记物的存在：
[0030] -A组：埃兹蛋白(Ezrin)、酰化氨基酸水解酶1、肝脂肪酸结合蛋白、肠脂肪酸结合蛋白、载脂蛋白AI、载脂蛋白AII和I-丝束蛋白(I-Plastin)，其中一些标记物是本申请人鉴别的新标记物；
[0031] -B组：具有额外的诊断意义的标记物，即β2-微球蛋白、蛋白酶体20S、半乳凝素-3(Galectin-3)、L-乳酸脱氢酶B链、钙网蛋白、再生胰岛衍生蛋白3α(Regenerating Islet-Derived Protein 3α)、肿瘤相关钙离子信号传导蛋白1、细胞骨架角蛋白II型8、细胞骨架角蛋白I型18、细胞骨架角蛋白I型19、上皮钙粘蛋白(Epithelial-Cadherin)、CEA、绒毛蛋白(Villin)、CA19-9、CA 242、CA 50、CA 72-2、睾酮、TIMP-1、Cripto-1、Intelectin-1、蛋白质二硫键异构酶、细胞角蛋白20、翻译控制的肿瘤蛋白、防卫素(原)-A5((Pro)defensin-A5)，血液中甲基化模式特异性改变的DNA片段的检测，例如AXL4基因的甲基化DNA(无芒样同源框-4基因(aristaless-like homeobox-4gene)甲基化)或者septin-9基因的甲基化DNA，粪便DNA片段中特异性改变的检测，如粪便DNA的特异性突变或者粪便DNA的甲基化模式的特异性改变，以及粪便人血红蛋白的检测。
[0032] 本发明的方法因此可以通过检测至少两个标记物而改善，一个是LEI，另一个是选自A组的另一肿瘤标记物，所述A组即埃兹蛋白、酰化氨基酸水解酶1、肝脂肪酸结合蛋白、肠脂肪酸结合蛋白、载脂蛋白AI、载脂蛋白AII和I-丝束蛋白。
[0033] “新描述的肿瘤标记物”是指蛋白质或信使RNA或者相应基因的特异性修饰，如突变或者甲基化。
[0034] 埃兹蛋白标记物(Swiss Prot No.P15311，也称作p81，Cytovillin或绒毛蛋白-2)是提供细胞膜与细胞骨架肌动蛋白丝之间结合的蛋白质，特别是在肠上皮细胞的微绒毛中5。W.G.Jiang和S.Hiscox6已经揭示了白细胞介素IL-2、IL-8、IL-10等可以抑制埃兹蛋白7
在HT29人结肠直肠癌细胞系中的表达。同一作者 也揭示了HT115和HRT18结肠直肠癌细胞系中埃兹蛋白表达的抑制降低细胞之间的粘附，且增加细胞的活动性和侵入行为。他们推断埃兹蛋白通过与细胞粘附分子E-钙粘蛋白和β-连环蛋白(β-Catenin)的相互作用调节细胞/细胞和细胞/基质之间的粘附。他们提出埃兹蛋白在控制癌细胞的侵润潜力中可以起重
8
要作用。此外，T.Xiao等使用ELISA量化肺癌患者的血浆埃兹蛋白。然而，他们未观测到与对照个体的任何差异。本申请人令人惊奇地揭示了这种蛋白质在取自结肠直肠癌患者的生物学样品中是良好的标记物，所述样品远离或者非远离所述肿瘤。
在HT29人结肠直肠癌细胞系中的表达。同一作者 也揭示了HT115和HRT18结肠直肠癌细胞系中埃兹蛋白表达的抑制降低细胞之间的粘附，且增加细胞的活动性和侵入行为。他们推断埃兹蛋白通过与细胞粘附分子E-钙粘蛋白和β-连环蛋白(β-Catenin)的相互作用调节细胞/细胞和细胞/基质之间的粘附。他们提出埃兹蛋白在控制癌细胞的侵润潜力中可以起重
8
要作用。此外，T.Xiao等使用ELISA量化肺癌患者的血浆埃兹蛋白。然而，他们未观测到与对照个体的任何差异。本申请人令人惊奇地揭示了这种蛋白质在取自结肠直肠癌患者的生物学样品中是良好的标记物，所述样品远离或者非远离所述肿瘤。
[0035] 酰化氨基酸水解酶1标记物(Swiss Prot No.Q03154，也称作EC3.5.1.14，N-酰基-L-氨基酸氨基水解酶或ACY-1)是酰化氨基酸水解酶家族的一部分。它们是催化酰化的氨基酸水解的酶以提供脂肪酸和氨基酸9。对酰化氨基酸水解酶活性进行的免疫化学测定在早如1975年由K.Lorentz等10揭示，其用于检验各种组织和血清11。研究示出在肝病变的病例中酰化氨基酸水解酶活性增加，但是在结肠癌病例中不增加。此外，酰化氨基酸水解酶1基因已经在染色体3p21.1上鉴别12。在小细胞肺癌中3p21.1区域降低为纯合性，在这种情况中酰化氨基酸水解酶表达被抑制或不可检测13。相似地，S.Balabanov等14已经揭示在肾癌病例中酰化氨基酸水解酶表达被抑制。本申请人令人惊奇地揭示这种蛋白质在取自结肠直肠癌患者的生物学样品中是良好的标记物，所述样品可以是远离该肿瘤的样品或非肿瘤样品。
[0036] 肝脂肪酸结合蛋白标记物(Swiss Prot No.P07148，也称作L-FABP、FABP1、FABPL、Z-蛋白或者固醇转运蛋白)属于FABP家族，其包含9个同种型。每个同种型根据首先检测到该同种型的组织命名。这些同种型具有共有的功能及相似的三维结构，但是其序列同源性不高。L-FABP在1985年被测序15。其是15kDa的小型蛋白质，高丰度存在于细胞溶胶中，且具有结合游离脂肪酸和胆红素的能力。近来的一些研究似乎表明L-FABP蛋白表达的削弱可诱导肿瘤发生。对于前列腺癌，肿瘤活检组织中L-FABP mRNA表达水平比在正常组织中高10倍16。对于结肠癌，一些研究小组使用二维电泳技术已经鉴别了与在正常结肠粘膜组织中的表达相比L-FABP蛋白在肿瘤组织中的表达降低17。这个结果也已经通过免疫组织化学技术18
证实。此外，L-FABP蛋白在已经转移至肝的结肠直肠癌患者中是预后肝脏切除的标记物 。
本申请人令人惊奇地揭示了这种蛋白质在取自结肠直肠癌患者的生物学样品中是良好的标记物，所述样品远离所述肿瘤。
证实。此外，L-FABP蛋白在已经转移至肝的结肠直肠癌患者中是预后肝脏切除的标记物 。
本申请人令人惊奇地揭示了这种蛋白质在取自结肠直肠癌患者的生物学样品中是良好的标记物，所述样品远离所述肿瘤。
[0037] 肠脂肪酸结合蛋白标记物(Swiss Prot No.P12104，也称作I-FABP、FABP-2或19
FABPI)在1987年被测序 。其是15kDa的小型蛋白质，高丰度存在于细胞溶胶中，且具有结合游离脂肪酸和胆红素的能力。I-FABP蛋白在小肠的肠上皮细胞中表达，且可以组成这种类型细胞蛋白质含量的大约2％。在组织水平，十二指肠和空肠与结肠相比显然含有较高数量的I-FABP(空肠：4.8μg/g，结肠：0.25μg/g)20。I-FABP在健康个体的血浆样品中不可被检测到。另一方面，在某些病理学情况如肠缺血、克罗恩病或者原发性胆汁性肝硬化中，可以证实在某些个体中血浆I-FABP浓度增加20。对于前列腺癌，已经揭示了I-FABP mRNA在肿瘤活检组织比在正常组织中的表达水平高7倍16。在大鼠中用氧化偶氮甲烷(azoxymethane)诱导的结肠直肠癌模型中，当给予动物降低癌症发生的食物(大豆蛋白或者乳清水解产物)时，I-FABP mRNA的表达水平降低2.92-3.97倍21。本申请人令人惊奇地揭示了这种蛋白质在取自结肠直肠癌患者的生物学样品中是良好的标记物，所述样品远离所述肿瘤。
FABPI)在1987年被测序 。其是15kDa的小型蛋白质，高丰度存在于细胞溶胶中，且具有结合游离脂肪酸和胆红素的能力。I-FABP蛋白在小肠的肠上皮细胞中表达，且可以组成这种类型细胞蛋白质含量的大约2％。在组织水平，十二指肠和空肠与结肠相比显然含有较高数量的I-FABP(空肠：4.8μg/g，结肠：0.25μg/g)20。I-FABP在健康个体的血浆样品中不可被检测到。另一方面，在某些病理学情况如肠缺血、克罗恩病或者原发性胆汁性肝硬化中，可以证实在某些个体中血浆I-FABP浓度增加20。对于前列腺癌，已经揭示了I-FABP mRNA在肿瘤活检组织比在正常组织中的表达水平高7倍16。在大鼠中用氧化偶氮甲烷(azoxymethane)诱导的结肠直肠癌模型中，当给予动物降低癌症发生的食物(大豆蛋白或者乳清水解产物)时，I-FABP mRNA的表达水平降低2.92-3.97倍21。本申请人令人惊奇地揭示了这种蛋白质在取自结肠直肠癌患者的生物学样品中是良好的标记物，所述样品远离所述肿瘤。
[0038] 载脂蛋白是由极性氨基酸组成的蛋白质家族，其可以通过形成称作脂蛋白的亲水性大分子复合物而转运血液中的脂质。对于每种人血浆载脂蛋白，存在衍生自遗传多态性和/或翻译后修饰的同种型，其在血液中的存在与某些病变相关22。载脂蛋白的血浆浓度并非是不显著的，在mg/ml级别23。
[0039] 载脂蛋白AI标记物(NCBI No.490098，也称作Apo A-I、Apo AI和Apo A1)是具有243个氨基酸的28kDa蛋白质。其基本上由肝和肠合成。通过SELDI-TOF，揭示了这种蛋白质在结肠直肠癌患者血清与在健康个体血清中相比丰度不高24。然而，这篇文章指出通过组合Apo AI与其它蛋白质标记物区别CRC患者与健康个体。此外，这篇文章指出由另一研究小组
25
进行的通过浊度免疫测定分析Apo AI未证实这种蛋白质在CRC患者血清中的丰度不高 。
Hachem等26测定了在结肠直肠癌转移之后患有肝癌的患者血清中的Apo AI。本申请人令人惊奇地揭示了通过免疫测定分析可以证实这种蛋白质在结肠直肠癌患者中的浓度降低，与先前Engwegen等24提出的结果相反，其仅通过实施SELDI-TOF技术才能证实这种降低。通过在生物学样品中进行免疫测定分析Apo AI是诊断结肠直肠癌的良好方法，所述样品远离所述肿瘤，进行的免疫测定分析不是Zhang等的小组所用的比浊法25。
25
进行的通过浊度免疫测定分析Apo AI未证实这种蛋白质在CRC患者血清中的丰度不高 。
Hachem等26测定了在结肠直肠癌转移之后患有肝癌的患者血清中的Apo AI。本申请人令人惊奇地揭示了通过免疫测定分析可以证实这种蛋白质在结肠直肠癌患者中的浓度降低，与先前Engwegen等24提出的结果相反，其仅通过实施SELDI-TOF技术才能证实这种降低。通过在生物学样品中进行免疫测定分析Apo AI是诊断结肠直肠癌的良好方法，所述样品远离所述肿瘤，进行的免疫测定分析不是Zhang等的小组所用的比浊法25。
[0040] 载脂蛋白AII标记物(Swiss Prot No.P02652，也称作ApoA II、Apo-AII和Apo A2)是由每个链具有77个氨基酸的两个多肽链组成的17380-Da蛋白质，所述两个多肽链通过二硫键连接。如载脂蛋白AI一样，载脂蛋白AII也基本上由肝和肠合成。除了Apo AI之外，Hachem等26也测定了在结肠直肠癌转移之后患有肝癌的患者血清中的Apo AII。然而，结果无意义，且不能得以推断病症。本申请人令人惊奇地揭示了结肠直肠癌患者中这种蛋白质浓度降低，使其在取自结肠直肠癌患者的生物学样品中是良好的标记物，所述样品远离所述肿瘤。
[0041] I-丝束蛋白标记物(Swiss Prot No.Q14651，也称作肠特异性丝束蛋白或者丝束蛋白1)属于人丝束蛋白家族，该家族具有三个代表性成员：I-丝束蛋白、L-丝束蛋白和T-丝束蛋白。一些作者将丝束蛋白类称为“微丝结合蛋白类(Fimbrins)”，另一些作者将I-丝束蛋白称为微丝结合蛋白。丝束蛋白类是结合肌动蛋白形成细胞骨架的蛋白质。它们是70kDa蛋白质，在真核生物进化中相对良好保守。它们呈现出良好组织特异性，在一个时期仅一种同种型在正常组织中存在27。丝束蛋白类在癌症中的应用已经在专利US-A-5 360 715中描述，该专利提议了一种确定细胞是造血细胞还是血管发生性即癌性细胞的方法。这种方法要求在细胞水平测定L-丝束蛋白和T-丝束蛋白，更特别是测定其mRNA。然而，尽管呈现这些性质，但是先前未进行研究以评估丝束蛋白在使用血清或粪便样品诊断结肠直肠癌中的重要性。此外，从未设想I-丝束蛋白作为潜在的癌标记物28。本申请人令人惊奇地揭示了这种蛋白质在取自结肠直肠癌患者的生物学样品中是良好的标记物，所述样品远离所述肿瘤。
[0042] 在对其进行本发明方法的生物学样品中，选自A组的肿瘤标记物的浓度根据考虑的标记物与在健康个体中确定的参考值相比增加或降低。
[0043] 本发明的方法也可以通过组合检测LEI与选自B组的一种其它肿瘤标记物而改善，所述B组标记物即标记物β2-微球蛋白、蛋白酶体20S、半乳凝素-3、L-乳酸脱氢酶B链、钙网蛋白、再生胰岛衍生蛋白3α、肿瘤相关钙离子信号传导蛋白1、细胞骨架角蛋白II型8、细胞骨架角蛋白I型18、细胞骨架角蛋白I型19、上皮钙粘蛋白(Epithelial-Cadherin)、CEA、绒毛蛋白、CA19-9、CA 242、CA 50、CA 72-2、睾酮、TIMP-1、Cripto-1、Intelectin-1、蛋白质二硫键异构酶、细胞角蛋白20、翻译控制的肿瘤蛋白、防卫素(原)-A5；血液中甲基化DNA的检测，优选AXL4基因的甲基化DNA(无芒样同源框-4基因甲基化)或者septin-9基因的甲基化DNA；粪便DNA片段中特异性改变的检测，如粪便DNA的特异性突变或者粪便DNA的甲基化模式的特异性改变，以及粪便人血红蛋白的检测。当然，本发明的方法也可以在同一测定中检测LEI、选自B组的至少一种肿瘤标记物以及选自A组的至少一种其它肿瘤标记物。
[0044] β2-微球蛋白标记物(Swiss Prot No.P61769，也称作β2-微球蛋白，β2M)是在大多数有核人细胞表面发现的一种低分子量(11-12kDa)蛋白质。在某些癌症患者中，血清β2-微球蛋白水平增加，这种增加不是特异性的，或者与肿瘤的性质、疾病的阶段或严重性不相关。在其它疾病如红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征、淋巴系统恶性疾病(多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤)、某些病毒性疾病(肝炎或AIDS)以及在血友病患者中也观测到显著增加。由于β2-微球蛋白被肾小球滤过，且由近端小管重吸收，因此在肾脏疾病中其在血液中的浓度可以改变。因此测定β2-微球蛋白主要用于诊断肾脏病症，或者用于获得性免疫缺陷病毒感染的随诊中。然而，已知这种标记物是肿瘤标记物，特别是结肠癌的标记物。
[0045] 蛋白酶体20S标记物(也称作Prosome)是蛋白酶体的中心结构，其自身是参与遍在蛋白的细胞内降解的分子复合物29。蛋白酶体是由在7个亚基的4个环缔合的28个亚基组成的700kDa的分子复合物。在人体中，已知7个α单位(α1,α2,α3,α4,α5,α6和α7)及10个β单位(β1,β2,β3,β4,β5,β6,β7,β1i,β2i和β5i)。通过其催化性质，蛋白酶体在细胞增殖、生长、调节和凋亡中且因此在癌化途径中起关键作用。用Bortezomib(Velcade)抑制蛋白酶体是公认的治疗多发性骨髓瘤的方法。现在正对血液癌症或肿瘤进行II期或III期治疗试验。T.Lavabre-Bertrand等30揭示了在某些病理状况特别是在癌症(骨髓瘤、淋巴瘤和实体瘤)中，蛋白酶体的血清水平可增加。
[0046] 半乳凝素-3标记物(Swiss Prot No.P17931，也称作Gal-3、半乳糖特异性凝集素3、MAC-2抗原、IgE-结合蛋白、35kDa凝集素、碳水化合物结合蛋白35、CBP 35、昆布氨酸-结合蛋白、凝集素L-29、L-31、半乳糖苷结合蛋白或者GALBP)是能结合N-乙酰氨基乳糖(acetyllactosamine)型的β-半乳糖苷结构的凝集素。其是参与多种生物学功能的多功能
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蛋白质，所述功能包括肿瘤细胞的粘附、增殖、分化、血管发生、细胞凋亡、转移癌进展 。多项研究表明Gal-3可以与许多分子形成复合物：CEA、IgE、昆布氨酸(Laminin)、粘蛋白(Mucin)、Mac-2BP、LAMP1、LAMP2、纤连蛋白(Fibronectin)等。Gal-3的血清测定已经由I.Iurisci等32描述。Gal-3在用Mac-2-结合蛋白(Gal-3-结合蛋白)包被的微滴定平板上被捕获，然后用抗-Gal-3大鼠抗体揭示。这项研究揭示了Gal-3在胃肠道癌症、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑素瘤和非霍奇金淋巴瘤中增加的血清水平。
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蛋白质，所述功能包括肿瘤细胞的粘附、增殖、分化、血管发生、细胞凋亡、转移癌进展 。多项研究表明Gal-3可以与许多分子形成复合物：CEA、IgE、昆布氨酸(Laminin)、粘蛋白(Mucin)、Mac-2BP、LAMP1、LAMP2、纤连蛋白(Fibronectin)等。Gal-3的血清测定已经由I.Iurisci等32描述。Gal-3在用Mac-2-结合蛋白(Gal-3-结合蛋白)包被的微滴定平板上被捕获，然后用抗-Gal-3大鼠抗体揭示。这项研究揭示了Gal-3在胃肠道癌症、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑素瘤和非霍奇金淋巴瘤中增加的血清水平。
[0047] L-乳酸脱氢酶B链标记物(Swiss Prot No.P07195，也称作LDH-B,LDH心单位或LDH-H)是可以以同源四聚体形式形成复合物的蛋白质。这种蛋白质也可以与L-乳酸脱氢酶A链蛋白(Swiss Prot No.P00338，也称作LDH-A、LDH肌单位或LDH-M)以异源四聚体形式形成复合物。血流中称作LDH的这种四聚体复合物的血清剂量和/或血清酶活性在许多实体瘤中与肿瘤大小成比例地增加。推荐其与人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)和胎盘碱性磷酸酶组合用于精囊癌的随诊中。LDH被认为是预后淋巴瘤、白血病或者结肠癌的重要标记物33。
[0048] 钙网蛋白标记物(Swiss Prot No.P27797，也称作CRP55、Calregulin、HACBP、ERp60或grp60)是多功能蛋白质。其是能与内质网的几乎所有单糖基化蛋白质瞬时相互作34
用的凝集素。D.J.McCool等 因此已经揭示了钙网蛋白参与结肠粘蛋白MUC2的成熟。在组织、粪便或体液中使用钙网蛋白测定诊断CRC的方法在专利申请WO 03/065003中描述。
用的凝集素。D.J.McCool等 因此已经揭示了钙网蛋白参与结肠粘蛋白MUC2的成熟。在组织、粪便或体液中使用钙网蛋白测定诊断CRC的方法在专利申请WO 03/065003中描述。
[0049] 再生胰岛衍生蛋白3α标记物(Swiss Prot No.Q06141，也称作Reg III-α、胰腺炎相关蛋白1或者胰腺炎相关蛋白I(PAP 1))是在正常胰腺中微弱表达的蛋白质。其在急性胰35
腺炎和在某些慢性胰腺炎患者中过表达。在这种情况中，其出现在胰液和血流中 。Y.Motoo等36通过ELISA已经揭示了某些结肠癌、胃癌、肝癌或胰腺癌以及在肾功能衰竭患者血液中PAP 1水平增加。为此，他们使用Dynabio(La Gaude,France)公司销售的ELISA测定法(PANCEPAP)。
腺炎和在某些慢性胰腺炎患者中过表达。在这种情况中，其出现在胰液和血流中 。Y.Motoo等36通过ELISA已经揭示了某些结肠癌、胃癌、肝癌或胰腺癌以及在肾功能衰竭患者血液中PAP 1水平增加。为此，他们使用Dynabio(La Gaude,France)公司销售的ELISA测定法(PANCEPAP)。
[0050] 肿瘤相关钙离子信号传导蛋白1标记物(Swiss Prot No.P16422，也称作主要胃肠道肿瘤相关蛋白GA733-2、上皮细胞表面抗原、EpCAM、上皮糖蛋白EGP、腺癌相关抗原、KSA、KS 1/4抗原、细胞表面糖蛋白Trop-1或者CD326抗原)根据其由结肠直肠癌细胞的抗体识别的能力在1979年被鉴定37。已知这种蛋白质有许多名称，如上文描述，但是最常用的是称其为EpCAM。其是在某些上皮细胞以及许多癌症细胞的基底面中表达的跨膜蛋白38。在1982年，Herlyn等39揭示了注射抗-EpCAM单克隆抗体可以抑制结肠直肠癌患者体内肿瘤生长。这些结果使得可以基于称作Edrecolomab的抗-EpCAM抗体开发抗肿瘤治疗方法。这种治疗以PanorexTM名称销售。此外，H.Abe等40通过ELISA揭示了称作MK-1的可溶形式的EpCAM在10％研究的癌症患者血流中增加。
[0051] 细胞角蛋白是组成上皮细胞细胞骨架的中间丝的蛋白质部分。目前已经鉴别了超过20种的人细胞角蛋白。细胞角蛋白8(Swiss Prot No.P05787，也称作细胞角蛋白、CK-8、角蛋白-8或K8)、18(Swiss Prot No.P05783，也称作细胞角蛋白-18、CK-18、角蛋白-18或K18)和19(Swiss Prot No.P08727，也称作细胞角蛋白-19、CK-19、角蛋白-19或K19)在上皮细胞中丰度最高，且是诊断癌病变的有效工具41。这种临床重要性与细胞凋亡或增殖期上皮细胞释放细胞角蛋白相关。在细胞凋亡情况中，这个释放以可溶片段形式出现，似乎在半胱氨酸蛋白酶的蛋白酶解作用下出现。血流中未降解的细胞角蛋白形式从未有报道。三种临床最常用的细胞角蛋白测定是组织多肽抗原(TPA)测定，组织多肽特异性抗原(TPS)测定和CYFRA 21-1测定。TPA是测量细胞角蛋白8、18和19的广谱检验法。TPS和CYFRA 21-1测定分别更特异性测量细胞角蛋白18和细胞角蛋白19的片段。这三种检测法检测可溶的细胞角蛋白片段，所述片段可以以其自身或者以蛋白质复合物形式呈现。TPA、TPS或者CYFRA-21-1已经用于结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和某些ENT癌的治疗随诊中。事实上，血液中可溶的细胞角蛋白的测定在筛选肿瘤复发或者评估所用治疗(放疗、化疗、激素治疗)的反应中具有临床价值。定期检测使得特别可以评估肿瘤的进展。可溶的血液细胞角蛋白的量也具有预后肿瘤阶段和转移形成的意义。目前，最常用的细胞角蛋白血液测定是CYFRA 21-1。高度推荐其用于非小细胞肺癌患者的随诊。有许多可商购的TPA(AB Sangtec Medical Co.,Byk-Roland等)、TPS(IDL Biotech AB,BEKI Diagnosiss等)和CYFRA-21-1(Roche Diagnosiss,CIS Bio-International,Fujirebio Diagnosiss等)的试剂盒。此外，H.Kim等42揭示了测定粪便细胞角蛋白19(DiNonA Inc.)组合便潜血测定可用于筛选胃肠道疾病。最后，细胞角蛋白20(Swiss Prot No.P35900，也称作细胞骨架I型角蛋白20、CK-20、角蛋白-20、K20或者IT蛋白)在结肠直肠癌中作为标记物的应用在专利申请US
2002/0160382中描述。
2002/0160382中描述。
[0052] 上皮钙粘蛋白标记物(Swiss Prot No.P12830，也称作E-钙粘蛋白、Uvomorulin、钙粘蛋白-1、CAM 120/80或者CD324抗原)是介导钙离子依赖性细胞粘附的跨膜蛋白。其在上皮细胞中特异性表达，在此参与维持其表型。E-钙粘蛋白的细胞质结构域结合β-连环蛋白，其自身结合细胞骨架的肌动蛋白丝网。这种E-钙粘蛋白/β-连环蛋白结合在稳定上皮组织的细胞/细胞粘附中起重要作用。因此，E-钙粘蛋白的丧失可降低细胞粘附且增加癌细胞的侵润能力。E-钙粘蛋白或者β-连环蛋白的表达降低通常与肿瘤特别是胃肠道癌症的更大的侵润性和去分化性相关联。因此，F.Roca等43揭示了患有结肠直肠癌且E-钙粘蛋白低表达的患者与具有正常表达水平的患者相比具有更不利的预后。在1983年，Damsky等44揭示了可溶形式的E-钙粘蛋白可以由MCF-7乳腺癌细胞系释放。这种可溶形式相应于E-钙粘蛋白胞外部分的裂解。随后，M.Katayama等45揭示了可溶形式的E-钙粘蛋白在癌症情况中可以释放进入血流中；C.Willmanns等46揭示了血液中E-钙粘蛋白量增加与结肠直肠癌的肿瘤阶段相关联。此外，可商购的试剂盒由Takara BioChemicals(Tokyo,Japan)公司提供。
[0053] 自1965年以来，P.Gold和S.Freedman47已经提议测定CEA(癌胚抗原)用于诊断结肠直肠癌，但是血液中这个标记物的测定对于诊断相对非晚期结肠直肠癌的灵敏性不佳。因此，测定血清CEA尤为推荐用于评估肝转移风险48以及用于治疗随诊。此外，其对于结肠直肠癌不是非常特异性的标记物；事实上其在许多其它癌症(肺癌、乳腺癌等)中均增加。另一方面，测定粪便CEA似乎比测定血清CEA或者测定便血更灵敏且更具特异性49。然而，这种测定还未被常规提议。
[0054] 反应性抗原性决定簇1116-NS-19-9，更通常称作CA19-9(碳水化合物抗原19.9)，由高分子量蛋白质携带50。测定血液中CA 19-9与测定CEA相比更具特异性。血液中CA 19-9水平在结肠直肠癌、胰腺癌和肝癌(肝胆管型肝癌)中增加，但是在非癌病症(胆管炎等)中也增加。在诊断癌症及该病症的随诊中推荐其与CEA组合。
[0055] J.Holmgren等51揭示了在结肠直肠癌患者血清中CA 50抗原的量增加。CA 50抗原根据其由特异性单克隆抗体识别的能力定义。
[0056] 关于CA 72标记物，T.L.Klug等52揭示了在结肠直肠癌患者血清中CA 72抗原的量增加。CA 72抗原根据其由特异性单克隆抗体识别的能力定义。
[0057] 相似地，P.Kuusela等53揭示了在结肠直肠癌患者血清中CA 242抗原的量增加。CA 242抗原根据其由特异性单克隆抗体识别的能力定义。
[0058] M.Holland等54提议测定睾酮以诊断结肠直肠癌。这些作者揭示了结肠直肠癌患者血液睾酮水平降低。
[0059] 关于TIMP-1，或者1型基质金属蛋白酶的组织抑制剂这个标记物，专利申请US 2007/0020707描述了通过测定体液中TIMP-1诊断结肠直肠癌。
[0060] F.Model等55在2006年7月在胃肠道癌症国际会议期间揭示了可以检测结肠直肠癌患者血浆中septin-9基因的甲基化形式。
[0061] M.P.Ebert等56揭示了ALX4基因或者无芒样同源框-4基因在结肠直肠癌患者血清中比在对照血清中更通常被甲基化(P<0.0001)。使用41.4pg/mL阈值，他们获得了83.3％的灵敏性和70％的特异性。
[0062] 绒毛蛋白在专利申请FR2581456中被描述为诊断结肠直肠癌的血液标记物。
[0063] C.Bianco等57揭示了在结肠直肠癌患者血清中Cripto-1的量增加。
[0064] 测定Intelectin-1(Swiss Prot No.Q8WWA0，也称作肠乳铁蛋白受体、呋喃半乳糖结合凝集素、内皮细胞凝集素HL-1或者Omentin)用以诊断结肠直肠癌在专利申请US 2003/0082533中描述。
[0065] 蛋白质二硫键异构酶(Swiss Prot No.P07237，也称作EC 5.3.4.1、PDI、脯氨酰4-羟化酶β亚基、细胞甲状腺激素结合蛋白或者p55)、翻译控制的肿瘤蛋白(Swiss Prot No.P13693，也称作TCTP、p23、组胺释放因子、HRF或Fortilin)以及防卫素(原)-A5(Swiss Prot No.Q01523)用作结肠直肠癌标记物分别在专利申请EP1724586、US 2003/0172388和US 2006/0179496中描述。术语“防卫素(原)”是指前体(即裂解前的防卫素原)；前肽(即防卫素原裂解后的N末端部分)；以及成熟蛋白质(即防卫素，相应于裂解后C末端部分)。
[0066] 最后，测定人粪便血红蛋白是已知的检验法，且可以如前述实施。
[0067] 对其进行本发明方法的生物学样品中选自B组的肿瘤标记物的浓度根据考虑的标记物与在健康个体中确定的参考值相比是增加或降低的。
[0068] 优选地，B组肿瘤标记物选自β2-微球蛋白、蛋白酶体20S、半乳凝素-3、L-乳酸脱氢酶B链、钙网蛋白、再生胰岛衍生蛋白3α、肿瘤相关钙离子信号传导蛋白1、上皮钙粘蛋白、CEA、CA19-9、睾酮、TIMP-1、Intelectin-1、蛋白质二硫键异构酶、细胞角蛋白20、翻译控制的肿瘤蛋白、防卫素(原)-A5及检测人粪便血红蛋白。
[0069] 当然，本发明的方法也可包括检测本领域技术人员已知的结肠直肠癌任何其它标记物。
[0070] 如上所述，感兴趣的肿瘤标记物以蛋白质形式或者以信使RNA形式或者通过相应DNA改变(突变或甲基化修饰)而被检测。
[0071] 可以通过本领域技术人员已知的确定样品中蛋白质存在的任何方法确定生物学样品中感兴趣的“蛋白质”肿瘤标记物的存在，例如生物化学检验，包括免疫测定，或者通过质谱分析。
[0072] 所述生物化学检验可以是本领域技术人员熟知的任何检验，包括分子相互作用，即所述肿瘤标记物与特异于或者非特异于所述肿瘤标记物的一或多种结合配偶体之间的反应。
[0073] 优选地，所述生物化学检验是本领域技术人员已知的免疫测定，包括肿瘤标记物(即抗原)与一或多种特异性结合配偶体(即该抗原的抗体)之间的免疫学反应。
[0074] 本发明方法中特异于或非特异于肿瘤标记物的结合配偶体是能结合所述标记物的任何配偶体。当其能以高特异性、甚至以100％特异性结合这些标记物时，认为其是特异性的。当其与这些标记物的结合特异性较低且同时能结合其它配体如蛋白质时，认为其是非特异性的。例如，可以提及的是抗体、抗体一部分、受体及能结合这个标记物的任何其它分子。
[0075] 所述结合配偶体抗体是例如多克隆抗体或者单克隆抗体。
[0076] 多克隆抗体可以通过用相关的肿瘤标记物免疫动物，随后回收纯化形式的希望的抗体而获得，通过从所述动物取血清，将所述抗体从其它血清组分中分离，特别是在附着有该抗体特异性识别的抗原、特别是所述标记物的柱上通过亲和层析分离。
[0077] 单克隆抗体可以通过杂交瘤技术获得，其一般原理在后文描述。
[0078] 首先，用感兴趣的肿瘤标记物免疫动物(通常是小鼠)，随后所述动物的B淋巴细胞可以产生该抗原的抗体。这些产生抗体的淋巴细胞随后与“永生化的”骨髓瘤细胞(例如鼠)融合以产生杂交瘤。使用由此获得的细胞异源混合物，选择能产生特定抗体且无限增殖的细胞。每个杂交瘤均以克隆形式增殖，导致单克隆抗体产生，其由所述肿瘤标记物识别的性质可例如通过ELISA、通过一维或二维Western印迹、通过免疫荧光或者通过生物传感器检测。随后纯化由此选择的单克隆抗体，特别是通过上述亲和层析技术纯化。
[0079] 所述单克隆抗体也可以是通过本领域技术人员熟知的遗传工程化技术获得的重组抗体。
[0080] 已知抗-白细胞弹性蛋白酶抑制剂抗体的实例，且可得自Abcam目录兔抗-LEI多克58
隆抗体，Cat.No.Ab47731。抗-LEI单克隆抗体，克隆ELA-1，由R.Yasumatsu等描述 。
隆抗体，Cat.No.Ab47731。抗-LEI单克隆抗体，克隆ELA-1，由R.Yasumatsu等描述 。
[0081] 已知抗-埃兹蛋白抗体的实例，且可得自Abcam目录，抗-埃兹蛋白单克隆抗体，克隆3C12，Cat.No.Ab4069和兔抗-埃兹蛋白多克隆抗体，Cat.No.Ab47418。
[0082] 已知抗-酰化氨基酸水解酶1抗体的实例，且可得自Abnova目录，抗-酰化氨基酸水解酶1单克隆抗体，克隆4F1-B7,Cat.No.H00000095-M01，以及Abcam目录，鸡抗-酰化氨基酸水解酶1多克隆抗体，Cat.No.Ab26173。
[0083] 已知抗-肝脂肪酸结合蛋白抗体的实例，且可得自Abcam目录，抗-L-FABP单克隆抗体，克隆6B6,Cat.No.Ab10059，及兔抗-L-FABP多克隆抗体，Cat.No.Ab7807。
[0084] 已知抗-肠脂肪酸结合蛋白抗体，且可得自R&D Systems目录，抗-I-FABP单克隆抗体，克隆323701,Cat.No.MAB3078，及Abcam目录，兔抗-I-FABP多克隆抗体，Cat.No.Ab7805。
[0085] 已知抗-载脂蛋白AI抗体的实例，且可得自Biodesign Meridian Life Sciences目录，抗-Apo AI单克隆抗体，克隆4A90,Cat.No.H45402M，和山羊抗-Apo AI多克隆抗体，Cat.No.K45252P。
[0086] 已知抗-载脂蛋白AII抗体的实例，且可得自US Biological目录，抗-Apo AII单克隆抗体，克隆1402,Cat.No.A2299-31C，及Biodesign Meridian Life Sciences目录，山羊抗-Apo AII多克隆抗体，Cat.No.K74001P。
[0087] 已知抗-I-丝束蛋白多克隆抗体的实例，且可得自Santa Cruz Biotechnology目录。兔多克隆抗体H-300(Cat.No.sc-28531)与I-丝束蛋白、L-丝束蛋白和T-丝束蛋白反应。本申请人揭示了I-丝束蛋白的单克隆抗体。
[0088] 已知抗-β2-微球蛋白、抗-CEA、抗-CA19-9和抗-睾酮抗体的实例，且可用于本申请人的测定试剂盒中，分别是 β2-微球蛋白、 CEA、 CA19-9TM和睾酮。
[0089] 已知抗-蛋白酶体20S抗体的实例，且可得自Affinitiy Research Products目录。
[0090] 已知抗-半乳凝素-3、抗-L-乳酸脱氢酶B链、抗-钙网蛋白、抗-肿瘤肿瘤相关钙离子信号传导蛋白1、抗-细胞骨架II型角蛋白8、抗-细胞骨架I型角蛋白18、抗-细胞骨架I型角蛋白19、抗-上皮-钙粘蛋白、抗-绒毛蛋白和抗-TIMP-1抗体的实例，且可得自Abcam目录。
[0091] 已知抗-再生胰岛衍生蛋白3α抗体的实例，且用于Dynabio测定试剂盒(La Gaude,France)中。
[0092] 已知抗-CA 242、抗-CA 50和抗-CA 72-4抗体的实例，且可得自Fujirebio目录。
[0093] 已知抗-Intelectin-1抗体的实例，且可得自Alexis Biochemicals目录，抗-Intelectin-1单克隆抗体，克隆Saly-1,Cat.No.ALX-804-850-C100，以及rabbit抗-Intelectin-1多克隆抗体，Cat.No.ALX-210-941。
[0094] 已知抗-蛋白质二硫键异构酶抗体的实例，且可得自Abcam目录，抗-PDI单克隆抗体，克隆RL77,Cat.No.Ab5484，以及兔抗-PDI多克隆抗体，Cat.No.Ab3672，
[0095] 已知抗-细胞角蛋白20抗体的实例，且可得自Abcam目录，抗-细胞角蛋白20单克隆抗体，克隆Ks20.8,Cat.No.Ab962，以及兔抗-细胞角蛋白20多克隆抗体，Cat.No.Ab36756。
[0096] 已知抗-TCTP抗体的实例，且可得自目录，抗-TCTP单克隆抗体，克隆3C7，Cat.No.157H00007178-M01，以及抗-TCTP多克隆抗体，Cat.No.157H00007178-A01。
[0097] 已知抗-防卫素-A5抗体的实例，且可得自Santa Cruz Biotechnology目录，抗-防卫素-A5单克隆抗体，克隆8C8，Cat.No.sc-53997，以及Alpha Diagnosis International Inc.目录，兔抗-防卫素-A5多克隆抗体，Cat.No.HDEFA51-A。
[0098] 本发明方法中特异于或者非特异于肿瘤标记物的结合配偶体可用作捕获剂，作为检测剂，或者作为捕获剂和检测剂。
[0099] 可以通过任何检测方式如直接或间接检测方式观测免疫反应，即肿瘤标记物/结合配偶体的结合。
[0100] 在直接检测即不包含标记情况中，免疫反应通过例如表面等离子共振技术或者在具有传导性聚合物的电极上通过循环伏安法(cyclic voltametr)观测。
[0101] 间接检测是利用标记“揭示试剂”结合配偶体，或者是感兴趣的肿瘤标记物自身进行。在后者情况中，其随后被描述为竞争方法。
[0102] 术语“标记”是指使标记试剂的附着能直接或间接产生可检测的信号。这些标记试剂非限制性包括：
[0103] ·酶，其产生例如通过比色法、荧光或者发光而可被检测的信号，所述酶例如是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或者葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；
[0104] ·生色团，如荧光或发光化合物或染料；
[0105] ·放射性分子，如32P、35S或125I，以及
[0106] ·荧光分子如Alexa或藻蓝蛋白。
[0107] 也可以使用间接检测系统，例如能与抗配体反应的配体。配体/抗配体对为本领域技术人员熟知，例如如下一对：生物素/链霉抗生物素，半抗原/抗体，肽/抗体，糖/凝集素，多核苷酸/与该多核苷酸互补的序列。在这种情况中，其是具有结合配对物的配体。抗配体可以通过前文所述标记试剂直接检测，或者通过配体/抗配体自身检测。
[0108] 这些间接检测系统在一定条件下可以导致信号放大。这种信号放大技术为本领域技术人员熟知，可参见本申请人先前的专利申请FR98/10084或WO-A-95/08000，或者Chevalier等的文章59。
[0109] 根据所用标记的类型，本领域技术人员加入使得可以观测显示标记的试剂。
[0110] 举例的上述免疫测定可以提及的是“夹心”方法，如ELISA、IRMA和RIA，“竞争”方法和直接免疫检测方法如免疫组织化学、免疫细胞化学、Western印迹和Dot印迹方法。
[0111] 质谱分析法也可用于在生物学样品中检测本发明方法探求的肿瘤标记物。光谱法的原理为本领域技术人员熟知，例如在Patterson,S.60中描述。
[0112] 为此，将预处理或未预处理的生物学样品经过质谱分析仪，将获得的质谱与本发明方法寻找的肿瘤标记物的质谱对比。举例的样品预处理方法包括将其经过免疫捕获支持物，所述免疫捕获支持物包含本发明方法寻找的肿瘤标记物的结合配偶体之一，例如本发明方法寻找的肿瘤标记物的抗体。另一种样品预处理方法包括预先分级分离所述生物学样品，以将样品的蛋白质彼此分离。在本领域技术人员熟知的技术中，样品的主要蛋白质可例如首先被耗竭。
[0113] 利用最近的技术进步，也可以量化复杂的生物学介质中的蛋白质，使用以MRM(多反映监测)模式运转的三联四极分析仪(triple quadripole analyzer)进行串联质谱分析(MS/MS)。这种运转模式具有双重选择性(两个分析仪，亲本离子选择和产物离子选择)，而且与其它扫描模式相比检测灵敏性得以改良。这种方法的技术可行性最近已经由Anderson 61
and Hunter 证实，其成功地在免疫耗竭丰度最高的蛋白质后检测到血浆浓度在一百ng/ml级别的蛋白质。
and Hunter 证实，其成功地在免疫耗竭丰度最高的蛋白质后检测到血浆浓度在一百ng/ml级别的蛋白质。
[0114] 确定生物学样品中感兴趣的“mRNA”肿瘤标记物的存在可以通过确定样品中mRNA存在的任何方法进行，即通过直接检测mRNA或者间接检测mRNA，或者通过确定样品中RNA存在的本领域技术人员已知的任何其它方法进行。
[0115] 术语“直接检测mRNA”是指证实生物学样品中所述mRNA自身。
[0116] 直接检测生物学样品中mRNA可以通过本领域技术人员已知的任何方式进行，例如通过与特异于该mRNA的结合配偶体杂交，其中进行适当的PCR扩增，或者NASBA技术。
[0117] 术语“杂交”是指在合适条件下两个核苷酸片段通过稳定且特异的氢键彼此结合，形成双链复合物。这些氢键在互补碱基之间形成，如腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)(或者尿嘧啶(U))(称作A-T键)，或者鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)(称作G-C键)。两个核苷酸片段的杂交可以是完全的(参见互补核苷酸片段或序列)，即在此杂交期间获得的双链复合物仅包含A-T键和C-G键。这种杂交也可以是部分杂交(参见足够互补的核苷酸片段或序列)，即获得的双链复合物包含使得可以形成双链复合物的A-T键和C-G键，但是也包含与互补碱基未键合的碱基。两个核苷酸片段之间的杂交依赖于使用的杂交条件，特别是严格性。严格性被特别定义为两个核苷酸片段的碱基成分的函数(function)，以及两个核苷酸片段之间错配程度。严格性也可以依赖于反应参数，如杂交溶液中存在的离子的浓度和类型、变性剂的性质和浓度和/或杂交温度。本领域技术人员熟知所有这些数据，且可以确定合适的条件。通常地，根据希望杂交的核苷酸片段的长度，杂交温度介于大约20-70℃之间，特别是介于35-65℃之间，盐溶液的浓度介于大约0.5-lM之间。特异于或非特异于所述mRNA的结合配偶体是能结合该mRNA的任何配偶体。例如，可以提及的是核酸探针、扩增引物，以及能结合该mRNA的任何其它分子。
[0118] 术语“杂交探针”是指包含5-100个核酸单位、特别是10-35个核酸单位的核苷酸片段，其在指定条件下具有杂交特异性，与特异于感兴趣的靶基因的材料形成杂交复合物。杂交探针可包含使其可以被检测的标记。
[0119] 对于本发明，术语“扩增引物”是指包含5-100个核酸单位、优选15-30个核酸单位的核苷酸片段，其可以起始酶促聚合化如酶促扩增反应。术语“酶促扩增反应”是指通过至少一种酶的作用产生核苷酸片段的多个拷贝的过程。这种扩增反应为本领域技术人员熟知，可以特别提及的是如下技术：
[0120] -PCR(聚合酶链反应)，如专利US 4 683 195、US 4 683 202和US 4 800 159所述；
[0121] -NASBA(基于核酸序列的扩增)，见专利申请WO 91/02818所述；及
[0122] -TMA(转录介导的扩增)，见US 5 399 491专利所述。
[0123] 术语“检测”是指插入染料如 Green I或者溴化乙锭的物理方法或者化学62
方法，或者使用标记检测的方法。有许多检测核酸的方法 。合适的标记如上文所述。
方法，或者使用标记检测的方法。有许多检测核酸的方法 。合适的标记如上文所述。
[0124] 对于本发明，杂交探针可以是“检测”探针。在这种情况中，“检测”探针用如上述标记进行标记。根据这种标记的存在，可以检测指定检测探针与被检测的转录物之间的杂交反应的存在。
[0125] 所述检测探针可以特别是“分子信标”检测探针63。这些“分子信标”在杂交期间成为具有荧光性。它们具有一个茎-环结构，且含有荧光团和猝光基团。特异性环序列与其互补靶核酸序列的结合使得茎伸展，以及在激发期间以合适波长发射荧光信号。
[0126] 杂交探针也可以是“捕获”探针。在这种情况中，“捕获”探针可以通过任何适当方式被固定或者可以固定于固体支持物上，即例如通过共价键或者吸附而直接或间接固定。合适的固体支持物为本领域技术人员熟知，例如可以提及的是合成材料或天然材料、乳胶、磁性粒子、金属衍生物、凝胶等。所述固体支持物可以是微滴定平板形式，专利申请WO-A-
94/12670中描述的膜或者粒子。在该支持物上也可以固定一些不同的捕获探针，每个捕获探针均特异于靶转录物。特别地，可以使用其上固定了大量探针的生物芯片作为支持物。
94/12670中描述的膜或者粒子。在该支持物上也可以固定一些不同的捕获探针，每个捕获探针均特异于靶转录物。特别地，可以使用其上固定了大量探针的生物芯片作为支持物。
[0127] 探针固定于支持物上也为本领域技术人员已知，可以提及的是通过直接转移、显微沉积(microdeposition)、原位合成及光刻术固定探针。
[0128] 生物学样品中编码感兴趣的肿瘤标记物的基因中的DNA修饰或异常的证实可以通过确定样品中DNA改变的任何方法进行，即直接检测突变，或者证实感兴趣的基因座的甲基化模式改变，或者通过本领域技术人员已知的确定样品中DNA改变的任何其它方法进行。
[0129] 突变可包括一个核苷酸由另一个核苷酸取代、缺失一或多个核苷酸以及插入一或多个核苷酸。所述突变可位于感兴趣的肿瘤标记物基因的编码区，或者位于5’和3’非编码区，如转录启动子区或者转录终止区。
[0130] 证实突变的策略基于分子生物学技术，包括如下步骤：DNA提取、PCR扩增或者另一扩增技术、杂交和/或测序。在结肠直肠癌情况中，如下方法已经成功用于检测粪便DNA中的突变：通过沉淀浓缩DNA，使用磁珠上的捕获寡核苷酸使靶富集，PCR扩增感兴趣的基因，固相测序以鉴别点突变64。根据预期参考片段与突变片段之间大小的差异鉴别缺失。64
Imperiale等 描述了位于K-ras、APC和p53基因中的一组21个突变，使得可以检测16/31侵润性癌。
Imperiale等 描述了位于K-ras、APC和p53基因中的一组21个突变，使得可以检测16/31侵润性癌。
[0131] 其它使用的DNA标记物是BAT-26缺失，其是微卫星不稳定性的标记物，以及称作长DNA(L-DNA)的可高度扩增的DNA，其不是特异性标记物，但是似乎反映结肠腔中脱落的肿瘤细胞的紊乱的凋亡65。这些标记物在灵敏性或特异性方面均不令人满意。
[0132] 如前所述，DNA改变也可相应于感兴趣的肿瘤标记物基因的甲基化模式的修饰。所述甲基化模式的修饰可相应于低甲基化(甲基化数目减少)或者高甲基化(甲基化数目增多)。改变的单位位于感兴趣的肿瘤标记物基因的编码区内，或者位于5’和3’非编码区，如转录启动子区或者转录终止区。
[0133] DNA甲基化的分析可以使用基于定性和/或定量PCR的技术进行，如MSP(甲基化特异性PCR)、亚硫酸氢盐测序、结合PCR用甲基化敏感的限制酶消化、COBRA(组合亚硫酸氢盐限制分析)和Ms-SNuPE(甲基化敏感的单核苷酸引物延伸)。所有这些技术均已经充分综述66
以及在方法学文章中详细描述 。
以及在方法学文章中详细描述 。
[0134] 在文献中已经报道了在结肠直肠癌病例中的一些高甲基化基因。例如可以提及的是ALX4(无芒样同源框-4)基因56、TPEF/HHP1(含有表皮生长因子和卵泡抑素结构域的跨膜蛋白)基因的启动子区67或者septin-9基因68。
[0135] 在本发明方法中，当检测至少两个标记物时，可以例如使用不同的免疫测定或者在同时多元测定中单独证实。
[0136] 在本发明方法中，当检测不同性质的两个标记物时，例如蛋白质标记物和mRNA标记物，可以使用选自上述那些的两种不同检测方法。它们也也可以在系统反应条件下在同一检测介质中同时检测，如专利申请WO 03/104490所述。这个专利申请中描述的检测方法包括如下步骤，该检测方法包括同时检测样品中的杂交和免疫反应，可含有由至少一种核酸和不同性质的至少一种其它配体组成的靶分析物：
[0137] (i)将已知体积的在反应缓冲液中稀释的样品沉积在用所述靶分析物的捕获配偶体预先包被的捕获表面上，所述捕获配偶体包含至少一个核酸探针和至少一个抗配体，[0138] (ii)在介于15℃-60℃之间的温度下反应，
[0139] (iii)观测因此获得的杂交和免疫反应。
[0140] 所述生物学样品可能需要特殊处理，因为其可能含有本发明方法寻找的肿瘤标记物，或者另外其可能含有具有本发明方法寻找的标记物的循环肿瘤细胞，和/或能分泌本发明方法寻找的标记物的循环肿瘤细胞。
[0141] 因此，根据本发明的一个实施方案，对生物学样品进行预处理以分离所述液体中含有的循环肿瘤细胞。
[0142] 短语“分离循环肿瘤细胞”是指获得富含循环肿瘤细胞的细胞级分。
[0143] 可以通过如下方式对生物学样品进行处理以分离循环肿瘤细胞：在流式细胞仪中进行细胞淘选，在Ficoll上富集，用特异性抗体包被的磁珠富集，或者使用本领域技术人员已知的特异性富集的任何其它方法。
[0144] 在血液作为生物学样品的情况中，循环肿瘤细胞可以通过如下技术分离，即在Ficoll上分离细胞，组合使用与磁珠结合的抗-CD45抗体耗竭血细胞(Dynal Biotech ASA,Norway)。
[0145] 可以通过如下方式使用分离自生物学样品的循环肿瘤细胞直接进行本发明方法中探求的肿瘤标记物检测，即在通过细胞离心涂片器使循环肿瘤细胞沉积在载玻片上之后，例如通过用本发明方法寻找的肿瘤标记物的抗体对这些细胞进行免疫细胞化学标记。也可以在循环肿瘤细胞中直接进行本发明方法寻找的肿瘤标记物的检测，使用如Métézeau等69所述的流式细胞术进行。
[0146] 在这些条件下，所述循环细胞可以在一定条件下处理，以使其能在所述细胞内部阻断本发明方法寻找的肿瘤标记物。这种处理由Mathieu等70描述。
[0147] 在使得细胞膜可渗透以使特异于本发明方法寻找的标记物的结合配偶体能进入细胞之后，进行本发明方法寻找的肿瘤标记物的检测。
[0148] 基于循环细胞直接检测本发明方法中使用的肿瘤标记物也可以通过ELISPOT方法进行，例如通过本申请人申请的专利申请WO 03/076942中描述的方法进行。这种方法是检测和/或量化生物学样品的循环肿瘤细胞，该细胞在体外能释放或分泌一或多种肿瘤标记物，所述方法包括如下步骤：
[0149] (i)使一定量的所述细胞沉积于培养表面的底部，该底部附着了特异于所述肿瘤标记物的至少一种结合配偶体，
[0150] (ii)在一定条件下培养所述细胞，使其释放或分泌所述肿瘤标记物，该标记物被免疫捕获于所述培养表面的底部，
[0151] (iii)通过洗涤除去细胞，
[0152] (iv)加入特异于所述肿瘤标记物的至少一种标记的缀合物，及
[0153] (v)观测由此获得的标记。
[0154] 直接检测肿瘤细胞中本发明方法使用的肿瘤标记物也可以在所述细胞的培养基中进行，在一定条件下培养细胞，由此其分泌本发明方法中使用的肿瘤标记物，之后进行检测。
[0155] 释放肿瘤标记物或者肿瘤标记物表达的培养条件是常规条件，如37℃湿化环境及5％CO2的条件。
[0156] 当生物学样品是固体样品时，肿瘤标记物的存在也可以在体内、在肿瘤原位示出。
[0157] 为了在体内在肿瘤中示出肿瘤标记物的存在，可以使用本领域技术人员已知的任何成像技术。为此，所述肿瘤标记物的结合配偶体可以与成像示踪剂结合。
[0158] 术语“结合配偶体与成像示踪剂的结合”是指能通过本领域技术人员已知的任何成像方法检测的示踪剂或者直接或间接产生可检测信号的示踪剂的附着。因此，所述示踪剂可以是放射性示踪剂，如锝-99。在这种情况中，具有原发癌或者转移癌的器官将结合所述肿瘤标记物及其示踪剂。可以用特殊相机如γ-相机使由该器官发射的放射线成像。该设备收集由放射性物质产生的闪烁，并因此可以观测所述器官。
[0159] 在本发明另一方法中，所述示踪剂可包含发射正电子的放射性物质(氟18)。然后通过正电子发射断层成像系统成像。
[0160] 在本发明另一优选方法中，肿瘤标记物的配偶体可以与纳米粒子结合。所述纳米粒子可以例如是超磁性(supramagnetic)纳米粒子，如用于指导细胞标记和通过核磁共振成像技术在体内检测的阴离子磁性纳米粒子。它们也可以是金纳米粒子。
[0161] 利用可以在体内检测肿瘤标记物的本发明方法，可以观测身体中结合肿瘤标记物的结合配偶体的区域、产生肿瘤标记物的癌瘤，特别是在结肠直肠癌中，以及其远离转移癌的位置和包含的淋巴结的位置。
[0162] 本发明的方法不仅可用于结肠直肠癌的早期诊断，也可以用于结肠直肠癌的筛选、治疗随诊、预后及复发诊断，因为只有癌细胞分泌LEI，且其产生依赖于癌的级别，这些方面组成了本发明的另一方面。
[0163] 本发明通过如下实施例以及附图1-21得以更清晰地理解，这些实施例只是例证本发明而不限制本发明之意。
[0164] -图1是通过ELISA分析结肠直肠癌患者(CRC+)和健康个体(CRC-)血清中LEI(ng/ml)的图示，
[0165] -图2是通过ELISA分析结肠直肠癌患者(CRC+)和健康个体(CRC-)血清中埃兹蛋白(ng/ml)的图示，
[0166] -图3是通过ELISA分析结肠直肠癌患者(CRC+)和健康个体(CRC-)血清中酰化氨基酸水解酶1(ng/ml)的图示，
[0167] -图4是通过ELISA分析结肠直肠癌患者(CRC+)和健康个体(CRC-)血清中L-FABP(ng/ml)的图示，
[0168] -图5是通过ELISA分析结肠直肠癌患者(CRC+)和健康个体(CRC-)血清中I-FABP(pg/ml)的图示，
[0169] -图6是通过ELISA分析结肠直肠癌患者(CRC+)和健康个体(CRC-)血清中载脂蛋白AI(μg/ml)的图示，通过微滴定平板ELISA(图6A)或者使用Lincoplex试剂盒(图6B)，[0170] -图7是使用Linco多元试剂盒分析结肠直肠癌患者(CRC+)和健康个体(CRC-)血清中载脂蛋白AII(μg/ml)的图示，
[0171] -图8是通过ELISA分析结肠直肠癌患者(CRC+)和健康个体(CRC-)血清中I-丝束蛋白的RFV(相对荧光值)的图示，
[0172] -图9是通过ELISA分析结肠直肠癌患者(CRC+)和健康个体(CRC-)血清中β2-微球蛋白(ng/ml)的图示，
[0173] -图10是通过ELISA分析结肠直肠癌患者(CRC+)和健康个体(CRC-)血清中CEA(ng/ml)的图示，
[0174] -图11是通过ELISA分析结肠直肠癌患者(CRC+)和健康个体(CRC-)血清中CA19-9(U/ml)的图示，
[0175] -图12是通过ELISA分析结肠直肠癌患者(CRC+)和健康个体(CRC-)血清中睾酮(ng/ml)的图示，
[0176] -图13是通过ELISA分析结肠直肠癌患者(CRC+)和健康个体(CRC-)血清中E-钙粘蛋白(ng/ml)的图示，
[0177] -图14是通过ELISA分析结肠直肠癌患者(CRC+)和健康个体(CRC-)血清中PAP1(ng/ml)的图示，
[0178] -图15是通过ELISA分析结肠直肠癌患者(CRC+)和健康个体(CRC-)血清中半乳凝素-3的RFV的图示，
[0179] -图16是通过ELISA分析结肠直肠癌患者(CRC+)和健康个体(CRC-)血清中LDH(ng/ml)的图示，
[0180] -图17是通过ELISA分析结肠直肠癌患者(CRC+)和健康个体(CRC-)血清中蛋白酶体20S(ng/ml)的图示，
[0181] -图18是通过ELISA分析结肠直肠癌患者(CRC+)和健康个体(CRC-)粪便中酰化氨基酸水解酶1(ng/ml)的图示，
[0182] -图19是通过ELISA分析结肠直肠癌患者(CRC+)和健康个体(CRC-)粪便中半乳凝素-3的RFV的图示，
[0183] -图20是通过ELISA分析结肠直肠癌患者(CRC+)和健康个体(CRC-)粪便中蛋白酶体20S的RFV的图示，
[0184] -图21是对LEI、埃兹蛋白和半乳凝素-3进行ELISPOT测定的示意图，示出Caco-2、HT-29和HT29-B6的每106个癌细胞的斑点数目。
[0185] 实施例1：编码肿瘤标记物的基因的克隆与重组蛋白质的表达
[0186] 1.cDNA扩增与克隆
[0187] 将Caco-2结肠直肠癌细胞系在DMEM培养基中培养，该培养基含有2mM的L-谷氨酰胺，不含FCS(胎牛血清)(均来自Gibco)。
[0188] 为了克隆LEI、L-FABP和Gal-3基因，从108个Caco-2细胞沉淀中提取信使RNA，使用Invitrogen FastTrack 2.0试剂盒(Cat.No.45-0019)根据厂商提供的方案进行。在一个步骤中进行逆转录和PCR，使用450ng的Caco-2 mRNA及Superscript III One Step RT-PCR System试剂盒(Invitrogen Cat.No.12574-018)以及使用Platinum Taq DNA聚合酶，根据厂商提供的方案进行。用于基因扩增的PCR引物在表1中提供。
[0189] 表1
[0190]
[0191] 将获得DNA片段通过使用TA克隆试剂盒(Invitrogen Cat.No.K4520-01)克隆进载体pCR2.1TOPO(LEI和Gal-3)中，或者克隆进用Bsm BI和Xba I消化后的来自Origene的载体pCMV6-XL4(L-FABP)中。对质粒进行测序，以核实cDNA确实符合预期序列。
[0192] 对于编码酰化氨基酸水解酶1的基因的克隆，使用来自Qiagen的RNA Easy Mini试剂盒根据厂商提供的方案从108个Caco-2细胞沉淀中提取总RNA。使用10ng的Caco-2RNA和Superscript II酶(Invitrogen)根据厂商提供的方案进行逆转录。该逆转录引物是oligo(dT)。
[0193] 得自这个反应的cDNA用作PCR中模板，使用AccuPrime Pfx试剂盒(Invitrogen Cat.No.12344-024)根据厂商提供的方案进行反应。所述PCR引物是：ACY-1Fwd2(SEQ ID No.7:5’-GCGAATTCTTTAAGAAGGAGATATACATATGACGAGCAAAGGTCCG GAAGAGGAGCACCCATCG-3’)和ACY-1Rev(SEQ ID No.8:5’-GCAAGCTTCAGCTGTCACTGGGCAGGGC-3’)。
[0194] 在这些条件下，可以扩增1.3kb片段，将其克隆进Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒型克隆载体(Invitrogen Cat.No.K2820-20)中。对这个质粒测序以核实cDNA确实符合预期序列。
[0195] 通过化学合成方法获得含有I-FABP开放读框的如下DNA片段(SEQ ID No.9)，该合成由Geneart公司进行。
[0196] SEQ ID No.9:
[0197]GGTACCGAATTCCGCGTTTGACAGCACTTGGAAGGTAGACCGGAGTGAAAACTATGACAAGTTCATGGAAAAAATGGGTGTTAATATAGTGAAAAGGAAGCTTGCAGCTCATGACAATTTGAAGCTGACAATTACACAAGAAGGAAATAAATTCACAGTCAAAGAATCAAGCGCTTTTCGAAACATTGAAGTTGTTTTTGAACTTGGTGTCACCTTTAATTACAACCTAGCAGACGGAACTGAACTCAGGGGGACCTGGAGCCTTGAGGGAAATAAACTTATTGGAAAATTCAAACGGACAGACAATGGAAACGAACTGAATACTGTCCGAGAAATTATAGGTGATGAACTAGTCCAGACTTATGTGTATGAAGGAGTAGAAGCCAAAAGGATCTTTAAAAAGGATTCTAGAGTCGACGAGCTC。
[0198] 2.表达载体构建
[0199] 将编码LEI和半乳凝素-3的基因亚克隆进原核表达载体pMR7871中，以及将L-FABP基因克隆进载体pET3d(New England Biolabs)中。使用质粒pCR2.1TOPO-LEI、pCR2.1TOPO-Gal-3和pCMV6-LFABP作为模板通过PCR导入克隆所需的限制位点。所述PCR酶是Promega Pfu DNA聚合酶，PCR反应根据厂商指导进行，引物示于表2中。
[0200] 表2
[0201]
[0202] 将含有编码LEI或半乳凝素-3的开放读框的PCR产物用Eco RI和Hind III限制酶消化。将片段导入用相同的酶限制的载体pMR78中(质粒pMR-LEI和pMR-Gal-3)。载体pMR78含有与表达的蛋白质符合读框的6-组氨酸序列，使得可以通过金属螯合亲和层析纯化。将L-FABP PCR产物克隆进载体pET3d中Nco I和Bam HI限制位点。
[0203] 对于酰化氨基酸水解酶1，将TOPO克隆载体直接用Eco RI和Hind III限制酶消化，以产生含有acy1开放读框的1.3kb片段，其被导入pStaby1(Eurogentec)中。该重组质粒被称作pStaby1-ACY。
[0204] 对于I-FABP，将由Geneart提供的克隆载体用Eco RI和Sal I限制酶消化，以产生含有编码序列的大约400bp片段，将其导入载体pMRCH79(衍生自载体pMR78，bioMérieux)中。该重组质粒被称作pMRCH-IFABP。
[0205] 可以分别表达与GST(谷胱甘肽S-转移酶)融合的埃兹蛋白和I-丝束蛋白的质粒pGEX-埃兹蛋白和pGEX-I-丝束蛋白由Institut Curie提供。
[0206] 3.重组蛋白质表达与纯化
[0207] 将产生重组肿瘤标记物的表达质粒导入大肠杆菌BL21及其衍生物(Stratagene)中。在室温摇动培养。每种蛋白质的精确培养条件示于表3中。IPTG是异丙基-β-D-1-硫代半乳糖酶。
[0208] 将细菌沉淀置于2×PBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液中，并以1.5kbar通过细胞粉碎机(Constant System)。将裂解产物在3000g在4℃离心30分钟。上清含有可溶蛋白质。所述沉淀含有包涵体。增溶包涵体的缓冲液根据所述蛋白质而定。
[0209] 对于LEI，在含有5mL的Ni-NTA-Sepharose树脂(Qiagen)的柱上使用可溶分级分离法进行纯化，蛋白质用含有450mM咪唑的2×PBS pH 7.5洗脱。
[0210] 对于半乳凝素-3，将包涵体在含有1M尿素的2×PBS中溶解，经过5mL的Ni-NTA-Sepharose树脂柱(Qiagen)，用含有450mM咪唑和1M尿素的2×PBS pH 7.5洗脱Gal-3蛋白。
[0211] 对于L-FABP，使用可溶分级分离法进行纯化，使用来自Macherey-Nagel的Ni-IDA试剂盒。
[0212] 表3
[0213]
[0214] 对于GST-埃兹蛋白，通过GST亲和层析，使用在含有8M尿素和10mM DTT的100mM Tris缓冲液中溶解的包涵体进行纯化。使用含有5mL谷胱甘肽琼脂糖4快速流动凝胶(Amersham)的层析柱。平衡和洗涤缓冲液是含有0.05％Tween 20的2×PBS。洗脱缓冲液是含有20mM还原的谷胱甘肽的50mM Tris-HCl(pH 8)。
[0215] 对于酰化氨基酸水解酶1，将培养物的可溶级分经过Amersham HiTrap Q FF柱，并且使用0.3M NaCl(pH 7.5)洗脱ACY-1蛋白。由于一些其它蛋白质在这些条件下被共洗脱，因此继续在疏水性相互作用柱(HIC Phenyl HP,Amersham)上进行纯化。使用0.5M NaCl(pH 7)洗脱ACY-1蛋白。
[0216] 重组GST-I-丝束蛋白蛋白由Institut Curie以纯化形式提供。
[0217] 重组钙网蛋白蛋白由Proteus Services for Industry(Dijon,France)公司生产。编码钙网蛋白的序列通过化学合成方法获得。
[0218] 实施例2：肿瘤标记物的单克隆抗体的产生
[0219] 1.动物模型
[0220] 对6-8周龄的雌性BALB/c(H-2d)小鼠在第一次免疫时进行免疫试验。
[0221] 2.免疫原和免疫
[0222] 为了增加在小鼠中获得的免疫应答以及为了能产生单克隆抗体，根据实施例1所述的程序产生重组蛋白质形式的肿瘤标记物。LDH蛋白得自SciPac公司(Cat.No.103-133)。这些蛋白质与Freund’s佐剂(Sigma)混合，所述佐剂以油包水乳状液形式制备，且已知其具有良好的免疫原性。每种肿瘤标记物免疫3只小鼠。小鼠在第0、2和4周连续接受3次10μg剂量。所有注射均是皮下注射。第一次注射给予与完全Freund’s佐剂的混合物，随后两次注射给予与不完全Freund’s佐剂的混合物。在第一次注射后D50-D70之间，通过静脉内注射100μg该重组蛋白质再次刺激体液应答。
[0223] 3.监测体液应答的出现
[0224] 为了监测抗体的出现，定期从小鼠取血样。使用ELISA检测抗-肿瘤标记物抗体的存在。感兴趣的蛋白质用于捕获(1μg/孔)；饱和后，使抗原与不同稀释度的检测血清反应(在37℃保温1小时)。血清中特异性抗体的存在通过使用与碱性磷酸酶缀合的结合寻找的抗体的AffiniPure山羊抗-小鼠IgG抗体(H+L,Jackson Immunoresearch,Cat no.115-055-146)(0.1μg/well)表明。
[0225] 4.单克隆抗体的产生
[0226] 在最后一次注射每种肿瘤标记物3天后，处死一只免疫的小鼠。取血液和脾。将得自脾的脾细胞与Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞一起培养，以使其融合并变成永生化，根据and Milstein所述方案72,73进行。在保温12-14天之后，筛选获得的杂交瘤上清以确定抗肿瘤标记物抗体的存在，使用在这个实施例第3点描述的ELISA测定。当GST融合蛋白用作免疫原时，针对GST的克隆通过使用未结合的GST捕获进行ELISA筛选得以消除。根据限制稀释技术将阳性杂交瘤集落亚克隆两次，这种技术为本领域技术人员熟知。
[0227] 5.通过免疫印迹鉴定单克隆抗体
[0228] 针对各种肿瘤标记物获得的单克隆抗体列于表4中。通过Western印迹技术分析这些单克隆抗体。
[0229] 表4
[0230]
[0231] 5.1.方法学
[0232] 制备Caco-2和HT-29细胞培养提取物，通过用含有8.3M尿素、2M硫脲、4％3-[(3-胆胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、100mM DTT、2％Servalyte 4-9(Serva,Heidelberg,Germany)和0.1g/l Orange G的600μl水溶液溶解细胞沉淀，然后根据NuPAGE Novex凝胶样品制备方案(Invitrogen)进行处理。为了获得组织提取物，使用手术刀切下GHBD001、GHBD004和CLSP109患者的肿瘤和粘膜活检组织，然后使用50-μm Medicons以及1ml含有2.5mM EDTA和蛋白酶抑制剂(片剂，Roche)的PBS缓冲液在Medimachine系统(Becton Dickinson)中提取10次。集合这些10ml的细胞悬浮液，制成25ml，然后在600g离心15分钟。
上清相应于根据NuPAGE Novex凝胶样品制备方案处理的组织提取物。使用还原的样品，最终总蛋白质浓度为0.4mg/ml。在NuPAGE Novex Bis-Tris 4-12％凝胶上沉积体积为20μl/孔，使用MOPS运转缓冲液。在迁移(200V，1小时)及转移至PVDF膜(400mA，45分钟)之后，通过用氨基黑染色评定转移物的性质。
上清相应于根据NuPAGE Novex凝胶样品制备方案处理的组织提取物。使用还原的样品，最终总蛋白质浓度为0.4mg/ml。在NuPAGE Novex Bis-Tris 4-12％凝胶上沉积体积为20μl/孔，使用MOPS运转缓冲液。在迁移(200V，1小时)及转移至PVDF膜(400mA，45分钟)之后，通过用氨基黑染色评定转移物的性质。
[0233] 将该膜用在TNT(15mM Tris、0.14M NaCl、0.5％Tween 20，pH 8)溶液中的5％脱脂乳(Régilait)在室温饱和1小时。在饱和后，将该膜与在饱和溶液中稀释为10μg/ml的各种检测抗体一起保温1小时。在用TNT漂洗后，将该膜在室温与在饱和溶液中稀释为1:5000的抗小鼠-辣根过氧化物酶缀合物(Cat No.115-035-062,Jackson Immunoresearch)保温1小时。在漂洗后，使用Substrate Supersignal West Dura Extended试剂盒(Cat No.34076,Pierce)根据推荐的使用指导进行显影。
[0234] 使用来自Biorad的VersaDoc成像系统测量该膜上的化学发光信号。基于Western印迹成像，使用QuantityOne软件(Bio-Rad)评估相应于各种肿瘤标记物的条带的体积。所述体积相应于条带的表面积乘以化学发光信号的强度。
[0235] 5.2.结果
[0236] Western印迹结果示于表5，表中示出了Western印迹分析的相应于感兴趣的肿瘤标记物的条带的体积，其是检测的各个样品的函数。这些结果示出检测的肿瘤标记物确实由Caco-2和HT-29结肠癌细胞系表达，而且也在组织中表达，这些根据使用得自该患者的肿瘤和粘膜的提取物示出。可以对比使用抗体在样品上获得的信号强度与使用其它样品和相同抗体获得信号强度。所用技术使得可以证实组织(非远离样品)中所述标记物的存在与否，以及抗体对于标记物的特异性。这个技术不用于这个实施例的远离样品中，因为其不可以推断远离样品中肿瘤标记物的存在与否，也不可以确定所述样品中所述肿瘤标记物的浓度是否增加或降低。此外，使用的实验方案不能对比一种抗体的反应性与另一种抗体的反应性。
[0237] 表5
[0238]
[0239] NT:未检测。
[0240] 5.3.抗I-丝束蛋白的单克隆抗体
[0241] 在GHBD004患者中，8C8C5抗体未使得对应I-丝束蛋白的条带显色或者仅微弱显色。这些样品中I-丝束蛋白的存在可以通过使用例如8G2D2抗体证实，该抗体在印迹中对于I-丝束蛋白具有较好亲和性。
[0242] 由于I-丝束蛋白是包含具有70％以上同源性的两个其它同种型(L-丝束蛋白和T-丝束蛋白)的蛋白质家族成员，我们检测了获得的单克隆抗体的所有克隆与GST-丝束蛋白-L和GST-丝束蛋白-T蛋白质(Institut Curie提供)的反应性。在这个筛选结束时，我们选择与其它家族成员不具有任何交叉反应性的克隆3D11D10、8C8C5、3A3H2和8G2D2。这些抗体确实特异于I-丝束蛋白同种型。
[0243] 实施例3：肿瘤标记物的血清测定
[0244] 1.患者和样品
[0245] 根据2个Huriet-law协议，血样收集自分布于法国的8个临床中心网。
[0246] 为了获得血清，将该血样置于干燥试管中。为了获得血浆，将该血样置于EDTA试管中。在凝固后，将试管以1000g离心10分钟，取出血清，等份并在-80℃贮存。将血浆试管以1000g直接离心10分钟，取出血浆，等份并在-80℃贮存。样品完全记录了病人的病史。
[0247] 2.LEI肿瘤标记物的血清测定
[0248] 使用实施例2中描述的抗体以及使用 自动化设备(bioMérieux)进行ELISA以测定LEI蛋白。为此，使用 HBs Ag Ultra试剂盒(bioMérieux,Cat.No.30315)的试剂进行ELISA。该试剂如相应的信息页(ref.11728D–FR–2005/05)所述使用，具有如下修改：
[0249] 1.离心管用10μg/ml浓度的捕获抗体10E1H1敏化。
[0250] 2.HBs Ag Ultra cartridge第二个孔的内容物用300μl在 HBs Ag Ultra试剂盒的第二个孔的缓冲液(具有山羊血清和1g/l叠氮化钠的缓冲液)中稀释为1μg/ml的与生物素结合的揭示抗体21B10A5替换。
[0251] 3.将血清、血浆或者粪便样品(50μl)在HBs Ag Ultra cartridge的第二个孔中直接稀释，所述样品是纯的或者在 HBs Ag Ultra试剂盒的第二个孔的缓冲液(具有山羊血清和1g/l叠氮化钠的缓冲液)中1/20稀释。
[0252] 4.使用 自动化设备和HBs Ag Ultra试剂盒的方案进行ELISA。
[0253] 5.在减去背景噪音之后获得粗略值(crude value)形式的结果(在反应之前读取底物)。
[0254] 通过测定重组蛋白质形式的肿瘤标记物的浓度范围制定标准曲线。绘制的该标准曲线的x轴是报道的肿瘤标记物浓度，y轴是由 读取的信号(RFV或者相对荧光数值)。检测的体液(血液、血清、血浆、粪便)中存在的肿瘤标记物的浓度通过报道的相应于读取的RFV信号的浓度计算。表6给出了在Vidas自动装置上通过ELISA测定患者的
血清LEI的结果。
血清LEI的结果。
[0255] 表6
[0256]
[0257]
[0258] a:CRC+:结肠直肠癌患者；CRC-:健康个体
[0259] b:TNM:组织侵润阶段(T)、淋巴结侵润(N)及远处侵润(转移，M)
[0260] 分析患者获得的量示于图1。在该图中，注意到IV期结肠直肠癌患者的3份血清及III期结肠直肠癌患者的1份血清示出其血清LEI的量明显增加。
[0261] 3.埃兹蛋白肿瘤标记物的血清测定
[0262] 使用实施例2中描述的抗体以及使用 自动化设备(bioMérieux)进行ELISA以测定埃兹蛋白蛋白。为此，使用 HBs Ag Ultra试剂盒(bioMérieux,
Cat.No.30315)的试剂进行ELISA。该试剂如相应的信息页(ref.11728D–FR–2005/05)所述使用，具有如下修改：
Cat.No.30315)的试剂进行ELISA。该试剂如相应的信息页(ref.11728D–FR–2005/05)所述使用，具有如下修改：
[0263] 1.离心管用30μg/ml浓度的捕获抗体4A9H5敏化。
[0264] 2.HBs Ag Ultra cartridge第二个孔的内容物用300μl在 HBs Ag Ultra试剂盒的第二个孔的缓冲液(具有山羊血清和1g/l叠氮化钠的缓冲液)中稀释为1μg/ml的与生物素结合的揭示抗体4A7A6C1替换。
[0265] 3.将血清、血浆或者粪便样品(50μl)在HBs Ag Ultra cartridge的第二个孔中直接稀释。
[0266] 4.使用 自动化设备和HBs Ag Ultra方案进行ELISA，其中样品与捕获抗体和揭示抗体的保温步骤进行100次循环。
[0267] 5.在减去背景噪音之后获得粗略值(crude value)形式的结果(在反应之前读取底物)。
[0268] 检测的体液(血液、血清、血浆、粪便)中存在的肿瘤标记物的浓度通过第2段关于测定LEI所述方法计算。
[0269] 分析患者获得的量示于图2。在该图中，注意到IV期结肠直肠癌患者的3份血清示出其血清埃兹蛋白的量明显增加。
[0270] 4.酰化氨基酸水解酶1肿瘤标记物的血清测定
[0271] 使用实施例2中描述的抗体以及使用 自动化设备(bioMérieux)进行ELISA以测定酰化氨基酸水解酶1蛋白。为此，使用 HBs Ag Ultra试剂盒(bioMérieux,
Cat.No.30315)的试剂进行ELISA。该试剂如相应的信息页(ref.11728D–FR–2005/05)所述使用，具有如下修改：
Cat.No.30315)的试剂进行ELISA。该试剂如相应的信息页(ref.11728D–FR–2005/05)所述使用，具有如下修改：
[0272] 1.离心管用20μg/ml浓度的捕获抗体2A7F6敏化。
[0273] 2.HBs Ag Ultra cartridge第二个孔的内容物用300μl在 HBs Ag Ultra试剂盒的第二个孔的缓冲液(具有山羊血清和1g/l叠氮化钠的缓冲液)中稀释为1μg/ml的与生物素结合的揭示抗体11H7D9替换。
[0274] 3.将血清、血浆或者粪便样品(100μl)在HBs Ag Ultra cartridge的第二个孔中直接稀释。
[0275] 4.使用 自动化设备和HBs Ag Ultra方案进行ELISA，其中样品与捕获抗体和揭示抗体的保温步骤进行100次循环。
[0276] 5.在减去背景噪音之后获得粗略值(crude value)形式的结果(在反应之前读取底物)。
[0277] 检测的体液(血液、血清、血浆、粪便)中存在的肿瘤标记物的浓度通过第2段关于测定LEI所述方法计算。
[0278] 分析患者获得的量示于图3。在该图中，注意到II期结肠直肠癌患者的1份血清、III期结肠直肠癌患者的1份血清以及IV期结肠直肠癌患者的2份血清示出血清酰化氨基酸水解酶1的量明显增加。
[0279] 5.L-FABP肿瘤标记物的血清测定
[0280] 使用Hycult Biotechnology公司销售的ELISA试剂盒测定人L-FABP蛋白(Cat.No.HK404)。这个试剂盒可以量化细胞培养上清或者血清、血浆或尿液中的L-FABP蛋白，以确定肝脏损害的存在。我们遵循厂商推荐的程序，有两处修改：保温在37℃而不是在室温进行，在测定之前血清稀释为1/10。L-FABP蛋白的测定可以通过本领域技术人员熟知的备选技术进行。
[0281] 图4示出这项分析的结果。在检测的血清中，141个结肠直肠癌患者中的41个患者的血清L-FABP浓度高于17ng/ml，而在对照组中，无个体的血清L-FABP浓度超过这个数值。在这41个患者中，I期结肠直肠癌患者8个、II期结肠直肠癌患者8个、III期结肠直肠癌患者
13个，IV期结肠直肠癌患者12个。观测的141个结肠直肠癌患者的平均血清L-FABP浓度是
16.6±1.3ng/ml。112个健康个体的平均值为6.6±0.2ng/ml(阴性对照)。这个差异具有显著统计学意义(P<0.0001，单侧t-检验，使用Welch’s校正不等方差)。
13个，IV期结肠直肠癌患者12个。观测的141个结肠直肠癌患者的平均血清L-FABP浓度是
16.6±1.3ng/ml。112个健康个体的平均值为6.6±0.2ng/ml(阴性对照)。这个差异具有显著统计学意义(P<0.0001，单侧t-检验，使用Welch’s校正不等方差)。
[0282] 6.I-FABP肿瘤标记物的血清测定
[0283] 使用Hycult Biotechnology公司销售的ELISA试剂盒，测定人I-FABP蛋白(Cat.No.HK406)。这个试剂盒可以量化细胞培养上清或者血清、血浆或尿液中的I-FABP蛋白，以确定小肠中缺血性损害的存在。我们遵循厂商推荐的程序。可以通过本领域技术人员熟知的备选技术测定I-FABP蛋白。
[0284] 图5示出这项测定的结果。在检测的血清中，40个结肠直肠癌患者中有15个患者的血清I-FABP浓度高于40pg/ml，而在对照组中，24个个体中仅2个个体超过这个数值。更明显地，I期结肠直肠癌患者的3份血清、III结肠直肠癌患者的2份血清以及IV期结肠直肠癌患者的1份血清的血清I-FABP浓度高于100pg/ml。在CRC-对照组中未发现高于此数值的浓度。
[0285] 7.载脂蛋白AI肿瘤标记物的血清测定
[0286] 通过两种不同的免疫测定技术测定血清载脂蛋白AI。首先，使用微滴定平板夹心ELISA。将96孔平板用1μg/孔的抗-Apo AI单克隆抗体-克隆1404(Biodesign Cat.No.H45404)包被。在用PBS-0.05％Tween 20(PBS-T)洗涤3次后，将该平板用在PBS-T中
10％奶粉在37℃饱和1小时。将该平板再于PBS-T中洗涤3次，将检测血清样品的100μl标准范围稀释液或者100μl的1/100 000稀释液沉积于平板上，将该平板在37℃保温2小时。所述标准范围是通过将Apo AI蛋白(Biodesign Cat.No.A50620H)在PBS-T,BSA 1％(1.6-
100ng/ml)中稀释而制备。在用PBS-T洗涤3次后，加入0.1μg/孔与辣根过氧化物酶结合的多克隆检测抗体(Biodesign Cat.No.K45452P)，将该平板在37℃保温2小时。再次用PBS-T洗涤3次后，加入100μl/孔的OptEIA底物(BD)。20分钟后，当发生生色时，用2N硫酸结束反应，在450nm测量吸光度。
10％奶粉在37℃饱和1小时。将该平板再于PBS-T中洗涤3次，将检测血清样品的100μl标准范围稀释液或者100μl的1/100 000稀释液沉积于平板上，将该平板在37℃保温2小时。所述标准范围是通过将Apo AI蛋白(Biodesign Cat.No.A50620H)在PBS-T,BSA 1％(1.6-
100ng/ml)中稀释而制备。在用PBS-T洗涤3次后，加入0.1μg/孔与辣根过氧化物酶结合的多克隆检测抗体(Biodesign Cat.No.K45452P)，将该平板在37℃保温2小时。再次用PBS-T洗涤3次后，加入100μl/孔的OptEIA底物(BD)。20分钟后，当发生生色时，用2N硫酸结束反应，在450nm测量吸光度。
[0287] 图6A示出这项测定的结果。我们证实结肠直肠癌患者中Apo AI的血清浓度降低。38个I期-IV期CRC患者中的平均浓度为675±36μg/ml，而在27个健康个体(对照组)中其平均值更高：1040±39μg/ml。这个差异具有显著统计学意义(P<0.0001，单侧t-检验)。作为对比，使用夹心ELISA技术，在13个肝癌患者中Apo AI的平均血清浓度为1175±87μg/ml。血清浓度降低证实Apo AI因此是结肠直肠癌的特异性标记物，可以通过免疫测定证实这种降低。
[0288] 使用的第二种测定技术是Linco公司销售的多元测定法，其可以在同一样品中同时测定一些载脂蛋白，包括AI和AII(Cat.No.APO-62K).。使用厂商推荐的程序进行。
[0289] 图6B示出这项测定的结果。使用该第二种技术证实CRC患者中Apo AI血清浓度降低。34个I期-IV期CRC患者中Apo AI平均浓度为768±30μg/ml，而在17个健康个体(对照组)中其平均值更高：1194±51μg/ml。这个差异具有显著统计学意义(P<0.0001，单侧t-检验)。
[0290] 8.载脂蛋白AII肿瘤标记物的血清测定
[0291] 使用Linco多元试剂盒测定血清载脂蛋白AII。图7示出这项测定的结果。我们证实结肠直肠癌患者中Apo AII的血清浓度降低。34个I期-IV期CRC患者中Apo AII平均浓度为170±11μg/ml，而在17个健康个体(对照组)中其平均值更高：277±16μg/ml。这个差异具有显著统计学意义(P<0.0001，单侧t-检验)。
[0292] 9.I-丝束蛋白肿瘤标记物的血清测定
[0293] 使用实施例2中描述的抗体以及使用 自动化设备(bioMérieux)进行ELISA以测定I-丝束蛋白蛋白。为此，使用 HBs Ag Ultra试剂盒(bioMérieux,
Cat.No.30315)的试剂进行ELISA。该试剂如相应的信息页(ref.11728D–FR–2005/05)所述使用，具有如下修改：
Cat.No.30315)的试剂进行ELISA。该试剂如相应的信息页(ref.11728D–FR–2005/05)所述使用，具有如下修改：
[0294] 1.离心管用15μg/ml浓度的捕获抗体3D11D10敏化。
[0295] 2.HBs Ag Ultra cartridge第二个孔的内容物用300μl在 HBs Ag Ultra试剂盒的第二个孔的缓冲液(具有山羊血清和1g/l叠氮化钠的缓冲液)中稀释为1μg/ml的与生物素结合的揭示抗体8C8C5替换。
[0296] 3.将血清、血浆或者粪便样品(100μl)在HBs Ag Ultra cartridge的第二个孔中直接稀释。
[0297] 4.使用 自动化设备和HBs Ag Ultra方案进行ELISA。
[0298] 5.在减去背景噪音之后获得粗略值(crude value)形式的结果(在反应之前读取底物)。
[0299] 检测的体液(血液、血清、血浆、粪便)中存在的肿瘤标记物的浓度通过第2段关于测定LEI所述方法计算。
[0300] 分析患者获得的量示于图8。在该图中，注意到检测的结肠直肠癌患者的2份血清示出血清I-丝束蛋白的量明显增加。
[0301] 10.B组肿瘤标记物的血清测定
[0302] 使用本申请人的 β2-微球蛋白、 CEA、 CA19-9TM和睾酮测定试剂盒根据每个试剂盒的程序分别测定β2-微球蛋白、CEA、CA19-9和睾酮肿瘤标记物。
[0303] 使用E-钙粘蛋白EIA试剂盒(Takara Biochemicals,Tokyo,Japan)根据该试剂盒程序测定E-钙粘蛋白。
[0304] 使用PANCREPAP ELISA试剂盒(DynaBio,Marseille,France)根据该试剂盒程序测定再生胰岛衍生蛋白3α蛋白，其也被称作胰腺炎相关蛋白(PAP1)。
[0305] 使用实施例2中描述的抗体测定半乳凝素-3和LDH蛋白。使用专利EP0434670中描述的抗体测定蛋白酶体20S。为此，使用 自动化设备(bioMérieux)和 HBs Ag Ultra试剂盒(bioMérieux,Cat.No.30315)的试剂进行ELISA测定。该试剂如相应的信息页(ref.11728D–FR–2005/05)所述使用，具有如下修改：
[0306] 1.离心管用5-30μg/ml浓度的捕获抗体敏化。
[0307] 2.HBs Ag Ultra cartridge第二个孔的内容物用300μl在具有山羊血清和1g/l叠氮化钠的缓冲液中稀释为1μg/ml的与生物素结合的揭示抗体替换。
[0308] 3.如果需要，在第二个孔的缓冲液中稀释之后，将血清、血浆或者粪便样品(100μl)在HBs Ag Ultra cartridge的第二个孔中直接稀释。
[0309] 4.使用 自动化设备和HBs Ag Ultra方案进行ELISA。样品与捕获抗体和揭示抗体保温的步骤进行14-100次循环。
[0310] 5.在减去背景噪音之后获得粗略值(crude value)形式的结果(在反应之前读取底物)。
[0311] 检测的体液(血液、血清、血浆、粪便)中存在的肿瘤标记物的浓度通过第2段关于测定LEI所述方法计算。各个肿瘤标记物的测定条件示于表7。
[0312] 表7
[0313]蛋白质 半乳凝素-3 LDH-B 蛋白酶体20S
捕获抗体 12F8A12，15μg/mL 3F11E11，10μg/mL GD6，30μg/mL
揭示抗体 14A5G1 12F10G8 7A11
稀释缓冲液中山羊血清 有 有 无
粪便体积 50μL 50μL 200μL
血清体积 50μL 50μL 100μL
nd nd st
样品沉积 2 孔 2 孔 1 孔
保温时间 100次循环 14次循环 14次循环
捕获抗体 12F8A12，15μg/mL 3F11E11，10μg/mL GD6，30μg/mL
揭示抗体 14A5G1 12F10G8 7A11
稀释缓冲液中山羊血清 有 有 无
粪便体积 50μL 50μL 200μL
血清体积 50μL 50μL 100μL
nd nd st
样品沉积 2 孔 2 孔 1 孔
保温时间 100次循环 14次循环 14次循环
[0314] 分析患者获得的β2-微球蛋白、CEA、CA19-9、睾酮、E-钙粘蛋白、再生胰岛衍生蛋白3α、半乳凝素-3、LDH和蛋白酶体20S肿瘤标记物的量分别示于图9-17。
[0315] 结肠直肠癌患者的3份血清示出血清β2-微球蛋白的量增加。
[0316] 结肠直肠癌患者的10份血清示出血清CEA的量增加。更明显地，III期结肠直肠癌患者的1份血清以及IV期结肠直肠癌患者的7份血清示出血清CEA的量明显增加。
[0317] 结肠直肠癌患者的9份血清示出其血清CA 19-9的量增加。更明显地，III期结肠直肠癌患者的1份血清以及IV期结肠直肠癌患者的7份血清示出血清CA 19-9的量明显增加。
[0318] 结肠直肠癌患者的10份血清示出血清睾酮的量降低。更明显地，II期结肠直肠癌患者的1份血清和III期结肠直肠癌患者的1份血清以及IV期结肠直肠癌患者的2份血清示出血清睾酮的量降低。
[0319] 结肠直肠癌患者的2份血清示出血清再生胰岛衍生蛋白3α的量增加。
[0320] IV期结肠直肠癌患者的4份血清、III期结肠直肠癌患者的2份血清以及II期结肠直肠癌患者的1份血清示出血清半乳凝素-3的量明显增加。
[0321] 实施例4：组合肿瘤标记物的血清测定的应用
[0322] 本申请人在实施例3中揭示了在某些结肠直肠癌患者血流中可以观测到肿瘤标记物的量异常升高或者异常降低。令人惊奇地，在同一患者中未系统地观测两个指定标记物在血液中的量的增加或降低。结果，组合一些肿瘤标记物可以增加经鉴别患有结肠直肠癌的患者数目。因此，A患者也许存在一或多种肿瘤标记物(X组)升高或降低，X组的所述标记物在B患者中也许正常；在这个B患者中，一或多种其它肿瘤标记物(Y组)也许升高或降低，Y组的所述标记物在A患者中也许正常。
[0323] 本申请人测定的各个肿瘤标记物因此可以通过本领域技术人员熟知的各种数学算法组合。例如非限制性地进行如下方法：
[0324] 1.设定每个肿瘤标记物的阈值。
[0325] 2.当结肠直肠癌患者血液中肿瘤标记物的量增加时，将针对指定患者获得的血液中的量除以其阈值。当结肠直肠癌患者血液中肿瘤标记物的量降低时，将针对指定患者获得的血液中的量变成倒数并乘以其阈值。
[0326] 3.当“血液中的量除以阈值”高于1时，将该比率乘以系数，例如10。由此获得的数值称作所研究的患者、考虑的肿瘤标记物的“得分”。
[0327] 4.累加各个肿瘤标记物的得分，将其用特异于每个标记物的因子进行加权。在下文实施例中，所有加权因子均设定为1。
[0328] 5.将得分总和除以累加得分总数，由此获得的数值称作“总得分”。
[0329] 6.当其总得分高于阈值时，诊断该患者患有结肠直肠癌。
[0330] 包含LEI的选择的2、4和8个标记物的总得分在表8中示出。
[0331] LEI与CEA肿瘤标记物的组合因此对于同一组的24个患者可以获得12个结肠直肠癌患者增加的总得分“2”，而单独测定LEI或CEA分别仅示出4个或10个患者的量增加。
[0332] LEI、β2-微球蛋白、氨基酸水解酶1与CEA肿瘤标记物的组合因此对于同一组24个患者可以获得16个结肠直肠癌患者增加的总得分“4”，而单独测定LEI、β2-微球蛋白、酰化氨基酸水解酶1或CEA分别仅示出4、4、4和8个患者的量增加。
[0333] LEI、β2-微球蛋白、酰化氨基酸水解酶1、蛋白酶体20S、L-FABP、PAP、E-钙粘蛋白和CEA肿瘤标记物的组合因此对于同一组24个患者可以获得19个患者增加的总得分“8”，而单独测定LEI、β2-微球蛋白、酰化氨基酸水解酶-1、蛋白酶体20S、L-FABP、PAP、E-钙粘蛋白或CEA分别仅示出4、4、4、8、6、2、2和10个患者的量增加。
[0334] 表8
[0335]
[0336]
[0337]
[0338] a:LEI与CEA的组合
[0339] b:LEI、β2-微球蛋白、酰化氨基酸水解酶1和CEA的组合
[0340] c:LEI、β2-微球蛋白、酰化氨基酸水解酶1、蛋白酶体20S、L-FABP、PAP、E-钙粘蛋白和CEA的组合
[0341] 实施例5：粪便肿瘤标记物测定
[0342] 提取重约1g的粪便，加入含有1g/L叠氮化物的10ml的100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)。将该混合物旋动均质1分钟。然后将样品在冰上进行4次7秒超声处理。通过以2000g在
4℃离心10分钟除去不溶的级分。将上清在–30℃贮存直至进行测定。
4℃离心10分钟除去不溶的级分。将上清在–30℃贮存直至进行测定。
[0343] 如果需要，在HBs Ag Ultra cartridge的第一个孔的缓冲液中适当稀释粪便之后，使用实施例3所述的ELISA在粪便中查找肿瘤标记物。
[0344] 使用该检验测定酰化氨基酸水解酶1、半乳凝素-3和蛋白酶体20S的结果分别示于图18-20。在结肠直肠癌患者的10、14和8份粪便中分别观测到酰化氨基酸水解酶1、半乳凝素-3和蛋白酶体20S的量增加。
[0345] 实施例6：通过ELISPOT技术检测肿瘤标记物
[0346] 1.细胞培养
[0347] 将LnCAP前列腺癌细胞系在RPMI 1640培养基中培养，该培养基中补加了2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠和10％FCS(均来自Gibco)。该细胞用作阴性对照。
[0348] 将Caco-2结肠直肠癌细胞系在含有2mM L-谷氨酰胺而无FCS(均来自Gibco)的DMEM培养基中培养。
[0349] 将HT-29结肠直肠癌细胞系在含有2mM L-谷氨酰胺和10％FCS(均来自Gibco)的MEM培养基中培养。
[0350] 将HT-29/B6结肠直肠癌细胞系在含有4mM L-谷氨酰胺而无FCS(均来自Gibco)的培养基中培养。
[0351] 将细胞维持在37℃的具有5％CO2保温仪中。
[0352] 2.ELISPOT技术
[0353] 这种方法可以确定分泌蛋白质的细胞数目。将带有PVDF膜(Multiscreen IP,Millipore)的96-孔ELISPOT平板用在无菌PBS中的10μg/ml小鼠抗肿瘤标记物单克隆抗体(捕获抗体，见下表9，该表示出了用于ELISPOT中的抗体)在+4℃包被过夜，100μl/孔。然后将该平板用PBS洗涤，并用含有10％FCS的培养基饱和。平行地，对细胞进行胰蛋白酶消化、计数，然后稀释为105个细胞/ml。每个孔分配200μl这种细胞悬浮液，这一原液的连续稀释液也是如此。然后将该平板在37℃在5％CO2湿润环境中保温20小时，随后用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤。剩余的细胞通过用冰水处理10分钟裂解，再次洗涤平板。然后加入0.1μg/孔揭示抗体-即待测肿瘤标记物的生物素酰化的单克隆抗体(表9)(在室温保温2小时)。通过加入Extravidin-碱性磷酸酶(Sigma)和底物5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/硝基蓝四唑(BCIP/NBT，Biorad)揭示斑点。背景噪音相应于在LnCap孔中测量的斑点数目，在所用读取条件下在0-8之间变化。从特异性信号中减去非特异性斑点的平均数。
[0354] 表9
[0355]
[0356] 3.结果
[0357] 每一百万个保温的细胞中分泌肿瘤标记物的Caco-2、HT-29和HT-29/B6细胞的数目示于图21。ELISPOT技术可以证实所述肿瘤标记物由结肠癌细胞系释放或分泌。可以使用这个技术查找患者体内循环肿瘤细胞，根据本申请人申请的专利申请WO 03/076942所述方法进行。
[0358] 实施例7：使用结肠组织经免疫组织化学方法检测肿瘤标记物
[0359] 1.方法学
[0360] 首先，对组织微阵列载玻片脱石蜡。为此，将其在如下浴中相继保温10分钟：甲基环己烷(两次)、100％乙醇、95％乙醇、70％乙醇和水。然后将该玻片用含有0.1％Tween 20的TBS(TBS-T)搅拌漂洗10分钟。抗原在10mM柠檬酸盐缓冲液pH 6中通过加热至90℃ 40分钟、然后冷却至室温30分钟再活化。内源性过氧化物酶通过在含有3％H2O2的TBS-T中保温5分钟而被抑制。然后将该玻片用在TBS-T中3％BSA在37℃在湿化箱中饱和1小时。
[0361] 随后将该玻片与在含有3％BSA的TBS-T中稀释为10μg/ml的如下一级抗体一起保温2小时(在37℃在湿化箱中保温)：抗-白细胞弹性蛋白酶抑制剂(克隆3D9C2)、抗-埃兹蛋白(克隆5G2D12)、抗-酰化氨基酸水解酶1(克隆8A8A10)或者抗-I-丝束蛋白(克隆8D6A3)。在进行3次在TBS-T中洗涤10分钟后，将该玻片与在饱和溶液中稀释为1/400的辣根过氧化物酶结合的抗小鼠二级抗体(Cat.No.115-035-003Jackson Immunoresearch)一起在37℃在湿化箱中保温2小时。对该玻片进行3次在TBS-T中洗涤10分钟，然后进行3次在PBS中洗涤
10分钟。使用Sigma Fast底物(Cat.No.D-4168,Sigma-Aldrich)使玻片显色5分钟。通过在PBS中洗涤终止染色。使用Harris苏木精(Cat.No.MHS16,Sigma-Aldrich)复染30秒。在用水和用PBS洗涤后，将玻片置于显微镜下观察。
10分钟。使用Sigma Fast底物(Cat.No.D-4168,Sigma-Aldrich)使玻片显色5分钟。通过在PBS中洗涤终止染色。使用Harris苏木精(Cat.No.MHS16,Sigma-Aldrich)复染30秒。在用水和用PBS洗涤后，将玻片置于显微镜下观察。
[0362] 根据这项应用特异性选择用于免疫组织化学标记的抗体，不依赖于其在ELISA或者在Western印迹中的反应性。
[0363] 2.白细胞弹性蛋白酶抑制剂的免疫组织化学检测
[0364] 组织微阵列载玻片用于筛选大量样品。这些样品是点于玻片上的结肠组织。患者的特性(结肠直肠癌组织微阵列上存在的结肠组织斑点的特性)以及用抗-白细胞弹性蛋白酶抑制剂抗体免疫标记的结果示于表10。
[0365] 表10
[0366]
[0367] 该表中结果证实在健康结肠粘膜活检组织中，无标记(10个阴性结果)。该标记在腺瘤中也是阴性的(1/1)。该标记在结肠腺癌的上皮细胞中是阳性的(8/11患者阳性)。在基质中无标记。
[0368] 3.埃兹蛋白的免疫组织化学检测
[0369] 组织微阵列载玻片用于筛选大量样品。这些样品是点滴于玻片上的结肠组织。对于每个结肠腺癌患者，在肿瘤中心取3份样品，在侵润前沿取3份样品以及在健康组织取3份样品。表11示出了用抗-埃兹蛋白抗体免疫标记的结果；示出的标记水平是在分析的3份样品的最大强度。
[0370] 表11
[0371]
[0372] 在30个患者中，25个患者呈现出与相邻健康组织相比在肿瘤(肿瘤中心或侵润前沿)中埃兹蛋白过表达。
[0373] 4.酰化氨基酸水解酶1的免疫组织化学检测
[0374] 组织微阵列载玻片用于筛选大量样品。这些样品是点滴于玻片上的结肠组织。对于每个结肠腺癌患者，在肿瘤中心取3份样品，在侵润前沿取3份样品以及在健康组织取3份样品。表12示出了用抗-酰化氨基酸水解酶抗体免疫标记的结果；示出的标记水平是在分析的3份样品的最大强度。
[0375] 表12
[0376]
[0377] 在30个患者的样品中，21个患者呈现出与相邻健康组织相比在肿瘤(肿瘤中心或者侵润前沿)中酰化氨基酸水解酶过表达。
[0378] 5.I-丝束蛋白的免疫组织化学检测
[0379] 组织微阵列载玻片用于筛选大量样品。这些样品是点于玻片上的结肠和直肠组织。患者的特性(结肠直肠癌组织微阵列上存在的结肠组织斑点的特性)以及用抗-I-丝束蛋白抗体免疫标记的结果示于表13。
[0380] 表13
[0381]
[0382]
[0383] 表中结果证实：
[0384] -在健康结肠粘膜活检组织中，该标记在8个样品中较弱(+)，在2个样品中是++。该标记在结肠腺瘤样品(1/1)中也较弱(+)。该标记在结肠腺癌上皮细胞中是强阳性++(6/9患者++，3个患者较弱+，包括结肠粘液性腺癌)。在基质中无标记；
[0385] -在健康直肠粘膜活检组织中，该标记以非特异性方式存在于表面上皮(3/4)，在1个样品中是++水平。该标记在直肠腺瘤中是强阳性++(5/9)或者谨慎+(4/9)。该标记在直肠腺癌的上皮细胞中也是强阳性++(3/4患者是++，1个患者较弱+)。在基质中无标记。
[0386] 实施例8：通过LC-MRM-MS技术检测肿瘤标记物
[0387] 1.方法学
[0388] 为了使检测限度降低至几个ng/ml，使用一种改良的MRM-MS方法。这个方法的连续步骤是：1)高丰度蛋白质的免疫耗竭，2)胰蛋白酶消化，3)对所述肽进行SPE(固相提取)分级分离，4)与MRM-MS结合的液相层析(LC)。
[0389] 通过向对照血清集合中加入10-250ng/ml浓度的ACY、埃兹蛋白、L-FABP、PDI或者I-丝束蛋白重组蛋白对添加样品(spike sample)进行设置。载脂蛋白A1和A2天然存在于血清中。
[0390] 免疫耗竭.血清中高丰度蛋白质的耗竭通过使用来自Vivascience的商业Vivapure抗-HSA试剂盒进行。或者，也可以使用来自Calbiochem的Proteoextract Albumin/IgG试剂盒以及来自Bio-Rad的AurumTM Serum Protein Minikit。也可以在实验室中产生特异性树脂，通过将待耗竭的蛋白质的单克隆抗体与CNBr-活化的Sepharose 4B树脂(Amersham Bioscience)根据厂商指导结合。
[0391] 酶消化.将耗竭的血清样品在用10mM Tris(pH 8)缓冲的、且含有30mM二硫苏糖醇的6M尿素溶液中在40℃去饱和40分钟，然后用50mM碘代乙酰胺在室温避光烷化40分钟。将其在水中稀释6倍，然后在37℃用胰蛋白酶消化过夜，所用酶/底物比率为1:30(Promega)。通过加入终浓度为0.5％甲酸终止消化。使用Oasis HLB 3cc逆向cartridges(60mg)(Waters)通过固相提取(SPE)对消化的样品去盐化(desalified)。在应用样品后，将该cartridges用1ml的0.1％甲酸洗涤，然后用含有0.1％甲酸的甲醇/水混合物(80/20v/v)进行洗脱。洗脱物在真空下干燥。
[0392] SPE分级分离.将干燥的样品置于1ml乙酸盐缓冲液中，并且加样于在乙酸盐缓冲液和甲醇中预先平衡的Oasis MCX(混合的阳离子交换)60mg混合柱(疏水性和阳离子交换)(Waters)中。将该柱用1ml乙酸盐缓冲液和1ml甲醇洗涤。用1ml甲醇/乙酸盐缓冲液混合物(50/50v/v)洗脱感兴趣的肽(表14)。根据感兴趣的肽的等电点选择乙酸盐缓冲液的pH。洗脱物在真空下干燥，并且溶解于含有0.1％甲酸的200μl乙腈/水(3/97v/v)溶液中。将50μl等份注射进与MS-MS系统结合的LC中。
[0393] 液相层析和质谱分析.在HP 1100系列高压层析系统(HPLC)上进行LC-MS分析，该系统具有一个双向泵和注射器(Agilent Technologies)，并且结合了质谱分析仪以增加灵敏性，即Sciex API 2000triple quadripole或者Sciex API 4000Qtrap(hybrid triple quadripole-ion trap MS)(MDS Sciex)。在C18Symmetry柱(Waters)上进行LC分离，洗脱流速为300μl/分钟(洗脱液A＝在水中0.1％甲酸，洗脱液B＝在乙腈中0.1％甲酸，5％B至50％B线性梯度25分钟，然后50％B至100％B线性梯度3分钟)。以阳性离子化模式在5500V电压进行MS分析，以针式电压(needle voltage)施加，使得来源离子化。使用Analyst 1.4.1软件进行设备核查和数据获得。雾化气体(空气)和气帘气体(curtain gas)(氮气)流速分别为30和20psi。Turbo VTM离子源调节为400℃，辅助氮气流为40psi。对每种肽记录的MRM跃迁(transitions)示于表14。对于每个选择的MRM跃迁优化碰撞能量(CE)、去簇电压(DP)和碰撞室出口电压(CXP)。
[0394] 2.结果
[0395] 对于每种肿瘤标记物(表14列出的蛋白质)，使用MIDAS(MRM-起始的检测和测序)软件产生理论MRM跃迁列表。这个表包含质量范围在800to3000Da的理论上胰蛋白酶消化的肽的所有双极或三极亲代离子以及y或b型的所有可能的片段离子。对于每种蛋白质，检测每个可能的跃迁以确定最灵敏和最特异性的跃迁。这种选择的结果示于表14。使用AQUA型(Sigma)的重链肽或者作为测定标准的重链重组蛋白质，可以绝对方式量化复合的生物学介质中感兴趣的肿瘤标记物。
[0396] 表14
[0397]
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